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晏矿潘
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1 第 31 卷第 3 期大连海洋大学学报 Vol. 31 No 年 6 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY June DOI: / j. cnki. dlhyxb 文章编号 : (2016) 个地理种群大银鱼 CO 玉基因序列变异与遗传分化 1 赵琳 2, 张敏莹 1, 徐东坡 1, 周彦锋 1, 方弟安 1, 段金荣 1 1, 刘凯 (1 郾中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部长江下游渔业资源环境科学观测实验站, 江苏无锡 ; 2 郾南京农业大学渔业学院, 江苏无锡 ) 摘要 : 为探究大银鱼 Protosalanx hyalocranius 不同地理种群的遗传变异情况, 采用 PCR 产物纯化测序方法, 测定了太湖洪泽湖两个种群共 96 尾大银鱼线粒体细胞色素 C 氧化酶玉亚基 ( cytochrome oxidase 玉, CO 玉 ) 基因的部分序列结果表明 : 在 638 bp 序列中共检测到 6 个变异位点, 占核苷酸总数的 0 郾 94% ; A G T C 平均含量依次为 26 郾 2% 34 郾 0% 21 郾 3% 和 18 郾 5%, A + T 含量 ( 47 郾 5% ) 低于 G + C 含量 (52 郾 5% ); 共发现 7 种单倍型, 其中 hap1 hap5 和 hap7 为共享单倍型, hap6 为洪泽湖种群特有, hap2 hap3 和 hap4 为太湖种群特有, 在 7 种单倍型中, hap1 为明显的优势单倍体型, 共 54 个个体 ( 占总个体数的 56 郾 25% ); 平均单倍型多样性 ( Hd) 和核苷酸多样性 ( Pi) 分别为 0 郾 642 和 0 郾 , 遗传多样性较低 ; AMOVA 分析显示, 种群内遗传变异为 79 郾 82%, 种群间变异为 20 郾 18%, 两种群间遗传分化系数 ( Fst) 为 0 郾 , 表明两种群间遗传分化程度较高本研究结果可为合理开发和利用大银鱼野生资源提供参考关键词 : 大银鱼 ; 地理种群 ; 线粒体细胞色素 C 氧化酶玉亚基 (CO 玉 ); 遗传分化中图分类号 : Q346; S917 摇摇摇摇文献标志码 : A 摇摇大银鱼 Protosalanx hyalocranius 隶属于硬骨鱼纲 Osteicthyes 胡瓜鱼目 Osmeriformes 银鱼科 Salangidae 大银鱼亚科 Protosalanginae 大银鱼属 Protosalanx Regan [1], 主要分布于东海黄海渤海海域和长江淮河中下游河道及湖泊水库, 是中国银鱼科中分布广泛产量与经济价值均较高的鱼类大银鱼是太湖洪泽湖的传统名特产之一, 也是江苏省出口创汇的重要水产品目前, 关于大银鱼的研究主要集中在生物学特性 [2] 移植增殖 [3] [4] 种群生态等方面, 而在分子生物学方面的研究较少 [5-8] 相较于核基因, 线粒体基因具有单一的母性遗传模式无内含子且重组现象发生概率低, 更适合作为 DNA 条形码标记 [9] 由于线粒体细胞色素 C 氧化酶玉亚基 (CO 玉 ) 基因的序列进化速率较快, 密码子的保守性高而且引物的通用性强 [10], 常被认为其可以如实反映物种之间的真实进化关系, 因此, 有学者提出可以利用这一特定基因来做动物 DNA 条形编码, 并且已确立其在动物物种识别中的作用 [11] [12] 基于 CO 玉基因分析, Ward 等有效 [13] 地区分了澳大利亚 207 种海洋鱼类, Schlei 等对鲑科鱼类一个亚科的 3 个属进行了鉴定, 王中铎 [14] [15] 等鉴别了南海 40 种硬骨鱼类郭立等研究中所涉及的太湖新银鱼 CO 玉基因多样性分析为本研究提供了重要启示本研究中, 测定了中国大银鱼 2 个地理种群的 CO 玉基因序列, 分析其遗传多样性和遗传结构, 以期为保护和开发利用大银鱼种质资源提供理论依据 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料试验用太湖大银鱼采集于 2014 年 5 月 21 日, 共 247 尾, 体长为 32 ~ 71 mm, 体质量为 0 郾 1 ~ 0 郾 7 g; 试验用洪泽湖大银鱼采集于 2014 年 5 月 23 日, 共 231 尾, 体长为 31 ~ 72 mm, 体质量为 0 郾 1 ~ 0 郾 7 g 采样网具为银鱼拖网 ( 俗称飞机网 ) 样品采集后立即保存于 95% 乙醇中, 带回实验室备用 1 郾 2 摇方法 1 郾 2 郾 1 摇 DNA 提取摇参照文献 [16] 的方法并略作修改, 具体如下取 0 郾 1 g 大银鱼背部肌肉, 剪碎放入 1 郾 5 ml 摇收稿日期 : 摇基金项目 : 国家科技基础条件平台建设运行项目 (2015DKA ); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 (2013JBFM07) 摇作者简介 : 赵琳 (1993 ), 女, 硕士研究生 @ qq 郾 com 摇通信作者 : 张敏莹 (1974 ), 女, 副研究员 zhangmy@ ffrc 郾 cn

286 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 Eppendorf 管中, 向组织样中加入裂解液 (440 滋 L STE, 15 滋 L 10 mg / ml PK, 50 滋 L 10% SDS), 56 益下消化过夜 ; 再加入与裂解液等体积的用 Tris 平衡的苯酚 ( ph 8 郾 0), 轻摇 30 min 后, 以 12 000 r / min 离心 10 min,

2 286 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 Eppendorf 管中, 向组织样中加入裂解液 (440 滋 L STE, 15 滋 L 10 mg / ml PK, 50 滋 L 10% SDS), 56 益下消化过夜 ; 再加入与裂解液等体积的用 Tris 平衡的苯酚 ( ph 8 郾 0), 轻摇 30 min 后, 以 r / min 离心 10 min, 取上清液移至新的 1 郾 5 ml 离心管中 ; 重复上述步骤, 此次轻摇混匀时间为 10 min; 加入与上清液等体积的苯酚和氯仿 / 异戊醇 (24 颐 1), 轻摇 10 min 后, 以 r / min 离心 10 min, 取上清液转移至新的 1 郾 5 ml 离心管中 ; 加入与上清液等体积的氯仿 / 异戊醇 (24 颐 1), 轻摇混匀 30 min 后, 以 r / min 离心 10 min, 取上清液转移至新的 1 郾 5 ml 离心管中 ; 加入两倍上清液体积的冰乙醇进行沉淀将上述加入冰乙醇的上清液置于冰箱中冷冻 1 h 后, 以 r / min 离心 15 min, 弃上清液, 留沉淀用 70% 酒精清洗沉淀 1 ~ 2 次, 将离心管倒置, 自然晾干, 向离心管中加入 150 滋 L ddh 2 O ( 或 TE) 溶解, 置于冰箱 (4 益 ) 中保存备用 1 郾 2 郾 2 摇 PCR 扩增与测序摇 PCR 扩增引物设计方法参照文献 [17], 其序列为 COI-F: 5 忆 TGTAAAACGACGGCCAGT 3 忆, COI-R: 5 忆 CAGGAAACAGCTATGACAC 3 忆引物由上海铂尚生物技术有限公司合成试验所用试剂购自大连宝生物科技有限公司 PCR 反应体系 ( 共 20 滋 L): Premix Taq ( TaKaRa TaqTM Ver 鄄 sion 2 郾 0 plus dye ) 10 滋 L, 正反向引物 ( 20 mmol / L) 各 l 滋 L, DNA 模板 (20 ng / 滋 L) 2 滋 L, 用 ddh 2 O 补足至 20 滋 L 用 ABIVeriti 96 well 梯度 PCR 仪扩增反应程序 : 94 益下预变性 3 min; 94 益下变性 45 s, 55 益下退火 45 s, 72 益下延伸 1 min, 共进行 35 个循环 ; 最后于 72 益下再延伸 8 min 扩增产物用 12 g / L 的琼脂糖凝胶电泳检测, 相对分子质量标准为 100 bp DNA Ladder Marker PCR 产物回收纯化送至上海铂尚生物有限公司测序, 测序引物与扩增引物相同共测序 96 尾大银鱼样品, 其中太湖种群 49 尾, 洪泽湖种群 47 尾 1 郾 3 摇数据处理将测定的序列用 ClustalX 1 郾 81 软件进行对位排列并辅以人工校对, 在 NCBI 中经 BLAST 比对 ; 用 MEGA 3 郾 1 软件计算不同序列的碱基组成变异位点简约信息位点转换与颠换比值 ( si / sv) [18] 用 DNASP 5 郾 10 软件包计算群体的单倍型数 (NH) 单倍型多样性 ( Hd) 核苷酸多态性 (Pi) 平均核苷酸差异数 ( K) [19] 利用 Arlequin 软件中的分子变异分析估算遗传变异在群体内和群体间的分布, 以及地理种群分化水平 (Fst) [20] 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇大银鱼群体 CO 玉基因序列的多样性大银鱼样本经 PCR 扩增后得到清晰的 CO 玉电泳条带, 长度约 650 bp ( 图 1) 图 1 摇大银鱼 mtdna CO 玉基因 PCR 扩增电泳图 ( 最右边通道为 100 bp DNA Ladder Marker) Fig 郾 1 摇 PCR amplification electrophoresis of mtdna CO 玉 gene of ice fish Protosalanx hyalocranius ( The rightmost lane is 100 bp DNA Ladder Marker) 测序得到的序列经人工校对和比对去除两端不确定的序列后, 获得 638 bp 的序列片段, 经 BLAST 同源性分析, 与大银鱼线粒体 DNA 全序列 (No 郾 gb JN 郾 1 ) 中 CO 玉序列的一致性高达 99%, 确认所测序列为大银鱼 CO 玉序列的 5 忆端部分 638 bp 序列中, 碱基 A G T C 的平均含量依次为 26 郾 2% ( 26 郾 0% ~ 26 郾 5% ) 34 郾 0% (33 郾 7% ~ 34 郾 2% ) 21 郾 3% ( 21 郾 2% ~ 21 郾 6% ) 和 18 郾 5% ( 18 郾 3% ~ 18 郾 7% ), A + T 含量 (47 郾 5% ) 低于 G+C 含量 (52 郾 5% ), 符合硬骨鱼类碱基组成特征 [21] 所有样本 638 bp 序列中, 共检测到 6 个变异位点 (variable sites), 分别位于第和 557 位点上 ( 表 1) 其中第 248 位为转换位点 ( transitional paris), 其余 5 个为颠换位点 (transversional pairs) 太湖种群出现 6 个变异位点, 其中 4 个为简约信息位点 ; 洪泽湖种群出现 3 个变异位点, 均为简约信息位点总变异位点占核苷酸总数的 0 郾 94%, 且全部发生在三联密码子的第 3 个碱基上, 而密码子的前 2 个碱基上无变异, 符合线粒体蛋白质编码基因密码子第 3 位点进化速度最快第 2 位点最保守的一般规律 [22] 序列中没有插入或缺失的变异位点, 转换位点个数和颠换位点个数的比值 ( si / sv) 为 5, 大于 Li [23] 所提出的期望值 0 郾 5, 表明此片段没有饱和, 适合进行遗传变异分析

3 第 3 期赵琳, 等 : 2 个地理种群大银鱼 CO 玉基因序列变异与遗传分化郾 2 摇单倍型分析 96 尾大银鱼样本共检出 7 种单倍型 ( 表 1) 从单倍型分布 ( 表 2) 情况分析, 太湖种群出现 6 种单倍型, 洪泽湖种群出现 4 种单倍型其中 hap1 为明显的优势单倍体型, 共 54 个样本, 占样本总数的 56 郾 25% 2 个群体的共享单倍型有 3 种, 分别为 hap1 hap5 和 hap7, 占样本总数的 77 郾 08% 除 3 种共享单倍型外, hap2 hap3 和 hap4 为太湖种群特有, 占样本总数的 9 郾 38% ; hap6 为洪泽湖种群特有, 占样本总数的 13 郾 54% 2 郾 3 摇种群的遗传多样性及中性检验遗传多样性是指生物种内和种间的遗传变异度 [24] 遗传多样性通常采用单倍型多样性 ( Hd) 与核苷酸多样性 ( Pi) 来度量 [25], Hd 和 Pi 值越大, 表明种群的遗传多样性越丰富平均核苷酸差异数 ( K) 代表了每个群体内两个随机选取的 mtdna 序列间平均每个位点的核苷酸数目 [26] 2 Tab 郾 2 摇表 2 摇个种群大银鱼的遗传多样性及中性检验结果表明 : 太湖种群 Hd 略低于洪泽湖种群, 2 个种群的 Pi 均很低 ; 太湖种群的 K = 0 郾 , 洪泽湖种群的 K = 1 郾 ; 太湖种群的 D 值为负值表 1 摇 Tab 郾 1 摇单倍型 haplotype 大银鱼两群体 mtdna CO 玉基因多态位点及单倍型 Polymorphic loci and haplotypes on mtdna CO 玉 gene of two populations of ice fish Protosalanx hya 鄄 locranius CO 玉基因多态位点 polymorphic locus of CO 玉 hap1 A T A C C A hap2 T hap3 C hap4 G hap5 G hap6 T T hap7 T 注 : 表示碱基相同 Note: indicates the same base 大银鱼两群体线粒体 CO 玉基因单倍型分布 Distribution of seven haplotypes on mtdna CO 玉 gene in two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius 种群 population 单倍型及个体分布数 ( 占样本总数的比例 / % ) number and distribution of haplotype ( percent of total individual) hap1 hap2 hap3 hap4 hap5 hap6 hap7 太湖 Taihu Lake 洪泽湖 Hongzehu Lake 单倍型数 number of haplotype 总计 total 54(56 郾 25) 1(1 郾 04) 2(2 郾 08) 6(6 郾 25) 6(6 郾 25) 13(13 郾 54) 14(14 郾 58) 7(7 郾 29) Tab 郾 3 摇表 3 摇大银鱼两群体内的遗传多样性及 Tajima 蒺 s D 检验 Genetic diversity index and Tajima 蒺 s D tests of two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius 种群 population 样本数 / 尾 individual 单倍型数 NH 多态位点数 S 单倍型多样性 Hd 核苷酸多样性 Pi Tajima 蒺 s D 核苷酸差异数 K 太湖 Taihu Lake 郾郾郾郾洪泽湖 Hongzehu Lake 郾郾郾郾总体 total 郾郾郾郾郾 4 摇种群 AMOVA 分析将 2 个大银鱼种群归为一个组进行 AMOVA 分析 ( 表 4), 结果显示, 种群内的遗传变异系数为 79 郾 82%, 种群间的遗传变异系数为 20 郾 18%, 种群间遗传分化系数为 0 郾 , 两群体间遗传差异极显著 (P<0 郾 01) 3 摇讨论 3 郾 1 摇 CO 玉基因的应用目前, DNA 条形编码 (DNA barcodes) 已成表 4 摇大银鱼两群体 mtdna CO 玉基因序列 AMOVA 分析 Tab 郾 4 摇 Analysis of molecular variance ( AMOVA ) on mtdna CO 玉 gene of two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius 差异来源自由度 source of df variance 方差平方和 SS 占总变异比例 / % 方差 percent of 均方 total variance MS F 值 F value 种群间 1 5 郾郾 18 5 郾郾 129 ** 种群内郾郾 82 0 郾 419 总计郾 844 Note: 6 郾 85<F 0 郾 01 (1, 94) <7 郾 08

4 288 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷为一种有效的生物鉴定手段, 它将完成一些传统形态学鉴定手段无法完成的工作 [27] CO 玉基因中部分片段能够用作条形码, 这是因为 CO 玉在能保证足够变异的同时, 又很容易被通用引物扩增, 且目前研究表明, 其 DNA 序列本身很少存在插入和缺失 ( 即使存在也主要分布于该基因的 3 忆端 ), 对结果的分析不会造成很大的影响 [28] 同时, CO 玉基因还拥有蛋白编码基因所共有的特征, 即密码子第 3 位碱基不受自然选择压力的影响, 可以自由变异这是因为在蛋白编码基因里, 由于密码子的简并性, 其第 3 位碱基通常均不受自然选择作用, 而是自由变化的 [27] 本研究中的变异位点全部发生在三联密码子的第 3 个碱基上, 而密码子的前 2 个碱基上没有变异, 符合上述规律, 也证明了 CO 玉基因用作遗传分析的可行性 3 郾 2 摇大银鱼单倍型多样性和核苷酸多样性 [29] Bowen 等提出了一个判断种群是否发生扩张的简单方式, 即利用单倍型多样性与核苷酸多样性来估计种群的进化历史, 他认为单倍型多样性较高而核苷酸多样性较低 ( Hd>0 郾 5, Pi<5% ) 是因为瓶颈效应后种群数量迅速扩张造成的单倍型多样性较高而核苷酸多样性较低的情况在洄游鱼类及部分海水生物中很常见, 如刀鲚 ( Hd = 0 郾 999 3, Pi = 0 郾 ) 西大西洋斑点鱿 ( Hd = 0 郾 79 ~ 0 郾 98, Pi = 0 郾 ~ 0 郾 006 8) [28], 在青海湖裸鲤鱇浪白鱼等淡水鱼类中也存在这种情况 [30-31] 本研究中, 大银鱼种群的 Hd 为 0 郾 642, 而其 Pi 仅为 0 郾 , 可能是由于积累核苷酸多样性所需要的时间比积累单倍型多样性漫长许多, 这说明本研究中的大银鱼种群是从一个有效种群数量较小的群体, 经快速扩张而来 3 郾 3 摇大银鱼种群的中性检验遗传分化应用 Tajima 蒺 s D 值中性检验推测种群曾经历的历史时, 如果该值为负值, 且在统计学上达到显著标准, 则说明序列中含有比中性进化模型更多的核苷酸位点变化, 可能预示着被研究种群曾经经历过一个扩张的历史 [32] 本研究中, 太湖种群 Tajima 蒺 s D 值为负值 ( 表 3), 表明太湖种群可能曾经经历过种群扩张若将两种群看作一个整体, 则 D 值仍为负值, 说明大银鱼在历史上发生过扩张, 而研究样本数量较小, 则有可能是造成各群体在单独进行中性检验时不显著 (P>0 郾 05) 的原因遗传分化系数是反映各亚群间遗传分化的重要指标由种群 AMOVA 分析可知, 太湖与洪泽湖之间的 Fst 值为 0 郾 , 表明两种群间存在极显著分化另外, 2 个群体间的 7 种单倍型中, 有 3 种属于共享单倍型, 分别为 hap1 hap5 和 hap7, 说明这 3 种单倍型很可能是一种较为稳定能够适应环境变化的原始单倍型类型本研究结果初步揭示了大银鱼种群经历过快速扩张, 太湖种群和洪泽湖种群大银鱼可能因地理隔离产生了明显的遗传分化参考文献 : [1] 摇倪勇, 朱成德. 太湖鱼类志 [ M]. 上海 : 上海科学技术出版社, 2005: [2] 摇林长虹. 大银鱼生物学特性及移植技术 [ J]. 水利渔业,1993 (5): [3] 摇戈志强, 沈其璋, 喻叔英. 大银鱼移植增殖放流技术的探讨 [J]. 淡水渔业,1999,29(1): [4] 摇薛以平, 吴建广. 水库大银鱼种群生态演变规律及增殖利用初探 [J]. 淡水渔业,2004,34(3): [5] 摇高天翔, 陈省平, 韩志强, 等. 大银鱼和小齿日本银鱼线粒体细胞色素 b 和 16S rrna 基因部分序列分析 [ J]. 中国海洋大学学报,2004,34(5): [6] 摇夏德全, 曹萤, 吴婷婷, 等. 用 RAPD 方法分析太湖大银鱼太湖新银鱼和寡齿新银鱼的亲缘关系 [ J]. 中国水产科学,2000, 7(1): [7] 摇张颖, 董仕, 王茜, 等. 大银鱼和太湖新银鱼同工酶遗传组成的研究 [J]. 大连水产学院学报,2005,20(2): [8] 摇夏德全, 曹萤, 吴婷婷, 等. 太湖中大银鱼太湖新银鱼和寡齿新银鱼群体的遗传结构 [J]. 水产学报,1999,23(3): [9] 摇 Saccone C,De Giorgi C,Gissi C,et al. Evolutionary genomics in metazoa:the mitochondrial DNA as a model system [ J]. Gene, 1999,238(1): [10] 摇 Hebert P D N,Ratnasingham S,de Waard J R. Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely re 鄄 lated species[ J]. Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences,2003,270( S):S96-S99. [11] 摇杨帆, 何利军, 雷光春, 等. 中国东南沿海弹涂鱼科常见鱼类的遗传多样性和 DNA 条形码 [J]. 生态学杂志,2012,31(3): [12] 摇 Ward R D,Zemlak T S,Innes B H,et al. DNA barcoding Australia 蒺 s fish species[ J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Sciences,2005,360: [13] 摇 Schlei O L,Cr 俸 te-lafreni 侉 re A,Whiteley A R,et al. DNA bar 鄄 coding of eight North American coregonine species[ J]. Molecular Ecology Resources,2008,8(6): [14] 摇王中铎, 郭昱嵩, 陈荣玲, 等. 南海常见硬骨鱼类 CO 玉条码序列 [J]. 海洋与湖沼,2009,40(5): [15] 摇郭立, 李隽, 王忠锁, 等. 基于四个线粒体基因片段的银鱼科鱼类系统发育 [J]. 水生生物学报,2011,35(3): [16] 摇萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南 [ M]. 3 版. 黄培堂, 译. 北京 : 科学出版社,2002:

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48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [

48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [ 5 6 2 00 9 1 2 South China Fisheries Science Vol. 5, No. 6 Dec., 2009 doi: 10. 3969/ j. issn. 1673-2227. 2009. 06. 009 16S rrna,,, (, 510300) : PCR ( Pinctada fucata) ( P. chemnitzi) ( Pteria penguin)