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歌拳燕
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1 微生物学通报 Microbiology China Apr. 0, 013, 40(4): by Institute of Microbiology, CAS 研究报告枯草芽孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的响应面优化唐艳斌 1 闫巧娟江正强 1* 杨绍青 1 杜雪丹 (1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京 ) (. 中国农业大学工学院北京 ) 摘要 : 目的采用响应面法(RSM) 优化枯草芽孢杆菌 5 L 发酵罐产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的发酵条件方法利用 Box-Behnken 设计和方差分析结果获得最佳发酵条件为 : 转速通气量和培养基 ph 分别为 500 r/min 1.05 vvm 和 5.08, 发酵时间仅为 h 产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶活力达 94.4 U/mL 结论实验结果表明响应面法优化 5 L 发酵罐发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的条件合理可行关键词 : 发酵, β-1,3-1,4- 葡聚糖酶, 响应面优化, 枯草芽孢杆菌 Optimization of fermentation conditions for β-1,3-1,4-glucanase production by the thermophilic Bacillus subtilis D-6 using the response surface methodology TANG Yan-Bin 1 YAN Qiao-Juan JIANG Zheng-Qiang 1* YANG Shao-Qing 1 DU Xue-Dan (1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing , China) (. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing , China) Abstract: [Objective] [Methods] The fermentation parameters on the β-1,3-1,4-glucanase production by Bacillus subtilis D-6 in a batch fermentor (5 L) were optimized by statistical 基金项目 : 国家 863 计划项目 (No. 011AA100905); 国家自然科学基金项目 (No ) * 通讯作者 :Tel: ; : zhqjiang@cau.edu.cn 收稿日期 :01-05-; 接受日期 :

2 55 微生物学通报 Microbiol. China 013, Vol.40, No.4 analysis using response surface methodology (RSM) based on Box-Behnken design (BBD) analysis of variance (ANOVA). [Results] The results showed that under the optimized conditions, with agitation, aeration, and ph at 500 r/min, 1.05 vvm and 5.08, respectively, the highest β-1,3-1,4-glucanase activity of 94.4 U/mL was obtained after h of cultivation. [Conclusion] This study proved that RSM could efficiently be applied for modeling of β-1,3-1,4-glucanase production in submerged fermentation. Keywords: Fermentation, β-1,3-1,4-glucanase, Response surface methodology, Bacillus subtilis β-1,3-1,4- 葡聚糖, 主要存在于谷物胚乳的细胞壁中, 是由葡萄糖通过 β-1,3 和 β-1,4 混合糖苷键连接起来 [1 ] β-1,3-1,4- 葡聚糖酶 (EC ) 是一类重要的水解酶, 它对水解谷物中的 β- 葡聚糖具有重要的作用, 在啤酒工业和饲料工业中具有重要的应用价值在啤酒生产中, 可解决因大麦中 β- 葡聚糖引起的麦汁粘度大和啤酒过滤速度慢的问题 [3] 在饲料工业中, 添加该酶可消除因谷物中 β- 葡聚糖含量高引起动物消化道内食糜粘度的增加, 从而提高饲料利用率, 促进动物生长 [4] β-1,3-1,4- 葡聚糖酶主要来源于植物或微生物 [5 9], 其中利用微生物发酵产酶多以芽孢杆菌为出发菌株获得 [3,8 13], 且细菌酶具有酶系单一特异性强发酵周期短芽孢杆菌产酶安全等优点 [10], 可应用于食品工业国内郝秋 [7] [1] 娟等和白晓娟等以芽孢杆菌为出发菌株, 利用 5 L 发酵罐和摇瓶发酵, β- 葡聚糖酶活力可达 U/mL 和 3.1 U/mL; 国际上研究芽孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶发酵条件优化的报道较 [9] 少 Tang 等对枯草芽孢杆菌 ZJF-1A5 的发酵条件进行响应面优化后, 酶活力可达 51 U/mL 因此, 由于目前其产酶水平较低, 生产成本高产酶条件的优化是提高微生物源酶活力的重要方式, 响应面法 (Response surface methodology, RSM) 是一种统计技术的合称 [10], 该方法已经成功应用于生物技术的许多方面但利用其方法优化产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶产酶发酵条件的研究报道还比较少 [9 10] 本实验室前期从自然界筛选得到一株枯草芽孢杆菌 D-6, 首先对该菌摇瓶液体发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶条件进行了研究在此研究工作的基础上, 进一步采用 5 L 发酵罐, 利用 RSM 中 Box-Behnken 设计, 进行发酵放大优化研究, 为该酶的进一步工业化生产提供参考依据 1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂 5JG-9000 发酵罐, 上海保兴生物设备工程有限公司 ; TU 1800PC 紫外分光光度计, 北京普析通用仪器设备有限责任公司 ; LRH 恒温恒湿培养箱, 广东省医疗器械厂 ; Power Pac Basic TM 型电泳仪, Bio-Rad 公司 ; GL-0B 高速冷冻离心机, 上海安亭科技仪器厂大麦葡聚糖葡萄糖购于 Sigma 公司 ; 低分子量标准蛋白样品购于 TaKaRa 公司 ; 其它试剂均为分析纯 1. 菌种培养基及培养条件枯草芽孢杆菌 D-6 由中国农业大学食品科学与营养工程学酶工程研究室保存种子培养基 (g/l): 胰蛋白胨 10.0, 酵母膏提取物 5.0, NaCl Pa 灭菌 0 min 发酵培养基 (g/l): 燕麦粉 0.0, 大豆蛋白胨 10.0, KH PO 4 5.0, MgSO 4 7H O 0.3 和 CaCl 0.3

3 唐艳斌等 : 枯草芽孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的响应面优化 Pa 灭菌 0 min 种子液的培养 : 从平板培养基挑取单菌落接入装有 50 ml 种子培养基的 50 ml 三角瓶中, 50 C 00 r/min 振荡培养 16 h, 培养液即为种子液发酵罐培养 : 在 5 L 发酵罐中加入 3 L 发酵培养基, Pa 灭菌 30 min, 冷却后加入接种量为 1% 种子液 (30 ml) 发酵 4 h 于 50 C 下, 考察其发酵产酶历程 ( 测定其酶活力和溶氧量 ) 1.3 酶活力 SDS-PAGE 以及酶谱分析酶活力测定 : 采用 DNS 法测定 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶酶活力 [6] 0.1 ml 适当稀释的酶液 ( 空白对照则将其酶液灭活, 即将酶液在沸水中煮沸 10 min, DNS 法检测无颜色变化 ), 加入到 0.9 ml 0.5% 的大麦葡聚糖底物溶液中 ( 用 50 mmol/l ph 6.0 的柠檬酸缓冲液配制 ), 60 C 水浴反应 10 min 后加入 1 ml DNS 试剂, 煮沸终止反应并显色, 测定所释放的葡萄糖量 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的活力单位定义为 : 在上述反应条件下, 每分钟生成 1 μmol 葡萄糖所需要的酶量 SDS-PAGE 参照 Laemmli 的方法进行 [14] 分离胶为 1.5%, 浓缩胶为 4.5%, 考马斯亮蓝 R50 染色酶谱分析方法参照 Tang 等的方法 [6] β-1,3-1,4- 葡聚糖酶酶谱分析为正常的 SDS-PAGE 后 ( 电泳胶中含有 0.% 的大麦葡聚糖 ), 将电泳胶取出用 5% 的异丙醇溶液浸泡 3 次 (10 min/ 次 ) 使蛋白复性, 然后用缓冲液浸泡 3 次 (10 min/ 次 ) 洗去异丙醇溶液, 最后将电泳胶置于 50 C 保温 30 min, 加入 0.5 g/l 的刚果红溶液染色 30 min, 用 1 mol/l 的 NaCl 溶液脱色直至显现透明带淀粉酶酶谱分析与 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶相似, 只是将 β-1,3-1,4- 葡聚糖底物更换为玉米淀粉, 染色液更换为稀碘液染色 0 min, 去离子水冲洗直至出现亮带 1.4 发酵罐响应面试验设计采用 BBD 模型, 以转速 (X 1 ) 通气量 (X ) 和 ph (X 3 ) 为自变量, 因子编码及水平见表 1, 以酶活力 Y 为响应值, 由最小二乘法拟合的方程为 : Y=β 0 + β i X i + β ii X ii + β ij X i X j +ε 其中 β 0 为常数项, β i 为线性系数, β ij 为交互项系数, ε 为随机误差根据此二次回归方程, 在一定水平范围内求取最佳值表 1 试验因素水平及编码 Table 1 Process variables and their levels for BBD experiments 自变量因子水平 Coded levels Independent Symbol varuables Speed (r/min) X Ventilation (vvm) X ph X 结果与讨论.1 摇瓶发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶通过对碳源氮源初始 ph 值等优化, 在最佳发酵培养条件下培养 7 h, 枯草芽孢杆菌 D-6 发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的最高酶活力可达 800 U/mL 产酶历程如图 1 所示与大多数芽图 1 枯草芽孢杆菌 D-6 摇瓶发酵产酶历程 Fig. 1 Time course of β-1,3-1,4-glucanase production from Bacillus subtilis D-6

4 554 微生物学通报 Microbiol. China 013, Vol.40, No.4 孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶相比, D-6 具有明显的产酶优势, 比以往报道的 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶活力都高 [3,7 8,11 1] 但也存在一个问题, 即 D-6 发酵时间较长, 一般芽孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶在 50 h 左右即可达到产酶高峰 [3,7,1,16] 发酵时间长则不利于工业化生产. 发酵罐方差分析 D-6 在摇瓶试验中得到了较高的酶活力由于摇瓶发酵有其局限性, 不能自动控制溶氧和 ph 值, 因此考虑溶氧和控制 ph 以及发酵时间等因素, 进一步考察利用 5 L 发酵罐发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶试验结果见表利用统计软件 Design-Expert ( 版本 7.1.6) 对表试验数据进行回归分析各试验因子对响应值的影响用方程表示 : Y= X X X X 1 X +4.14X 1 X X X X X X 3 对该模型进行方差分析和显著性检验见表 3 由表 3 可以看出, 该模型回归显著 (P< ), 方程中 X 1 和 X 3 的影响都显著, 且该模型的 R = , 回归方程和分析表较好地描述了各因素和响应值之间的关系, 可利用该模型确定最佳培养条件同时, 还可以看出转速 (F=481.56)> ph (F=19.7)> 通气量 (F=5.79), 说明转速对其酶产量影响最大有研究显示, 转速的改变直接影响发酵罐中溶解氧的增减, 溶解氧的改变可提高代谢产物的形成 [16] Table 表试验设计及结果 Design and results of Box-Behnken design 试验号因素及水平 Coded level of variables Trial No. X 1 X X 3 酶活 Enzyme activity (U/mL) Note: X 1 : Agitation; X : Aeration; X 3 : ph.

5 唐艳斌等 : 枯草芽孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的响应面优化 555 表 3 回归方程方法分析表 Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus subtilis D-6 方差来源 Source 模型 Model 平方和 Sum of squares 自由度 DF 均方差 Mean square F 值 F-value 1.537E E < 显著性 X E E < X X X 1 X X 1 X X X X E E < X.00E E < X E E < 残差 Residual 失拟项 Lack of fit 误差 Pure error 总离差 Cor. total R Adj R Pred R 不显著 E P r >F.3 响应 3D 曲面分析由图可以看出, 当 X 1 X 和 X 3 其中一个变量一定时, 随着其它两个变量的增加, β-1,3-1,4- 葡聚糖酶酶活力呈先上升后下降的趋势利用 Design-Expert 软件, 通过岭嵴分析得出, 当转速 500 r/min 通气量 1.05 vvm 和培养基 ph 值控制为 5.08, 在此条件下计算酶活力可达 U/mL 为了验证优化结果的可靠性, 按照响应面优化的发酵条件进行验证实验, 可达 94.4 U/mL, 与计算得出的酶活力接近, 认为该模型与实验值拟合较好.4 5 L 发酵罐产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的历程 D-6 以 5 L 发酵罐产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的历程如图 3 所示发酵前 1 h 内, 菌株几乎不分泌产酶, 从 1 h 后分泌的酶量急剧增加, 到 15 h 时, 酶活力达到最高产酶量的 50% 以上, 第 h 达到最高值, 之后酶活力开始下降与之前该菌株摇瓶发酵相比, 虽酶活力有少许下降, 但发酵罐发酵达到最高产酶时间仅为 h, 只需不及摇瓶发酵时间的 1/3, 大大缩短了发酵时间, 能较好地节省生产成本, 利于大规模生产此外, 图 4 表明 D-6 所产的胞外蛋白有条 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶带, 分子量主要分布在 7 35 kd 之间

556 微生物学通报 Microbiol. China 013, Vol.40, No.4 图 3 枯草芽孢杆菌 D-6 以 5 L 发酵罐发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶历程 Fig.

Three-dimensional response surface plots for the effect of fermentation parameters on β-1,3-1,4-glucanase production by Bacillus subtilis D-6 Note: A: Effect of ph and aeration; B: Effect of ph

在细菌 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的研究中, 大多分子量在 10 30 kd 之间 [10], 而本研究中 D-6 所产的 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶其中一条酶谱带高于 30 kd 以上, 说明其具有一定的新颖性此外, 在图 4 中发现分子量 40 kd 左右有一条主带, 通过酶谱分图 4 5 L 发酵罐发酵产酶粗酶液的 SDS-PAGE 和酶谱分析 Fig.

6 556 微生物学通报 Microbiol. China 013, Vol.40, No.4 图 3 枯草芽孢杆菌 D-6 以 5 L 发酵罐发酵产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶历程 Fig. 3 Time course profile of β-1,3-1,4-glucanase production by Bacillus subtilis D-6 using submerged fermentation in a 5 L fermentor 图转速通气量和 ph 对酶活力的响应面分析 Fig. Three-dimensional response surface plots for the effect of fermentation parameters on β-1,3-1,4-glucanase production by Bacillus subtilis D-6 Note: A: Effect of ph and aeration; B: Effect of ph and agitation; C: Effect of aeration and agitation. 在细菌 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的研究中, 大多分子量在 kd 之间 [10], 而本研究中 D-6 所产的 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶其中一条酶谱带高于 30 kd 以上, 说明其具有一定的新颖性此外, 在图 4 中发现分子量 40 kd 左右有一条主带, 通过酶谱分图 4 5 L 发酵罐发酵产酶粗酶液的 SDS-PAGE 和酶谱分析 Fig. 4 SDS-PAGE and zymogram analysis of β-1,3-1,4-glucanase production by Bacillus subtilis D-6 in a 5 L fermentor 注 : M: 低分子量标准蛋白 ; 1 9: 15 3 h 的粗酶液 ; 10: β-1,3-1,4- 葡聚糖酶谱分析 ; 11: 淀粉酶谱分析. Note: M: Low molecular weight calibration kit; 1 9: 15 3 h, respectively; 10: β-1,3-1,4-glucanase zymogram of the crude culture supernatant; 11: Amylase zymogram of the crude culture supernatant. 析该主带为淀粉酶, 这与其它枯草芽孢杆菌发酵产淀粉酶的报道相一致 [17] 3 结论采用 Box-Behnken 实验设计和 Design-Expert 数据处理软件进行数据分析, 得到当转速通气

7 唐艳斌等 : 枯草芽孢杆菌产 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶的响应面优化 557 量和培养基 ph 分别为 500 r/min 1.05 vvm 和 5.08 时, 于 50 C 发酵 h 后, β-1,3-1,4- 葡聚糖酶酶活力最高达到 94.4 U/ ml 发酵时间短, 产酶量高, 说明该菌株具有很大的工业化应用前景同时, 酶谱图中高于 30 kd 的蛋白带具有一定新颖性, 可以通过纯化后进一步考察其相关酶学性质等参考文献 [1] Han YJ, Chen HZ. Biochemical characterization of a maize stover β-exoglucanase and its use in lignocellulose conversion[j]. Bioresource Technology, 010, 101(15): [] Furtado GP, Ribeiro LF, Santos CR, et al. Biochemical and structural characterization of a β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus subtilis 168[J]. Process Biochemistry, 011, 46(5): [3] 郑元平, 袁康培, 冯光明. 啤酒用 β- 葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化 [J]. 农业生物技术学报, 004, 1(3): [4] Beckmann L, Simon O, Vahjen W. Isolation and identification of mixed linked β-glucan degrading bacteria in the intestine of broiler chickens and partial characterization of respective 1,3-1,4-β-glucanase activities[j]. Journal of Basic Microbiology, 006, 46(3): [5] Planas A. Bacterial β-1,3-1,4-glucanase: structure, function and protein engineering[j]. Biochimica Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 000, 1543: [6] Tang YB, Yang SQ, Yan QJ, et al. Purification and characterization of a novel β-1,3-1,4-glucanase (lichenase) from thermophilic Rhizomucor miehei with high specific activity and its gene sequence[j]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 01, 60(9): [7] 郝秋娟, 李永仙, 李琦, 等. 淀粉液化芽孢杆菌 558 产 β- 葡聚糖酶的发酵条件和酶学性质研究 [J]. 食品工业科技, 006, 7(8): [8] Teng D, Wang JH, Fan Y, et al. Cloning of β-1,3-1,4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) and its expression in Escherichia coli BL1(DE3)[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 006, 7(4): [9] Tang XJ, He GQ, Chen QH, et al. Medium optimization for the production of thermal stable β-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology[j]. Bioresource Technology, 003, 93(): [10] 李永仙, 郑云飞, 李崎, 等. RSM 法优化产 β- 葡聚糖酶的发酵培养基 [J]. 食品工业科技, 009, 30(8): [11] 韩晶, 李宝坤, 李开雄. 嗜热 β- 葡聚糖酶产生菌的筛选及其培养基优化研究 [J]. 中国酿造, 008(1): [1] 白晓娟, 王闻晓. 响应面法优化 Bacillus subtilis AS35 产 β- 葡聚糖酶发酵培养基的研究 [J]. 农产品加工, 011(8): [13] Louw ME, Reid SJ, Watson TG. Characterization, cloning and sequencing of a thermostable endo-(1,3-1,4)-β-glucanase-encoding gene from an alkalophilic Bacillus brevis[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1993, 38(4): [14] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 7(559): [15] 刘泽慧, 李永仙, 李琦. 溶氧对淀粉液化芽孢杆菌 BS558 产 β- 葡聚糖酶的影响 [J]. 食品工业科技, 01, (14): 1 6. [16] Silva DP, Pessoa AJr, Roberto IC, et al. Effect of agitation and aeration on production of hexokinase by Saccharomyces cerevisiae[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 001, 91/93(1): [17] Orlando AR, Ade P, di Maggio D, et al. The purification of a novel amylase from Bacillus subtilis and its inhibition by wheat proteins[j]. Biochemical Journal, 1983, 09():

: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3

: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3 微生物学通报 FEB 20, 2008, 35(2) 306~30 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@im.ac.cn 生物实验室响应面分析法优化副溶血性弧菌生长条件刘代新宁喜斌 * 张继伦 2 (. 200090) (2. 20202) 摘要