碱脂肪酸类核苷类氨基酸及微量元素等成分 [3] 现代药理研究表明, 灵芝三萜类成分具有抗 HIV 保肝抗组胺辅助降血压等活性, 其不饱和脂肪酸类成分具有对人体免疫系统神经系统心血管系统等均有很好的调节作用, 灵芝多糖具有显著的提高免疫力抗肿瘤功效清除自由基抗衰老等活性这三类成分是灵

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昭汤
5 years ago
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1 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＦＶＮ基础研究长白山林下仿野生栽培紫芝主要活性成分研究孟令文田淋淋李志成季存蕊张辉孙佳明长春中医药大学吉林长春摘要目的对长白山林下仿野生栽培紫芝子实体中类活性成分进行分析研究为其开发利用提供依据方法以长白山林下仿野生栽培紫芝子实体为研究对象采用高效液相色谱电喷雾串联质谱法对超临界ＣＯ萃取得到的紫芝油中三萜类成分进行分析采用气相色谱质谱法分析紫芝油中脂肪酸类物质的组成采用苯酚硫酸法测定提取紫芝油后的残渣中多糖含量结果长白山林下仿野生栽培紫芝油中含有较丰富的三萜酸类成分总三萜占紫芝油质量的并初步分析了其中含有ＧＡ等５个三萜酸的结构紫芝油中共检出５种脂肪酸其中不饱和脂肪酸占含量较大的为油酸和亚油酸经测定提取紫芝油后的残渣中多糖含量为结论本品中含有丰富的多糖三萜和脂肪酸这类活性成分表明长白山林下仿野生栽培紫芝具有很大的应用开发价值关键词长白山林下仿野生栽培紫芝活性成分ＡＭＡＩＷＧＣＵＦＣＭＭＥＮＧＬｗＴＩＡＮＬＬＩＺＪＩＣＺＨＡＮＧＨＳＵＮＪＣＵＣＭＣＣＡＯｊＴｋｗＧＣＴＴＧＣＯｗＭＬＣＥＳＩＭＳＭＳＦＧｗＧＣＭＳＴＧｗＲＧＴｗＧｗ５ＡＬＣＭＳ５ｗＧｗＴＧｗＣＧｗｗＧＣＫｗＣｗＧｊ紫芝ＧＺＸＺ为担免疫调节保肝解毒和镇痛镇静安神等临床价子菌纲多孔菌科紫芝属真菌中华人民共和国药值现代临床中亦用作癌症放化疗后白细胞减少等版将其与赤芝Ｇ的干燥子实体共典症状效果显著除药用价值外灵芝及其深加工产同定为灵芝药用正品灵芝是我国传统名贵中药材并已有悠久的药用历史具有抗肿瘤抗氧化品也经常用作人体保健品具有相当高的市场价值而灵芝主要含有三萜类多糖肽类生物基金项目中医药行业科研专项５通信作者张辉教授研究方向中药化学中药资源学ＴＥ孙佳明教授研究方向中药化学中药资源学Ｅｊ

2 碱脂肪酸类核苷类氨基酸及微量元素等成分 [3] 现代药理研究表明, 灵芝三萜类成分具有抗 HIV 保肝抗组胺辅助降血压等活性, 其不饱和脂肪酸类成分具有对人体免疫系统神经系统心血管系统等均有很好的调节作用, 灵芝多糖具有显著的提高免疫力抗肿瘤功效清除自由基抗衰老等活性这三类成分是灵芝的主要活性成分随着灵芝产业的发展, 野生灵芝远不能满足市场的需求, 逐渐形成一种灵芝仿野生化栽培的抚育技术, 即人工灵芝三级或者二级菌种 [4] 菌种栽种于除红松外的松科木段中, 一般三到四年出芝, 该模式为仿野生栽培方式, 生产的灵芝品质是否能够替代野生灵芝还有待评价因此本文对长白山地区仿野生化栽培紫芝的药用价值进行的全面评价, 采用 LC MS GC MS 和 UV 分别分析这三类活性成分, 为其开发利用提供科学依据 1 实验仪器与材料 1 1 实验材料长白山林下仿野生栽培紫芝药材经长春中医药大学张辉教授鉴定为多孔菌科紫芝属真菌紫芝 GanodermasinenseZhao,XuetZhang 的子实体 1 2 实验仪器及试剂 Agilent1100seriesLC MSD 液质联用仪, 包括 : AgilentSL 型多级离子阱质谱仪低压四元梯度泵二极管阵列检测器 (DAD) 自动进样柱温箱 Chemistation 化学工作站等 ;GL 20G H 型低温超速离心机 ;BP211D 型十万分之一电子天平 ( 北京赛多利斯天平有限公司 ) Aglent6890NGCsystem; 质谱 : Angilent5973NetworkMSD(MasSelctiveDetector), NIST98 数库 ;Agilent7683series 自动进样器蒸馏装置, 分光光度计, 电子天平, 苯酚, 硫酸实验所用乙腈为色谱纯, 水为娃哈哈纯净水, 其余试剂为分析纯 2 实验方法 2 1 应用 LC MS 分析长白山林下仿野生栽培紫芝油中三萜类成分样品制备取长白山林下仿野生栽培紫芝超临界 CO 2 萃取得到紫芝油 1g, 加入甲醇 20mL, 超声 30min, 离心取上清, 上清液回收溶剂至干, 得黄色粉末状总三萜 40mg 另取该粉末 1mg, 加甲 138 醇 1mL, 超声溶解, 过 0 22μm 膜供 LC MS 分析色谱条件 EclipseplusC18 色谱柱 (4 6mm 250mm,5μm); 流动相 : 乙腈 /0 1% 的甲酸水溶液二元线性梯度洗脱, 流动相梯度设置 ( 见表 1) 流速 :0 3mL min -1 ; 检测波长 :257nm; 柱温 : 30 ; 进样量 :10μL [5 7] 表 1 流动相梯度表时间 /min 乙腈 (%) 1 甲酸水溶液 (%) 质谱条件电离源 : 电喷雾离子源 (ESI); 检测方式 : 正负离子同时采集 ; 扫描范围 :m/z50~ 1200; 目标分子量 :500; 干燥气温度 :350 ; 干燥气流量 :9L min -1 ; 雾化气压强 :0 24MPa (35 0psi); 毛细管电压 :4kV 2 2 应用 GC MS 分析长白山林下仿野生栽培紫芝油中脂肪酸成分样品溶液制备精密称取长白山林下仿野生栽培紫芝孢子油 5mg, 加 1mL 正己烷超声提取 30min, 静置, 取上清待用 [13 15] 方法与条件工作条件 :DB 1MS 石英毛细管色谱柱 (30 00m 0 25mm 0 25μm); 进样口 260, 柱温 70 (2min)~290 (5min), 10 /min; 气质接口 280 载体为 He, 流速 1 2mL min -1 进样量为 1μL; 离子源温度 230, 四极杆温度 50 电离方式 EI, 电子能量 70eV 数据采集电子扫描范围 35~500aum [13 15] 2 3 应用苯酚硫酸法测定提取紫芝油后药材残渣中多糖供试品溶液制备称取长白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后药材残渣 1g, 精密称定, 置圆底烧瓶中, 加蒸馏水 20mL,100 回流提取 3 次, 每次 1h, 过滤, 合并滤液, 加乙醇至 75%, 静置过夜, 过滤, 滤液减压回收乙醇至无醇味, 剩余水液冻干, 得棕黄色粗多糖, 备用取粗多糖 1mg, 加蒸馏水, 超声溶解, 定容至 1mL 量瓶中, 摇匀, 即得对照品溶液制备精密称取干燥至恒重的 D 无水葡糖糖对照品 10mg 于 100mL 容量瓶中, 加蒸馏水稀释至刻度, 得到 0 1mg ml -1 的对照品溶液,

3 置冰箱中备用标准曲线绘制精密吸取对照品溶液 0 2, 0 4,0 6,0 8,1 0mL 分别置于具塞试管中, 各加蒸馏水至 1mL, 加入 5% 的苯酚 1mL, 快速加入硫酸溶液 5mL 摇匀, 放至 5min 水浴加热 15min, 冷却至室温, 以蒸馏水 1mL 为空白, 同法操作, 于 490nm 处测定吸光度 (A), 以质量浓度 (C) 为横坐标,A 为纵坐标绘制标准曲线 [16 17], 标准曲线方程为 A=8 6757C (r=0 9952), 线性范围 0 02~0 1mg ml -1[21 22] 精密度试验精密量取对照品溶液 6 份, 各 0 4mL, 分别加蒸馏水定容至 1mL, 按方法连续测定, 结果 RSD2 5%, 表明仪器精密度良好重复性试验精密称取同一样品 6 份, 按制备供试品溶液, 按方法测定, 计算总多糖含量, 结果 RSD3 7%, 表明重复性良好稳定性试验精密量取供试品溶液 1mL, 按方法操作, 分别于 0,1,2,3,4h 测定 A, 结果吸光度 RSD1 8%, 表明供试品溶液在 4h 内稳定加样回收率试验取同一批已知含量的供试品 6 份各 0 5g, 分别加入适量葡萄糖溶液, 按制备供试品溶液, 按测定 A 回收率在 98 7% ~103 9%,RSD2 6% 样品含量测定称取长白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后药材残渣, 按制备供试品溶液, 平行 3 份精密吸取 0 1mL 至试管中, 按测定其吸光度 A 3 结果与讨论 3 1 紫芝油中三萜类成分分析采用 LC MS 联用技术, 根据每一组分的保留时间色谱紫外吸收特征准分子离子峰和二级质谱 [5 13] 碎片信息, 并参考文献进行解析, 鉴定了长白山林下仿野生栽培紫芝油中 15 个三萜类化学成分的可能结构, 结果见图 1, 表 2 在长白山林下仿野生栽培紫芝油总三萜中已经初步确定了 15 个三萜酸的结构, 其中 13 个集中在 9 3~21 0min, 它们的峰面积占总色谱峰面积的 93 4% 而长白山林下仿野生栽培紫芝油总三萜的质量占紫芝油的 40%, 说明长白山林下仿野生栽培紫芝油中含有较丰富的三萜酸类成分 3 2 紫芝油中脂肪酸成分分析长白山林下仿野生栽培紫芝孢子油经 GC MS 鉴定, 实验结果表明至少有 15 个特征峰出现, 共检出油酸, 亚油酸, 肉豆蔻酸, 棕榈酸,2,3,4 三甲基癸烷,1 甲氧基 4 (1 丙烯基 ) 苯等 15 种化合物采用面积归一化计算各组分的相对含量, 总离子流图和化合物鉴定详细结果见图 2 表 3 图 1 长白山林下仿野生栽培紫芝油中三萜类成分的液相色谱图和总离子流图 139

4 表 2 长白山林下仿野生栽培紫芝油三萜类成分正离子扫描模式的 LC MS 分析结果质谱信息峰号保留时间 /min 最大吸收波长 /nm 化合物名称 [M+H] + MS GanodericacidD ,421 6,403 7 GanodericacidB ,421 7,439 6 GanodericacidA ,421 6,439 6 GanodericacidK ,371 5,381 6 GanodericacidF ,419 5,437 6 Ganodericacidζ ,421 5,439 5 GanodericacidAM ,363 5, acetoxyganoderica ,461 6,479 6 GanodericacidD ,461 5,479 5 GanoderenicacidD ,387 5,437 5 GanodericacidC ,303 3,317 6 GanodericacidTR ,327 6,353 6 GanodericacidD ,329 6,357 6 GanodericacidZ ,455 6,479 5 Unknown ,259 4,271 4 GanodericacidDM GanodericacidAM1 的准分子离子峰和碎片峰为负离子模式下检测, 标注为 [M H] - 图 2 长白山林下仿野生栽培紫芝油脂肪酸类成分 GC MS 分析总离子流图 140

5 表 3 长白山林下仿野生栽培紫芝油脂肪酸类成分 GC MS 分析结果峰号保留时间 /min 化合物名称分子式分子量相对百分含量 (%) ,6 二甲基壬烷 C 11 H ,6 二甲基癸烷 C 12 H 甲氧基 4 (1 丙烯基 ) 苯 C 10 H 12 O ,6,10,14 四甲基十六烷 C 20 H ,3,7 三甲基癸烷 C 13 H ,5 二叔丁基酚 C 14 H 22 O 二十五烷 C 25 H 二十八烷 C 28 H 二十七烷 C 27 H 肉豆蔻酸 C 14 H 28 O 二十烷 C 20 H 棕榈酸 C 16 H 32 O 亚油酸 C 18 H 32 O 油酸 C 18 H 34 O 硬脂酸 C1 8 H 36 O 由表 3 可知, 长白山林下仿野生栽培紫芝油中富含多种脂肪酸, 不饱和脂肪酸占 68 9%, 其中油酸占 %, 亚油酸占 %; 饱和脂肪酸以硬脂酸, 棕榈酸, 肉豆蔻酸为主, 含量分别为 4 414%,9 606% 和 0 991% 此外, 紫芝油样品中还检测出少量 2,6 二甲基壬烷,3,6 二甲基癸烷, 2,6,10,14 四甲基十六烷,2,3,4 三甲基癸烷, 二十五烷, 二十八烷, 二十七烷类烷烃, 以及芳香类化合物 1 甲氧基 4 (1 丙烯基 ) 苯,2,5 二叔丁基酚以上分析数据为利用长白山林下仿野生栽培紫芝孢子油提供了科学依据 3 3 提取紫芝油后药材残渣多糖测定 1g 长白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后药材残渣经提取纯化得到粗多糖 22 7mg, 测得粗多糖中多糖含量为 34 7%, 折合药材残渣中多糖含量为 0 79% 3 4 讨论采用 LC MS 方法对长白山林下仿野生栽培紫芝中三萜类成分进行分析, 结果紫芝油中含有较丰富的三萜酸类成分, 而且现已经初步确定了 15 个三萜酸的结构 ; 采用 GC MS 法对紫芝油中脂肪酸类物质进行结构和含量分析, 结果紫芝油中富含多种脂肪酸, 其中不饱和脂肪酸占总量的 68 9%, 与文献报道的灵芝中不饱和脂肪酸含量 (61 2% ~73 6%) 无明显差别 [13 17] ; 尤其是长白山林下仿野生栽培紫芝提取紫芝油后的药材残渣多糖量含量为 0 79%, 略高于中华人民共和国药典 2010 版灵芝中多糖含量不低于 0 5% 的标准 [1] 现代药理研究表明, 紫芝具有良好的抗肿瘤提高免疫力清除自由基和抑菌等活性, 而紫芝所含的三萜多糖和不饱和脂肪酸类成分系其主要药效物质基础其中紫芝胞内酸性三萜和胞外酸性三萜在 250μg ml -1 时, 对人肝癌细胞 BEL7402 和人乳腺癌细胞 MCF 7 均有显著抑制作用, 另外紫芝含有的三萜类化合物 GanodericacidF 和 Ganodericacid Z 具有阻止乳癌生长的作用, 可作为治疗癌症的辅助剂 [19,23] 紫芝胞内酸性三萜在 40mg ml -1 时, 对大肠杆菌 Escherichiacoli 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 的生长均具有显著抑制作用, 且紫芝胞外三萜物质也表现出不同抑菌活性, 其中对大肠杆菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为 mg ml -1[24 25] 在紫芝总多糖口服给药剂量为 40 5mg kg -1 时, 对 H22 肝癌小鼠的抑瘤率为 63 94%, 对 Lewis 肺癌小鼠的抑瘤率为 58 32%, 表现出较明显的抗癌活性 ; 对紫芝液体深层发酵菌丝体精制多糖进行进一步分离纯化得到的单一组分 GS A 1 对荷瘤小鼠由环磷酰胺引起的化疗损伤具有保护作用 [26 27] 而紫芝粗多糖经 DEAE 52 柱层析纯化得到的 3 种多糖组分 GSP1 GSP2 和 GSP3, 均具有抗氧化活性, 其中 GSP2 在 1 6mg ml -1 时 DPPH 自由基清除率达到 76 3%, 抗氧化活性尤为明显 [28] 紫芝富含的不饱和脂肪酸中油酸亚油酸则能通过提高 SOD 活性等作用表现出显著的清除自由基活性, 以及通过促进正常小鼠幼生 IL 2 促进 ConA 诱导的脾 T 淋巴细胞 141

6 年月第卷第期中国现代中药增殖反应从而起到调节免疫的作用综上长白山林下仿野生栽培紫芝具有野生灵芝相当的药用价值具有很大的市场开发前景目前以灵芝中三萜和不饱和脂肪酸类成分开发的灵芝油软胶囊的产品较多但提油后剩余物作为工业残渣被扔掉其中富含的多糖没有得到充分利用十分可惜为了对长白山林下仿野生栽培紫芝资源进行科学合理的综合利用根据本文的研究结果应进一步对提油后的紫芝残渣中的多糖进行提取纯化进而为开发具有免疫调节活性的功能食品和药品奠定基础ＭＣＭＦＶＮＧＪＪＣＢｊｊＣＹＹＹＸＭＹＤＧＨＰＬＣＬＣＭＳＪＪＰＢＡ田弋夫李金华余德顺等超临界ＣＯ萃取灵芝孢子油的ＧＣＭＳ分析Ｊ中国油脂陈体强吴锦忠徐洁等灵芝孢子油脂肪酸组分的分析Ｊ菌物研究５５参考文献国家药典委员会中华人民共和国药典一部Ｓ北京中国医药科技出版社柯永建乐仁昌江小昱灵芝活性成分及药用价值Ｊ中国科技博览５刘超王洪庆李保明等紫芝的化学成分研究Ｊ中５国中药杂志陈朝阳王玲徐艳等灵芝仿野生高产栽培技术Ｊ陕西农业科学５５ＴＷＧＴＹＺＪＪＳＧｗＪＢＥＪ５ＲＷＭＰＤＧＧＪＢＰＣＮＰＤＷＣＬＱＣＨＳＧＪＦＣ５ＬＹＬＬＹＰＱＦＳＧＪＪ５ＫＳＲＨＲＨＱＧＩＣＲＰＨＰＬＣＥＳＩＭＳＪＦＣＤＪＣＣＲＹＳＡＧＪＰＣＣＲＹＭＹＫＭ５孟凡冰李云成钟耕灵芝孢子油的提取及脂肪酸检食品科学测Ｊ胡居吾范青生肖小年等菌草灵芝孢子油与段木灵芝孢子油中脂肪酸组成的比较研究Ｊ天然产物研究开发王卫霄吕艳茹姚苗苗等灵芝孢子粉抗肿瘤活性的河北医药５５研究进展Ｊ伍明罗霞江南等灵芝抗肿瘤组分的分离Ｊ时珍国医国药唐庆九季哲郝瑞霞等灵芝中性三萜类成分的抗肿瘤作用Ｊ食用菌学报郝瑞霞张劲松唐庆九等灵芝子实体中三萜类成分对肿瘤细胞的抑制作用Ｃ第二届全国食用菌中青年专家学术交流会论文集杭州出版者不详杨勇杰姜瑞芝陈英红等苯酚硫酸法测定杂多糖含中成药５量的研究Ｊ张志军刘建华李淑芳等灵芝多糖含量的苯酚硫酸法检测研究Ｊ食品工业科技杨国红杨义芳金隽迪紫芝液体深层发酵液的抗肿瘤活性部位研究Ｊ中草药王晓玲刘高强周国英紫芝发酵菌体中三萜类化合物的抑菌活性研究Ｊ时珍国医国药５刘高强赵艳紫芝胞外三萜物质的体外抑菌作用Ｊ食品工业科技牛莉鑫杨义芳赵正保紫芝多糖ＧＳＡ的结构鉴定与生物活性研究Ｊ中成药５谢丽源甘炳成彭卫红等灵芝深层发酵产物抗氧化活性物质与抗氧化能力分析Ｊ食品工业科技５５戚跃明陈涛紫芝胞外多糖分离纯化及抗氧化性的研食品工业科技５究Ｊ余素王勇灵芝孢子油的研究进展Ｊ海峡药学收稿日期５

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛徐蓓杨莉陈崇崇王峥涛徐珞珊建立黄草类石斛的薄层色谱定性鉴别方法采用薄层色谱法考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素石斛酚杓唇石斛素和三羟基甲氧基联苄的薄层色谱行为对石斛药材进行定性鉴别通过种不同基源的石斛及批商品石斛的薄层色谱鉴别证明此方法专属性强操作简单重复性好为石斛的鉴别提供了一种准确有效的新方法本方法可用于黄草类石斛的鉴别为中药石斛的质量标准研究提供科学依据