第 2 期李珊珊, 等 : 扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定 5 isofsimplicity,accuracy,goodreproducibilityandstability,soitcanbeappliedtoqualitycontroloffuguhuangtong Dis

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峨顼陶
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1 山东科学 SHANDONGSCIENCE 第 29 卷第 2 期 2016 年 4 月出版 Vol.29No.2Apr.2016 DOI: /j.isn 中药与天然活性产物扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定李珊珊 1, 牟癑静 1, 刘逢芹 2 3, 郑世存 (1. 山东中医药大学药学院, 山东济南 ;2. 山东省千佛山医院, 山东济南 ; 3. 山东省妇幼保健院, 山东济南 ) 摘要 : 建立了扶骨黄酮分散片中的葛根素大豆苷和淫羊藿苷含量测定的高效液相色谱法采用 EclipseXDB C 18 (4.6mm 250mm,5μm) 色谱柱, 流动相为乙腈 : 0.3% 乙酸水溶液梯度洗脱, 流速为 0.8mL/min, 柱温为 25, 葛根素大豆苷检测波长为 250nm, 淫羊藿苷检测波长为 270nm 结果表明, 葛根素检测浓度在 mg/mL~0.104mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好, 加样回收率为 %, 相对标准偏差为 0.89%; 大豆苷检测浓度在 mg/mL~ mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好, 加样回收率为 98.29%, 相对标准偏差为 1.29%; 淫羊藿苷检测浓度在 mg/mL~0.0416mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好, 加样回收率为 99.07%, 相对标准偏差为 1.08% 该方法简便准确, 重现性和稳定性好, 可作为扶骨黄酮分散片的质量控制标准关键词 : 高效液相色谱法 ; 扶骨黄酮分散片 ; 葛根素 ; 大豆苷 ; 淫羊藿苷中图分类号 :R284.1 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Contentdeterminationofpuerarin,daidzinandicarin infuguhuangtongdispersibletablets LIShan shan 1,MU Yue jing 1,LIU Feng qin 2,ZHENG Shi cun 3 (1.SchoolofPharmacy,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China; 2.ShandongQianfoshanHospital,Jinan250014,China; 3.ShandongProvincialMaternityandChildCareHospital,Jinan250021,China) Abstract WeestablishedaHPLC methodforcontentdeterminationofpuerarin,daidzinandicarininfuguhuangtong DispersibleTablets.ItinvolvesEclipseXDB C 18 column(4.6mm 250mm,5μm),mobilephaseacetonitrile water acetic acidsolutionwithflowrateof0.8ml min 1 andcolumntemperatureof25,detectionwavelengthof250nm forpuerarin anddaidzin,and detectionwavelengthof270nm foricarin.experimentalresultsshow thatpuerarinhasbeterlinear relationshipwithpeakareaintherangeof mg/ml~0.104mg/ml,recoveryrateof100.29% andrelativestandard deviationof0.89%.daidzinhasbeterlinearrelationshipwithpeakareaintherangeof mg/ml~0.0392mg/ml, recoveryrateof98.29% andrelativestandarddeviationof1.29%.icarinhasbeterlinearrelationshipwithpeakareainthe rangeof mg/ml~0.0416mg/ml,recoveryrateof99.07% andrelativestandarddeviationof1.08%.themethod 收稿日期 : 基金项目 : 山东省中医药科技发展计划 ( ); 山东省科技发展计划 (2013GSF1120) 作者简介 : 李珊珊 (1989-), 女, 硕士研究生, 研究方向为中药新制剂新剂型通讯作者, 刘逢芹 @163.com

2 第 2 期李珊珊, 等 : 扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定 5 isofsimplicity,accuracy,goodreproducibilityandstability,soitcanbeappliedtoqualitycontroloffuguhuangtong DispersibleTablets. Keywords HPLC;FuguHuangtongDispersibleTablets;puerari;daidzin;icarin 扶骨黄酮分散片是由葛根淫羊藿等药材提取物和珍珠粉制备的中药制剂, 主要治疗骨质疏松症葛根是豆科多年生落叶藤本植物葛 (Puerariaelobata(Wild)Ohwi.) 的干燥根, 含有多种异黄酮类化合物, 具有抗 [1 2] 骨质疏松和雌激素样作用等淫羊藿 (EpimediFolium) 是小檗科淫羊藿属多年生草本植物, 具有补肾壮 [3-4] 骨抗肿瘤等功效, 其中黄酮类成分淫羊藿苷发挥主要药效作用扶骨黄酮分散片中的有效成分是葛根素大豆苷和淫羊藿苷, 为了更好地控制扶骨黄酮分散片的质量 [5-6], 本文采用高效液相色谱法对扶骨黄酮分散片中的主要有效成分葛根素大豆苷和淫羊藿苷进行了含量测定 1 实验部分 1.1 仪器与试药安捷伦 1120 高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司 ), 包括 DAD 紫外检测器 (G1315C) 进样器 (G4290A) 梯度泵 (G4290A) 和柱温箱 (G4290A);BSA124S 电子天平 ( 赛多利斯科学仪器 ( 北京 ) 有限公司 );SB 5200D 超声波清洗机 ( 宁波新芝生物科技股份有限公司 ); 葛根素对照品 ( 批号 ) 大豆苷对照品 ( 批号 ) 和淫羊藿苷对照品 ( 批号 ), 均由中国药品生物制品检定所提供 ; 扶骨黄酮分散片 ( 自制, 批号分别为 ,140909,140910); 乙腈为色谱纯 ( 上海星可高纯溶剂有限公司 ); 其他溶剂为分析纯, 水为纯净水 ( 杭州娃哈哈集团有限公司 ) 2 方法与结果 2.1 色谱条件 EclipseXDB C 18 色谱柱 (4.6mm 250mm,5μm), 流动相为 0.3% 乙酸水溶液 (A) : 乙腈 (B) 梯度洗脱, B 项体积分数随时间的变化 :0~17min,12%;18~26min,15%;27~55min,25%;56~65min,100%; 流速为 0.8mL/min, 柱温为 25, 检测波长为 nm, 进样量为 10μL 2.2 溶液的制备对照品溶液制备精密称取葛根素对照品 5.2mg 于 25mL 容量瓶中, 加甲醇定容到刻度, 作为葛根素储备液 ; 精密称取大豆苷对照品 5.0mg 于 25mL 容量瓶中, 加甲醇定容到刻度, 作为大豆苷储备液 ; 精密称取淫羊藿苷对照品 5.2mg 于 25mL 容量瓶中, 加甲醇定容到刻度, 作为淫羊藿苷储备液精密量取葛根素储备液 4mL 大豆苷储备液 0.5mL 以及淫羊藿苷储备液 1mL 于同一 10mL 量瓶中, 加甲醇定容到刻度, 作为葛根素大豆苷淫羊藿苷对照品的混合溶液供试品溶液制备取扶骨黄酮分散片 6 片, 粉碎研磨, 精密称取 0.1g 于具塞锥形瓶中, 精密加入 30% 乙醇 50mL, 称定重量, 超声处理 1h, 再称定重量, 用 30% 乙醇补足失重, 摇匀, 过 0.45μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得阴性对照品溶液制备分别取扶骨黄酮分散片葛根阴性对照片淫羊藿阴性对照片以及全辅料阴性对照片各 6 片, 粉碎研磨, 精密称取 0.1g 于具塞锥形瓶中, 精密加入 30% 乙醇 50mL, 称定重量, 超声处理 1h, 再称定重量, 用 30% 乙醇补足失重, 摇匀, 过 0.45μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得 2.3 方法学考察专属性实验

3 6 山东科学 2016 年分别吸取对照品供试品与阴性对照溶液各 10μL, 注入液相色谱仪, 按 2.1 色谱条件进行测定, 结果如图 1~8 所示, 阴性对照品无干扰图 1 样品 HPLC 图谱 Fig.1 HPLCfigureofthesample 图 2 葛根素对照品 HPLC 图谱 Fig.2 HPLCfigureofpuerarin 图 3 大豆苷对照品 HPLC 图谱 Fig.3 HPLCfigureofdaidzin 图 4 淫羊藿苷对照品 HPLC 图谱 Fig.4 HPLCfigureoflcarin 图 5 混合对照品 HPLC 图谱 Fig.5 HPLCfigureofmixedreferencesubstance 图 6 葛根阴性对照品 HPLC 图谱 Fig.6 HPLCfigureofRadixpuerariae(negativereference) 图 7 淫羊藿阴性对照品 HPLC 图谱 Fig.7 HPLCfigureofepimedium(negativereference) 图 8 全辅料对照品 HPLC 图谱 Fig.8 HPLCfigureofaccesory(negativereference)

4 第 2 期李珊珊, 等 : 扶骨黄酮分散片中葛根素大豆苷和淫羊藿苷的含量测定线性关系考察分别量取葛根素储备液 mL, 大豆苷储备液 mL, 淫羊藿苷储备液 mL 于 5 个 10mL 容量瓶中, 用甲醇定容到刻度, 制备 5 个不同浓度的混合溶液, 过 0.45μm 微孔滤膜滤过, 按 2.1 色谱条件进行测定以浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标作图, 得到近似通过原点的直线葛根素回归方程为 y=59661x (r=0.9999), 说明葛根素在 mg/mL~ mg/mL 范围内线性关系良好大豆苷回归方程为 y=52863x (r=0.9999), 说明大豆苷在 mg/mL~ mg/mL 范围内线性关系良好淫羊藿苷回归方程为 y=30474x (R=0.9999), 说明淫羊藿苷在 mg/mL~ mg/mL 范围内线性关系良好 2.4 精密度实验吸取混合对照品溶液于高效液相色谱仪中, 按 2.1 色谱条件进行测定, 重复进样 6 次, 得葛根素大豆苷和淫羊藿苷对照品的相对标准偏差分别为 0.27% 0.19% 0.20%, 表明仪器精密度良好 2.5 重复性实验取同一批号扶骨黄酮分散片 6 份, 按项下制备方法制备样品溶液, 按 2.1 色谱条件进行测定, 测得葛根素大豆苷和淫羊藿苷的相对标准偏差分别为 0.89% 1.29% 1.08% 表明方法的重复性良好 2.6 稳定性实验精密吸取同一扶骨黄酮分散片样品溶液 10μL, 分别在 h 测定, 结果葛根素大豆苷和淫羊藿苷的峰面积的相对标准偏差分别为 0.49% 1.43% 0.51% 表明本品在 24h 内稳定性良好 2.7 回收率实验取同一批号扶骨黄酮分散片 0.05g,9 份, 按项下制备方法制备样品溶液, 分别加入低 (80%) 中 (100%) 高 (120%) 浓度的葛根素大豆苷和淫羊藿苷对照品各 3 份, 测定含量, 计算回收率, 测得结果见表 1 表 1 加样回收率实验结果 Table1 Experimentalresultoftherecoveryrate 样品含量 /(μg/ml) 加入量 /(μg/ml) 测得量 /(μg/ml) 回收率 /% 平均回收率 /% 相对标准偏差 /% 葛根素大豆苷淫羊藿苷含量测定分别取批号为的扶骨黄酮分散片各 6 片, 按项下方法制备供试品溶液, 进行测定, 结果 3 个批号扶骨黄酮分散片含量测试平均值如表 2 所示

5 8 山东科学 2016 年表 2 扶骨黄酮分散片含量测试平均值 Table2 AveragecontentofFuguHuangtongDispersibleTablets 批号葛根素含量 /(mg/ 片 ) 大豆苷含量 /(mg/ 片 ) 淫羊藿苷含量 /(mg/ 片 ) 讨论 [7] [8] 在供试品溶液的制备预实验中, 分别采用加热回流提取法和超声提取法进行制备, 供试品溶液用高效液相色谱仪进行测定, 所得结果后者好于前者, 且超声提取比加热回流提取方法简便用时短, 更易于操作, 因此本实验确定供试品溶液制备采用超声提取法在对高效液相流动相选择的实验预试中, 最初参考文献 [9-10] 采用的纯水作单一流动相, 但实验中发现部分成分的峰型不标准, 且峰滞留时间过长, 因此尝试在水中加入一定量的酸作为流动相 [11-12], 经过多次实验摸索, 发现 0.3% 乙酸水溶液可以使峰型更加标准, 故采用 0.3% 乙酸水溶液作为本实验流动相另外本实验先采用流动相等度洗脱方法, 发现对制剂中所含有的 3 种黄酮类有效成分的分离需要近 2h 的时间, 既费时又费力, 而且峰面积差异较大 ; 后尝试采用乙酸水溶液和乙腈作梯度洗脱, 通过反复实验确定流动相条件为 0.3% 乙酸水溶液 (A) : 乙腈 (B) 梯度洗脱,B 项体积分数随时间的变化 :0~17min,12%; 18~26min,15%;27~55min,25%;56~65min,100%, 所得高效液相色谱图谱清晰理想本实验供试品溶液的制备方法简单易于操作 ; 含量测定采用梯度洗脱, 节省时间,3 种有效成分分离较好, 峰形理想且与其他成分之间无干扰本实验选用方法操作简便结果准确而且重现性能好, 可以作为该产品在实际生产中质量控制的标准参考文献 : [1] 孔蓓蓓, 刘连起, 王新祥. 近十年葛根防治骨质疏松症的研究进展 [J]. 环球中医药,2012,5(3): [2] 罗显禄. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠的抗骨质疏松作用及其机制 [J]. 中国生化药物杂志,2012,33(3): [3] 刘凯杰, 李超. 淫羊藿药理研究进展 [J]. 亚热带植物科学,2014,43(2): [4] 黄秀兰, 周亚伟, 王伟. 淫羊藿黄酮类化合物药理研究进展 [J]. 中成药,2005,27(6): [5] 梁颖, 孙思雨, 刘芳. 高效液相色谱法测定复方中药强骨片中淫羊藿苷含量 [J]. 中国医药科学,2013,3(2): [6] 张玉军, 路玫. 高效液相色谱法测定降糖舒分散片中葛根素的含量 [J]. 药物与临床,2008,30(12): [7] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2010 年版一部 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社,2010: , [8] 刘永刚, 赵保胜, 王秀丽, 等.HPLC 法测定仙灵骨葆分散片中淫羊藿苷的含量 [J]. 中国实验方剂学杂志,2009,15(9):6-7. [9] 任亚东, 朱艳林. 不同产地葛根中总黄酮和葛根素的含量测定 [J]. 辽宁中医药大学学报,2008,10(5): [10] 徐文芬, 何顺志, 黄敏, 等. 高效液相色谱法测定贵州产淫羊藿药材不同药用部位中淫羊藿苷的含量 [J]. 中国实验方剂学杂志,2007,13(5):1-3. [11] 杨增明, 周海瑜, 杨树娟.HPLC 法测定淫羊藿苷含量研究 [J]. 中国药品标准,2008,9(1): [12] 王瑜, 洪育萍. 复方淫羊藿颗粒中淫羊藿苷的薄层鉴别与含量测定 [J]. 辽宁医学院学报,2010,31(2):

70 陈伟珠, 等 : 超高压液相色谱法测定鱼油中的和 DHP-EE % (RSD 1.05 %) respectively. The RSD of repetition was 1.54 %(n=6) for and 1.25 %(n=6) for. This method was

70 陈伟珠, 等 : 超高压液相色谱法测定鱼油中的和 DHP-EE % (RSD 1.05 %) respectively. The RSD of repetition was 1.54 %(n=6) for and 1.25 %(n=6) for. This method was DOI 10.3969/j.issn.1005-6521.2013.08.019 Food Research And Development 2013 3 34 6 69 1 2 1 1 * 1 1 1 1. 361005 2. 361005 : 采用超高压液相方法检测鱼油中的二十碳五烯酸乙酯 () 和二十二碳六烯酸乙酯 (), 采用 UPLC BEH C18(2.1 mm 50 mm,1.7 μm)

第 2 期 李珊珊, 等 : 扶骨黄酮分散片中葛根素 大豆苷和淫羊藿苷的含量测定 5 isofsimplicity,accuracy,goodreproducibilityandstability,soitcanbeappliedtoqualitycontroloffuguhuangtong Dis

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