评估 VITEK-2 Compact GN13 测定肺炎克雷伯菌体外亚胺培南药敏及高级专家系统修正的可靠性 71 刘盼盼, 王莲慧, 魏丹丹, 万腊根, 刘洋老年血流感染患者 107 例病原菌分布和药敏分析 77 查翔远, 宋有良, 金正胜, 沈智勇, 王谦, 胡晓春 译 文 广泛耐药革兰阴性菌感染

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1 中国感染与化疗杂志 ZHONGGUO GANRAN YU HUALIAO ZAZHI 2001 年创刊第 17 卷第 1 期 ( 总第 93 期 ) 2017 年 1 月 20 日出版 ( 双月刊 ) 主管中华人民共和国教育部主办复旦大学附属华山医院上海市乌鲁木齐中路 12 号, 承办复旦大学附属华山医院抗生素研究所中国感染与化疗杂志社编辑中国感染与化疗杂志编辑部上海市乌鲁木齐中路 12 号, 电话 :(021) 传真 :(021) 电子邮箱 : cjic@fudan.edu.cn 网络地址 : 主编张婴元副主编李光辉 ( 常务 ) 金少鸿刘又宁罗文侗陆权倪语星沈志祥万谟彬编辑部主任施耀国出版中国感染与化疗杂志编辑部上海市乌鲁木齐中路 12 号, 电话 :(021) 传真 :(021) 广告经营许可证 印刷上海欧阳印刷厂有限公司订购及邮购中国感染与化疗杂志编辑部上海市乌鲁木齐中路 12 号, 电话 :(021) 传真 :(021) 定价每期 元, 全年 元邮发代号 国外发行代号 BM3603 发行上海市报刊发行局订阅全国各地邮局中国标准连续出版物号 ISSN CN /R 版权归中国感染与化疗杂志编辑部所有本刊如有印装质量问题, 请向中国感染与化疗杂志编辑部调换 论 著 目 2015 年上海市细菌耐药性监测 1 郭燕, 杨洋, 朱德妹, 胡付品, 汪复, 蒋晓飞, 王靖, 李虎, 吉强, 王敏, 王传清, 王爱敏, 应春妹, 高晶, 方毅, 庞立峰, 袁轶群, 李刚, 张慧, 刘亚隽, 凌云, 张菁, 李华茵, 黄声雷, 陈险峰, 胡海清, 汤瑾, 吴琼, 刘庆中, 汤荣, 张泓, 王春, 孙康德, 虞中敏, 瞿跃红, 周华敏, 傅启华, 黄卫春, 倪语星, 孙景勇, 乔丹, 周敏, 张灏旻, 汪雅萍, 杨海慧, 卫颖珏, 孙晴, 徐伟红, 刘瑛, 陈峰, 张莉, 钱敏健, 朱学源, 龚炜, 王蓉, 吴唯一, 唐群力, 冯景, 林勇, 翁丽珍, 沈振华, 刘兴晖, 汪瑞忠, 房华, 范惠清, 严育忠, 陈超, 朱卿, 戴俊华, 康向东, 唐之俭, 曲浩, 刘军, 张国英, 沈菊英, 尧荣凤, 马晨芸, 别立翰, 胡骏, 张雪清, 乔昀, 赵英妹, 严丽, 陶建敏, 张雯雁, 叶杨芹, 袁应华, 刘妍, 侯伟伟, 江涟, 李娜, 邢晓宇糖尿病足部溃疡感染病原菌特点及相关因素分析 14 林红, 汪小清, 黄丽辉, 徐敏丹, 马琳, 赖人旭曲霉气管支气管炎 4 例临床分析 19 赵伟业, 刘菁, 刘学东低水平乙型肝炎病毒表面抗原核苷类似物经治患者序贯 α 干扰素治疗的初步研究 24 李朋, 李天驹, 李子益, 秦波流感病毒两种快速抗原检测方法的对比分析 29 陈晨, 范清琪, 陈刚, 朱梦琪, 吴晶, 张文宏, 金嘉琳 spo0a 基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用 33 宋晓蕾, 周芬芬, 吴湜, 高琼, 黄海辉, 陈轶坚安徽省滁州市儿童医院 2014 年临床分离菌的耐药性监测 37 陈玲, 曹明杰, 谢强, 徐添天 MicroScan WalkAway 仪器对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌检测能力的评价 42 赵志常, 刘茂柏, 李彬, 陈玮媛, 张婧玲, 黄丽雅, 刘蕊, 林齐立喹诺酮类耐药福氏志贺菌的相关耐药基因研究 46 张雯霞, 张珏, 陈洪友, 屠丽红, 陈敏应用碳青霉烯酶失活法检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌 52 牛翠, 杨靖, 时东彦碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌中 bla NDM 基因型检测及流行病学分析 56 王峰, 孙景勇, 张芳芳, 袁轶群 年北京儿童医院临床分离细菌的分布及耐药性监测 61 董方, 王艳, 刘锡青, 甄景慧, 郑红艳, 常梅, 甄杨, 张清秀, 宋文琪 次

2 评估 VITEK-2 Compact GN13 测定肺炎克雷伯菌体外亚胺培南药敏及高级专家系统修正的可靠性 71 刘盼盼, 王莲慧, 魏丹丹, 万腊根, 刘洋老年血流感染患者 107 例病原菌分布和药敏分析 77 查翔远, 宋有良, 金正胜, 沈智勇, 王谦, 胡晓春 译 文 广泛耐药革兰阴性菌感染的实验诊断 抗菌治疗及医院感染控制 : 中国专家共识 82 王明贵译 年 CHINET 中国细菌耐药性监测网 10 种重要临床分离菌的耐药性变迁 93 胡付品译 病例报告 伦敦沙门菌感染 1 例 100 李玲霞, 鄢超, 李威, 何成彦, 徐雪松中性粒细胞缺乏合并麻疹孪生球菌血流感染 1 例 102 冯琪荣, 王丽, 尹晓林 综 述 氨基糖苷类抗生素治疗药物浓度监测的研究进展 104 彭小林, 范亚新, 张亮, 陈代杰, 张菁儿童恶性血液病中心静脉导管相关血流感染研究进展 110 王真, 蒋慧非伤寒沙门菌对喹诺酮类及头孢菌素类抗菌药物的耐药性研究 114 修宁宁, 孙超, 庄云菁 信息交流 季节性流感疫苗 Fluad 上市 叶美萍, 王明贵 18 寨卡病毒暴发流行期针对妊娠妇女的暂定指南 丁百兴, 王明贵 23 西半球的寨卡病毒疫情 盛滋科, 徐晓刚 32 艾沙康唑和伏立康唑 丁百兴, 王明贵 51 哥伦比亚寨卡病毒感染者可能高达 70 万 丁百兴, 王明贵 55 全球至少 3 个洲出现质粒介导的黏菌素耐药 盛滋科, 徐晓刚 60 单剂庆大霉素治疗脓毒症的安全性 丁百兴, 王明贵 70 抗生素治疗相关性脑病 李培, 林东昉 99 美国 年产 OXA-48 样碳青霉烯酶的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 盛滋科, 徐晓刚 101 AbbVie 公司丙型肝炎新药显示高治愈率 盛滋科, 徐晓刚 113 丙型病毒性肝炎治疗进展 : 寻求完美的治疗方案 沈震, 王明贵 118 多黏菌素 B 比黏菌素的肾毒性低 盛滋科, 徐晓刚 120 简 讯 中国感染与化疗杂志 学术影响力指标不断提升 109 读者 作者 编者 中国感染与化疗杂志 常用缩略语 117 中国感染与化疗杂志 征稿征订启事 119 中国感染与化疗杂志 投稿须知 ⅰ 本期责任编辑 : 曹忆堇英文编辑 : 李胜利 期刊基本参数 :CN /R * 2001 * b * A4 * 120 * zh + en * P * * * 21 *

3 CHINESE JOURNAL OF INFECTION AND CHEMOTHERAPY Bimonthly Established in 2001 Volume 17, Number 1 (Total 93) January 20, 2017 Responsible Institution Ministry of the Education People's Republic of China Sponsor Huashan Hospital, Fudan University 12 Wulumuqi Zhong Road Shanghai , China Editing Editorial Board of Chinese Journal of Infection and Chemotherapy 12 Wulumuqi Zhong Road Shanghai , China Tel: (021) Fax: (021) cjic@fudan.edu.cn http: // Editor-in-Chief ZHANG Yingyuan( 张婴元 ) Associate Editor-in-Chief LI Guanghui( 李光辉 ) JIN Shaohong( 金少鸿 ) LIU Youning( 刘又宁 ) LU Quan( 陆权 ) LUO Wentong( 罗文侗 ) NI Yuxing( 倪语星 ) SHEN Zhixiang( 沈志祥 ) WAN Mobin( 万谟彬 ) Managing Director SHI Yaoguo( 施耀国 ) Publishing Editorial Department of Chinese Journal of Infection and Chemotherapy 12 Wulumuqi Zhong Road Shanghai , China Tel: (021) Fax: (021) Printing Shanghai Ou Yang Printing Co., Ltd. Mail-Order Editorial Department of Chinese Journal of Infection and Chemotherapy 12 Wulumuqi Zhong Road Shanghai , China Tel: (021) Fax: (021) CSSN ISSN CN /R Copyright by Editorial Department of Chinese Journal of Infection and Chemotherapy Original Article CONTENTS Surveillance of bacterial resistance from hospitals in Shanghai during GUO Yan, YANG Yang, ZHU Demei, HU Fupin, WANG Fu, JIANG Xiaofei, WANG Jing, LI Hu, JI Qiang, WANG Min, WANG Chuanqing, WANG Aimin, YING Chunmei, GAO Jing, FANG Yi, PANG Lifeng, YUAN Yiqun, LI Gang, ZHANG Hui, LIU Yajuan, LING Yun, ZHANG Jing, LI Huayin, HUANG Shenglei, CHEN Xianfeng, HU Haiqing, TANG Jin, WU Qiong, LIU Qingzhong, TANG Rong, ZHANG Hong, WANG Chun, SUN Kangde, YU Zhongmin, QU Yuehong, ZHOU Huamin, FU Qihua, HUANG Weichun, NI Yuxing, SUN Jingyong, QIAO Dan, ZHOU Min, ZHANG Haomin, WANG Yaping, YANG Haihui, WEI Yingjue, SUN Qing, XU Weihong, LIU Ying, CHEN Feng, ZHANG Li, QIAN Minjian, ZHU Xueyuan, GONG Wei, WANG Rong, WU Weiyi, TANG Qunli, FENG Jing, LIN Yong,WENG Lizhen, SHEN Zhenhua, LIU Xinghui, WANG Ruizhong, FANG Hua, FAN Huiqing, YAN Yuzhong, CHEN Chao, ZHU Qing, DAI Junhua, KANG Xiangdong, TANG Zhijian, QU Hao, LIU Jun, ZHANG Guoying, SHEN Juying, YAO Rongfeng, MA Chenyun, BIE Lihan, HU Jun, ZHANG Xueqing, QIAO Yun, ZHAO Yingmei, YAN Li, TAO Jianmin, ZHANG Wenyan, YE Yangqin, YUAN Yinghua, LIU Yan, HOU Weiwei, JIANG Lian, LI Na, XING Xiaoyu. Pathogen profile and risk factors of infected diabetic foot ulcers 14 LIN Hong, WANG Xiaoqing, HUANG Lihui, XU Mindan, MA Lin, LAI Renxu. Clinical analysis of 4 patients with Aspergillus tracheobronchitis 19 ZHAO Weiye, LIU Jing, LIU Xuedong. Preliminary study on the efficacy of sequential therapy with nucleotide analogues followed by interferon alpha in chronic hepatitis B patients with low HBsAg level 24 LI Peng, LI Tianju, LI Ziyi, QIN Bo. A new silver amplification immunochromatography system compared with conventional rapid antigen assay for the diagnosis of influenza A and B 29 CHEN Chen, FAN Qingqi, CHEN Gang, ZHU Mengqi, WU Jing, ZHANG Wenhong, JIN Jialin. The role of spo0a gene in growth and sporulation of Clostridium difficile 33 SONG Xiaolei, ZHOU Fenfen, WU Shi, GAO Qiong, HUANG Haihui, CHEN Yijian. Surveillance of antimicrobial resistance in the clinical isolates from Children's Hospital of Chuzhou during CHEN Ling, CAO Mingjie, XIE Qiang, XU Tiantian. Evaluation on the performance of MicroScan WalkAway in detecting carbapenem-resistant Enterobacteriaceae 42 ZHAO Zhichang, LIU Maobai, LI Bin, CHEN Weiyuan, ZHANG Jingling, HUANG Liya, LIU Rui, LIN Qili. Genes conferring quinolone resistance in Shigella flexneri 46 ZHANG Wenxia, ZHANG Jue, CHEN Hongyou, TU Lihong, CHEN Min. Application of carbapenem inactivation method in detection of carbapenemaseproducing Acinetobacter baumannii 52 NIU Cui, YANG Jing, SHI Dongyan. Detection and epidemiology of NDM-type carbapenemase in Esherichia coli 56 WANG Feng, SUN Jingyong, ZHANG Fangfang, YUAN Yiqun. Distribution and antimicrobial resistance profile of the clinical bacterial strains isolated from Beijing Children's Hospital from 2009 to DONG Fang, WANG Yan, LIU Xiqing, ZHEN Jinghui, ZHENG Hongyan, CHANG

4 Mei, ZHEN Yang, ZHANG Qingxiu, SONG Wenqi. Performance and reliability of VITEK-2 Compact GN13 method and its Advanced Expert System validation for testing imipenem susceptibility of Klebsiella pneumoniae 71 LIU Panpan, WANG Lianhui, WEI Dandan, WAN Lagen, LIU Yang. Etiological and antibiotic resistance profile of bloodstream infections in 107 old patients 77 ZHA Xiangyuan, SONG Youliang, JIN Zhengsheng, SHEN Zhiyong, WANG Qian, HU Xiaochun. Translated Article Laboratory diagnosis, clinical management and infection control of the infections caused by extensively drugresistant Gram-negative bacilli: a Chinese consensus statement 82 Chinese XDR Consensus Working Group, X.Guan, L.He, B.Hu, J.Hu, X.Huang, G.Lai, Y.Li, Y.Liu, Y.Ni, H.Qiu, Z.Shao, Y.Shi, M.Wang, R.Wang, D.Wu, C.Xie, Y.Xu, F.Yang, K.Yu, Y.Yu, J.Zhang and C.Zhuo Resistance trends among clinical isolates in China reported from CHINET surveillance of bacterial resistance, F.-P.Hu, Y.Guo, D.-M.Zhu, F.Wang, X.-F.Jiang, Y.-C.Xu, X.-J.Zhang, C.-X.Zhang, P.Ji, Y.Xie, M.Kang, C.-Q.Wang, A.-M.Wang, Y.-H.Xu, J.-L.Shen, Z.-Y.Sun, Z.-J.Chen, Y.-X.Ni, J.-Y.Sun, Y.-Z.Chu, S.-F.Tian, Z.-D.Hu, J.-Li, Y.-S.Yu, J.Lin, B.Shan, Y.Du, Y.Han, S.Guo, L.-H.Wei, L.Wu, H.Zhang, J.Kong, Y.-J.Hu, X.-M.Ai, C.Zhuo, D.-H.Su, Q.Yang, B.Jia and W.Huang Case Report Salmonella london infection in a patient with ovarian cancer: a case report 100 LI Lingxia, YAN Chao, LI Wei, HE Chengyan, XU Xuesong. Neutrophilopenia complicated with Gemella morbillorum infection: one case report 102 FENG Qirong, WANG Li, YIN Xiaolin. Review Research update on the therapeutic drug monitoring of aminoglycosides 104 PENG Xiaolin, FAN Yaxin, ZHANG Liang, CHEN Daijie, ZHANG Jing. Advances in research of central venous catheter-related bloodstream infections in children with malignant hematological diseases 110 WANG Zhen, JIANG Hui. Research updates on quinolone and cephalosporin resistance in non-typhoidal Salmonella 114 XIU Ningning, SUN Chao, ZHUANG Yunjing. Informafion Exchange FDA approves first seasonal influenza vaccine containing an adjuvant 18 YE Meiping, WANG Minggui Interim guidelines for pregnant women during a Zika virus outbreak 23 DING Baixing, WANG Minggui Zika in the western hemisphere 32 SHENG Zike, XU Xiaogang Isavuconazole versus voriconazole 51 DING Baixing, WANG Minggui Zika virus may infect up to people in Colombia: government 55 DING Baixing, WANG Minggui Plasmid-mediated resistance to colistin: present in at least 3 continents 60 SHENG Zike, XU Xiaogang Safety of a single dose of gentamicin in sepsis 70 DING Baixing, WANG Minggui Is your patient encephalopathic because of his or her antibiotic therapy? 99 LI Pei, LIN Dongfang Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae producing OXA-48-like carbapenemases-united States, SHENG Zike, XU Xiaogang New AbbVie hepatitis C regimen shows high cure rates: studies 113 SHENG Zike, XU Xiaogang Hepatitis C virus therapeutic development: in pursuit of perfectovir 118 SHENG Zhen, WANG Minggui Polymyxin B is less nephrotoxic than colistin 120 SHENG Zike, XU Xiaogang

5 1 论著 2015 年上海市细菌耐药性监测 郭燕 1, 杨洋 1, 朱德妹 1, 胡付品 1, 汪复 1, 蒋晓飞 1, 王靖 2, 李虎 2, 吉强 王敏 3, 王传清 4, 王爱敏 4, 应春妹 5, 高晶 5, 方毅 6, 庞立峰 6, 袁轶群 7, 李刚 张慧 8, 刘亚隽 8, 凌云 9, 张菁 9, 李华茵 10, 黄声雷 10, 陈险峰 11, 胡海清 11, 汤瑾 吴琼 12, 刘庆中 13, 汤荣 13, 张泓 14, 王春 14, 孙康德 15, 虞中敏 15, 瞿跃红 16, 周华敏 傅启华 17, 黄卫春 17, 倪语星 18, 孙景勇 18, 乔丹 19, 周敏 19, 张灏旻 20, 汪雅萍 20, 杨海慧 卫颖珏 21, 孙晴 22, 徐伟红 22, 刘瑛 23, 陈峰 23, 张莉 24, 钱敏健 24, 朱学源 25, 龚炜 王蓉 26, 吴唯一 26, 唐群力 27, 冯景 27, 林勇 28, 翁丽珍 28, 沈振华 29, 刘兴晖 29, 汪瑞忠 房华 30, 范惠清 31, 严育忠 31, 陈超 32, 朱卿 32, 戴俊华 33, 康向东 33, 唐之俭 34, 曲浩 刘军 35, 张国英 35, 沈菊英 36, 尧荣凤 36, 马晨芸 37, 别立翰 37, 胡骏 38, 张雪清 38, 乔昀 赵英妹 39, 严丽 40, 陶建敏 40, 张雯雁 41, 叶杨芹 41, 袁应华 42, 刘妍 42, 侯伟伟 43, 江涟 李娜 44, 邢晓宇 44 3, 7, 12, 16, 21, 25, 30, 34, 39, 43, 摘要 : 目的了解 2015 年上海市细菌耐药性监测结果 方法采用纸片扩散法或自动化仪器法对上海市 44 所医院的临床分离菌进行药敏试验, 包括 27 所三级医院 ( 其中含 3 所儿童医院 ) 和 17 所二级医院 采用美国临床和实验室标准化协会 (CLSI)2015 年版标准判断结果 结果 株临床分离菌, 革兰阳性菌 株, 占 29.3 % ; 革兰阴性菌 株, 占 70.7 % MRSA 和 MRCNS 的检出率分别占各自菌种的 46.9 % 和 74.2 % MRSA MRCNS 在二级医院和三级医院的平均检出率分别为 53.6 % 70.3 % 和 44.3 % 75.6 % 葡萄球菌属中未发现万古霉素和利奈唑胺耐药株 株肺炎链球 作者单位 :1. 复旦大学附属华山医院 ; 2. 上海长海医院 ; 3. 东方肝胆外科医院 ; 4. 复旦大学附属儿科医院 ; 5. 复旦大学附属妇产科医院 ; 6. 复旦大学附属华东医院 ; 7. 复旦大学附属金山医院 ; 8. 复旦大学上海市第五人民医院 ; 9. 复旦大学附属肿瘤医院 ; 10. 复旦大学附属中山医院 ; 11. 上海长征医院 ; 12. 上海交通大学附属第六人民医院 ; 13. 上海交通大学附属第一人民医院 ; 14. 上海交通大学附属儿童医院 ; 15. 上海交通大学医学院附属第九人民医院 ; 16. 上海交通大学医学院附属第三人民医院 ; 17. 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 ; 18. 上海交通大学医学院附属瑞金医院 ; 19. 上海交通大学医学院附属瑞金医院北院 ; 20. 上海交通大学医学院附属仁济医院 ( 浦东 ) ; 21. 上海交通大学医学院附属仁济医院 ( 浦西 ); 22. 上海交通大学医学院附属同仁医院 ( 仙霞路院区 ); 23. 上海交通大学医学院附属新华医院 ; 24. 上海市崇明县中心医院 ; 25. 上海市第八人民医院 ; 26. 上海市第二人民医院 ; 27. 上海市奉贤区中心医院 ; 28. 上海市静安区中心医院 ; 29. 上海市浦东新区公利医院 ; 30. 上海市浦东新区人民医院 ; 31. 上海市浦东医院 ; 32. 上海市普陀区人民医院 ; 33. 上海市普陀区中心医院 ; 34. 上海市青浦区中心医院 ; 35. 上海市松江区中心医院 ; 36. 上海市杨浦区中心医院 ; 37. 上海中医药大学附属第七人民医院 ; 38. 上海中医药大学附属龙华医院 ; 39. 上海中医药大学附属曙光医院 ; 40. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 ; 41. 同济大学附属东方医院 ; 42. 同济大学附属第十人民医院 ; 43. 同济大学附属同济医院 ; 44. 中国人民解放军四五五医院 作者简介 : 郭燕 (1982 ) 女, 硕士, 主管技师, 主要从事新抗菌药物药效学评价和细菌耐药性监测 通信作者 : 朱德妹, zhu_dm@fudan.edu.cn

6 2 菌儿童非脑膜炎分离株中青霉素敏感 (PSSP) 中介 (PISP) 和耐药 (PRSP) 株的检出率分别为 77.8 % 13.3 % 和 8.9 % 232 株成人分离株 PSSP PISP 和 PRSP 分别为 88.4 % 5.2 % 和 6.4 % 检出 51 株屎肠球菌和 3 株粪肠球菌耐万古霉素 根据 PCR 测序, 多数耐万古霉素肠球菌为 vana 基因型 大肠埃希菌 克雷伯菌属 ( 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌 ) 和奇异变形杆菌中 ESBL 的检出率分别为 57.0 % 32.3 % 和 41.5 % 上述 ESBL 菌株在二级医院和三级医院的检出率分别为 58.0 % 29.0 % 45.5 % 和 56.5 % 33.9 % 40.2 % 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素仍高度敏感, 对亚胺培南和美罗培南的总耐药率分别为 7.4 % 和 7.7 % 鲍曼不动杆菌 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌和大肠埃希菌中有少数菌株为广泛耐药株 结论细菌耐药性仍对临床构成严重威胁, 需引起高度重视, 避免耐药株的广泛传播 关键词 : 细菌耐药性 ; 药敏试验 ; 广泛耐药中图分类号 :R378 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Surveillance of bacterial resistance from hospitals in Shanghai during 2015 GUO Yan, YANG Yang, ZHU Demei, HU Fupin, WANG Fu, JIANG Xiaofei, WANG Jing, LI Hu, JI Qiang, WANG Min, WANG Chuanqing, WANG Aimin, YING Chunmei, GAO Jing, FANG Yi, PANG Lifeng, YUAN Yiqun, LI Gang, ZHANG Hui, LIU Yajuan, LING Yun, ZHANG Jing, LI Huayin, HUANG Shenglei, CHEN Xianfeng, HU Haiqing, TANG Jin, WU Qiong, LIU Qingzhong, TANG Rong, ZHANG Hong, WANG Chun, SUN Kangde, YU Zhongmin, QU Yuehong, ZHOU Huamin, FU Qihua, HUANG Weichun, NI Yuxing, SUN Jingyong, QIAO Dan, ZHOU Min, ZHANG Haomin, WANG Yaping, YANG Haihui, WEI Yingjue, SUN Qing, XU Weihong, LIU Ying, CHEN Feng, ZHANG Li, QIAN Minjian, ZHU Xueyuan, GONG Wei, WANG Rong, WU Weiyi, TANG Qunli, FENG Jing, LIN Yong, WENG Lizhen, SHEN Zhenhua, LIU Xinghui, WANG Ruizhong, FANG Hua, FAN Huiqing, YAN Yuzhong, CHEN Chao, ZHU Qing, DAI Junhua, KANG Xiangdong, TANG Zhijian, QU Hao, LIU Jun, ZHANG Guoying, SHEN Juying, YAO Rongfeng, MA Chenyun, BIE Lihan, HU Jun, ZHANG Xueqing, QIAO Yun, ZHAO Yingmei, YAN Li, TAO Jianmin, ZHANG Wenyan, YE Yangqin, YUAN Yinghua, LIU Yan, HOU Weiwei, JIANG Lian, LI Na, XING Xiaoyu. (Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai , China) Abstract: Objective To investigate the antimicrobial resistance profile of clinical isolates in Shanghai hospitals during Methods Antimicobial susceptibility testing was carried out for the clinical isolates collected from 44 hospitals ( including 27 class A tertiary hospitals and 17 class B tertiary hospitals/class A secondary hospitals, of which 3 were children hospitals) according to a unified protocol using Kirby-Bauer method or automated systems. Results were analyzed according to CLSI 2015 breakpoints. Results Of the clinical isolates, gram positive cocci and gram negative bacilli accounted for 29.3 % and 70.7 %, respectively. The overall prevalence of MRSA in Staphylococcus aureus was 46.9 % and 74.2 % for MRCNS in coagulasenegative Staphylococcus. The average prevalence of MRSA and MRCNS was 53.6 % and 70.3 % in class B tertiary hospitals/class A secondary hospitals, 44.3 % and 75.6 % in class A tertiary hospitals. No strains were found resistant to vancomycin or linezolid. About 77.8 % of the strains of non-meningitis S. pneumoniae isolated from children were penicillin-susceptible (PSSP), 22.2 % were penicillin-nonsusceptible, including penicillin-intermediate (PISP, 13.3 %) and penicillin-resistant (PRSP, 8.9 %) strains. Of the 232 strains isolated from adults, 88.4 %, 5.2 % and 6.4 % were PSSP, PISP and PRSP, respectively. Overall, 51 strains of vacomycinresistant E. feacium and 3 strains of vacomycin-resistant E. feacalis were identified. According to PCR results, most of these resistant strains were vana type based on their phenotype. The overall prevalence of ESBLs-producing srains was 57.0 % in E. coli, 32.3 % in Klebsiella spp. (K. pneumoniae and K. oxytoca) and 41.5 % in P. mirabilis. Specifically, the prevalence of such strains was 58.0 %, 29.0 % and 45.5 % in class B tertiary hospitals/class A secondary hospitals, 56.5 %, 33.9 % and 40.2 % in class A tertiary hospitals, respectively. Enterobacteriaceae strains were still highly susceptible to carbapenem antibiotics. Overall, 7.4 % and 7.7 % of the Enterobacteriaceae strains were resistant to imipenem and meropenem, respectively. A few extensively drug-resistant strains were identified in A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, and E. coli. Conclusions It seems that antibicotic resistance is increasing in the clinical isolates. More attention should be paid to preventing the spread of drug resistant strains.

7 3 Key words: bacterial resistance; antimicrobial susceptibility testing; extensively drug-resistant microorganism 本文报道 2015 年上海市细菌耐药性监测网 (44 所单位 ) 按统一方案进行的细菌耐药性监测结果 1 材料与方法 1.1 材料 细菌收集 2015 年 1 月 1 日 2015 年 12 月 31 日期间, 上海市 44 所医院 ( 其中三级医院 27 所 二级医院 17 所 ) 临床分离的 株细菌, 剔除同一患者相同部位的重复菌株 ; 凝固酶阴性葡萄球菌和草绿色链球菌只收集分离自血液 脑脊液和无菌体液标本的菌株 按统一方案进行药物敏感性试验 抗菌药物药敏试验纸片为英国 OXOID 公司或美国 BBL 公司商品 ; 部分医院采用自动化仪器测定临床分离株对抗菌药物的敏感性 β 内酰胺酶测定用的头孢硝噻吩纸片 ESBL 确认试验用的头孢噻肟 - 克拉维酸和头孢他啶 - 克拉维酸纸片均为 BBL 公司商品 用于鉴定肺炎链球菌耐药性的青霉素 E 试验条为法国生物梅里埃公司商品 培养基药敏试验培养基为 MH 琼脂 肺炎链球菌和各组链球菌 卡他莫拉菌用含 5 % 脱纤维羊血 MH 琼脂 流感嗜血杆菌用嗜血杆菌属培养基 (HTM) 加 SR0158 营养补充剂 上述培养基和试剂均为英国 OXOID 公司商品 1.2 方法 [1] 药敏试验采用 CLSI 2015 年版推荐的纸片扩散法或自动化仪器法进行药物敏感性试验并判断结果 磷霉素纸片法仅用于测定分离自尿标本的大肠埃希菌和粪肠球菌 质控菌株为金黄色葡萄球菌 ( 金葡菌 )ATCC 25923( 纸片法 ) ATCC 29213( 商品化仪器 ), 大肠埃希菌 ATCC 25922, 铜绿假单胞菌 ATCC 27853, 肺炎链球菌 ATCC 49619, 流感嗜血杆菌 ATCC ATCC β 内酰胺酶的检测采用头孢硝噻吩纸片测定流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的 β 内酰胺酶 按 [2] CLSI 2012 年版推荐的酶抑制剂增强试验筛选和确证大肠埃希菌 克雷伯菌属 ( 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌 ) 和奇异变形杆菌中产 ESBL 菌株 青霉素不敏感肺炎链球菌的检测经苯唑 西林纸片法测定其抑菌圈直径 19 mm 的肺炎链球菌菌株, 采用青霉素 E 试验条测定其对肺炎链球菌的 MIC 脑膜炎分离株和非脑膜炎株分别按 CLSI 2015 年标准判定为青霉素敏感 (PSSP) 中介 (PISP) 和耐药 (PRSP) 万古霉素 替考拉宁或利奈唑胺不敏感革兰阳性菌的检测纸片法或仪器法检测到对上述不敏感的革兰阳性菌经菌种复核无误后, 采用相应 E 试验条测定其 MIC 值, 或采用 PCR 方法检测和分析耐药基因型 广泛耐药 (XDR) 菌株的检测 XDR 定义为除黏菌素和替加环素外, 对其他测试的抗菌药物全耐药者 [3] 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 (CRE) 的检测对亚胺培南和美罗培南中任何一种耐药的肠杆菌科细菌为 CRE [4] 人群分类儿童分离株指分离自儿童医院 儿科医院 儿童医学中心以及综合性医院中年龄 17 岁或以下患儿分离的细菌 ; 成人分离株指分离自综合性医院中年龄 18 岁或以上患者分离的细菌 统计分析用 WHONET 5.6 软件对纸片法的抑菌圈直径药敏结果和仪器法 MIC 值药敏结果进行数据处理和分析 2 结果 2.1 细菌分布 2015 年共检测 株临床分离株, 具体临床分离株见表 1 其中 株 (70.2 %) 分离自 27 所三级医院, 株 (29.8 %) 分离自 17 所二级医院 革兰阳性菌占 29.3 % (31 585/ ), 革兰阴性菌占 70.7 %(76 268/ ) 革兰阴性菌中肠杆菌科细菌占 64.4 % (49 116/76 268), 不发酵糖革兰阴性杆菌占 33.0 % (25 192/76 268), 其他革兰阴性菌 ( 嗜血杆菌属 弧菌属等 ) 占 2.6 %(1 960/76 268) 革兰阳性菌中金葡菌占 33.4 %(10 547/31 585), 凝固酶阴性葡萄球菌占 14.6 %(4 602/31 585), 肠球菌属占 32.7 %(10 337/31 585), 链球菌属占 19.3 %(6 095/31 585) 住院患者分离株占 86.7 %(93 551/ ), 门 急诊患者分离株占

8 4 表 株临床分离株的分布 Table 1 Distribution of clinical isolates by bacterial species Microorganism Total Class A Tertiary hospitals Class B Tertiary hospitals/class A Secondary hospitals No. of isolates % No. of isolates % No. of isolates % Gram negative E. coli Klebsiella spp Acinetobacter spp P. aeruginosa Enterobacter spp Proteus spp S. maltophilia Haemophilus spp Serratia spp Citrobacter spp Salmonella spp Morganella spp Burkholderia spp Aeromonas spp Moraxella spp Achromobacter spp Chryseobacterium spp Raoultella spp Elizabethkingia spp Providencia spp Other gram negative organisms a Gram positive S. aureus Enterococcus spp Coagulase-negative Staphylococcus a Beta-hemolytic Streptococcus Stretococcus pneumoniae Streptococcus viridans b Other gram positive organisms Total a Including other pseudomonas spp, Vibrio spp., Listeria spp., other Streptococcus spp., etc. b Clinical isolates from blood and sterile body fluids %(14 302/ ) 住院患者 门急诊患者的分离株在三级医院和二级医院中分别占 83.1 % (62 923/75 685) 16.9 %(12 762/75 685) 和 95.2 %(30 628/32 168) 4.8 %(1 540/32 168) 细菌在各类标本中的分布为呼吸道分泌物 42.0 %(45 302/ ) 尿液 26.6 %(28 699/ ) 血液 9.7 %(10 459/ ) 伤口脓液 6.1 %(6 629/ ) 各种无菌体液 ( 胆汁 胸水 腹水 脑脊液等 )4.7 %(5 095/ ) 生殖道分泌液和粪便等 2.1 %(2 259/ ) 其他标本 8.7 %(9 410/ ) 二级医院呼吸道分泌物 尿液标本的检出率高于三级医院 (44.2 % 29.1 % 对 41.1 % 25.6 %), 而血标本的构成比二级医院低于三级医院 (8.8 % 对 10.1 %) 呼吸道标本中最常见的分离菌为克雷伯菌属 不动杆菌属 铜绿假单胞菌和金葡菌等 ; 大肠埃希菌和肠球菌属是尿液和脑脊液等无菌体液标本中的主要分离菌 ; 凝固酶阴性葡萄球菌是血培养标本中的主要分离菌 ; 粪便中沙门菌属占 86.6 % 门急诊患者中主要分离菌为大肠埃希菌

9 %(4 541/14 302) 化脓性链球菌 16.8 % 克雷伯菌属 7.4 % 和金葡菌 7.2 % 住院患者中则为大肠埃希菌 19.8 %(18 537/93 551) 克雷伯菌属 14.9 % 不动杆菌属 10.8 % 和铜绿假单胞菌 10.0 % 2.2 耐药菌的检出率 甲氧西林耐药葡萄球菌 株金葡菌中 MRSA 的检出率为 46.9 % 儿童组的检出率为 30.7 %(714/2 322), 成人组的检出率为 51.4 % (4 215/8 207); 三级医院和二级医院分离的金葡菌中 MRSA 的检出率分别为 44.3 % 和 53.6 % 株凝固酶阴性葡萄球菌中,MRCNS 的检出率为 74.2 % 儿童组和成人组中 MRCNS 的检出率分别为 82.5 %(1 246/1 511) 和 76.3 %(2 297/3 011); 三级医院和二级医院菌株中 MRCNS 的检出率分别为 75.6 % 和 70.3 % 青霉素耐药肺炎链球菌 株肺炎链球菌中儿童组 株, 成人组 320 株 其中 株为非脑膜炎肺炎链球菌,14 株为脑膜炎分离株 9 株儿童脑膜炎肺炎链球菌中 4 株 PSSP 和 2 株 PRSP ;2 株成人脑膜炎肺炎链球菌 株非脑膜炎肺炎链球菌中 株青霉素 E 试验检测具有青霉素 MIC 结果, 其中儿童组 株, 成人组 232 株 儿童株中 PSSP PISP 和 PRSP 分别为 77.8 % 13.3 % 和 8.9 % 成人分离株 PSSP PISP 和 PRSP 分别为 88.4 % 5.2 % 和 6.4 % 万古霉素耐药肠球菌 (VRE) 株肠球菌属细菌中粪肠球菌 株 (56.0 %) 屎肠球菌 株 (38.6 %), 其他肠球菌属 555 株 (5.4 %) 株屎肠球菌中有 51 株万古霉素耐药株 (1.3 %);3 株万古霉素耐药屎肠球菌分离自二级医院, 其余分离自三级医院 株粪肠球菌中 3 株为万古霉素耐药株 (0.1 %), 均分离自三级医院 其中 26 株万古霉素耐药屎肠球菌经 PCR 检测为 vana (23 株 ) 和 vanm(3 株 ) 基因型的菌株 产 ESBL 肠杆菌科细菌的检出率 44 所医院中有 34 所医院 ( 含 1 所儿童医院 ) 对大肠埃希菌 克雷伯菌属 ( 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌 ) 和奇异变形杆菌进行了 ESBL 的检测 检出率分别为 57.0 %(36.9 %~73.0 %) 32.3 % (12.9 %~52.6 %) 和 41.5 %(25.6 %~68.4 %) 二级医院中上述 3 种细菌产 ESBL 菌株的检出率分别为 58.0 % 29.0 % 和 45.5 % ; 而三级医院的检出率分别为 56.5 % 33.9 % 和 40.2 % CRE 菌株的检出率 株肠杆菌科细菌中共检出 CRE 株 (7.6 %), 其中三级医院检出率为 8.8 %(2 928/33 152), 二级医院为 5.2 %(829/15 964); 儿童患者中检出率为 9.4 % (616/6 550), 成人组中为 7.4 %(3 141/42 565) 22.0 %(762/3 467) 的 CRE 菌株分离自 ICU 克雷伯菌属 (2 633/3 757,70.1 %) 大肠埃希菌 (408/3 757,10.9 %) 和肠杆菌属 (266/3 757,7.1 %) 是 CRE 的主要菌群 革兰阴性杆菌中 XDR 菌株的检出率 2015 年 XDR 菌株在鲍曼不动杆菌 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌和大肠埃希菌中分别为 541 株 (17.7 %) 177 株 (4.2 %) 60 株 (2.0 %) 和 14 株 (0.2 %) 其中三级医院分别为 442 株 154 株 50 株和 11 株, 二级医院中分别为 99 株 23 株 10 株和 3 株 2.3 革兰阳性菌对抗菌药物的耐药率 葡萄球菌属金葡菌中 MRSA 对各类受试抗菌药物的耐药率均明显较 MSSA 为高, 但其对利福平和甲氧苄啶 - 磺胺甲唑的耐药率较低 MSSA 除对青霉素和红霉素的耐药率较高外, 对 β 内酰胺类 庆大霉素 利福平以及左氧氟沙星 克林霉素和甲氧苄啶 - 磺胺甲唑的耐药率均 12.7 % ;MRCNS 对上述 4 种抗菌药物的耐药率亦均较 MSCNS 明显为高 MRCNS 对上述 4 种抗菌药物的耐药率较 MRSA 为低, 但 MRCNS 对利奈唑胺 利福平和甲氧苄啶 - 磺胺甲唑的耐药率较 MRSA 为高 金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中均未发现对万古霉素耐药的菌株 二级医院 MRSA 菌株对庆大霉素 左氧氟沙星 克林霉素和红霉素的耐药率高于三级医院 三级医院 MRCNS 对利奈唑胺和利福平的耐药率高于二级医院, 见表 肠球菌属粪肠球菌对氨苄西林和呋喃妥因等大多数受试抗菌药物的耐药率较屎肠球菌低 两者对高浓度庆大霉素的耐药率分别为 34.5 % 和 42.7 %, 对左氧氟沙星的耐药率分别为 38.6 % 和 87.6 % 分离自尿标本中的粪肠球菌对磷霉素的耐药率为 7.7 % 粪肠球菌和屎肠球菌中均已出现对万古霉素耐药的菌株, 耐药率分别为 0.1 % 和 1.4 % ; 同时也发现个别菌株对利奈唑胺耐药 二级医院的粪肠球菌对多数受试抗菌药物包括呋喃妥因 氨苄西林 高浓度庆大霉素 左氧氟沙星的耐药率均高于三级医院, 见表 3

10 6 Antibiotic 表 2 葡萄球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 2 Susceptibility of Staphylococcus spp. to antimicrobial agents Total Class A Tertiary hospitals MRSA(n=4 949) MSSA(n=5 598) MRCNS(n=3 363) MSCNS(n=1 172) MRSA(n=3 369) MSSA(n=4 228) R S R S R S R S R S R S ( %) Vancomycin Linezolid Penicillin Oxacillin Gentamicin Rifampin Levofloxacin Clindamycin Erythromycin Trimethoprim-sulfamethoxazole Antibiotic Class A Tertiary hospitals Class B Tertiary hospitals/class A Secondary hospital MRCNS(n=2 502) MSCNS(n=809) MRSA(n=1 580) MSSA(n=1 370) MRCNS(n=861) MSCNS(n=363) R S R S R S R S R S R S Vancomycin Linezolid Penicillin Oxacillin Gentamicin Rifampin Levofloxacin Clindamycin Erythromycin Trimethoprim-sulfamethoxazole 表 3 肠球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 3 Susceptibility of Enterococcus spp. to antimicrobial agents E. faecalis E. faecium ( %) Antibiotic Total (n=5 790) Class A Tertiary hospitals (n=4 090) Class B Tertiary hospitals/ Class A Secondary hospitals (n=1 700) Total (n=3 992) Class A Tertiary hospitals (n=2 860) Class B Tertiary hospitals/ Class A Secondary hospitals (n=1 132) R S R S R S R S R S R S Vancomycin Teicoplanin Linezolid Nitrofurantoin Ampicillin Gentamicin (120 μg) Levofloxacin Fosfomycin a NA NA NA NA NA NA a Only the isolates from urine specimen were tested. NA, not available.

11 肺炎链球菌肺炎链球菌非脑膜炎株无论是儿童患者分离株还是成人患者分离株, 无论是 PSSP 还是 PISP 和 PRSP 菌株对红霉素和克林霉素的耐药率均很高, 达 80.8 % 或以上 该类菌株 对左氧氟沙星的耐药率, 成人株为 5.4 %~8.3 %, 较儿童株 (0~0.2 %) 为高 ; 但两者均未发现对 万古霉素和利奈唑胺耐药株, 见表 4 表 4 非脑膜炎肺炎链球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 4 Susceptibility of nonmeningtis S. pneumoniae to antimicrobial agents ( %) Isolates from adults Isolates from children Antibiotic PSSP(n=205) PISP(n=12) PRSP(n=15) PSSP(n=794) PISP(n=136) PRSP(n=91) R S R S R S R S R S R S Penicillin Vancomycin Linezolid Erythromycin Clindamycin Trimethoprim-sulfamethoxazole Levofloxacin Moxifloxacin PSSP :penicillin-susceptible Streptococcus pneumoniae ;PISP :penicillin-intermediate Streptococcus pneumoniae ;PRSP :penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae 溶血链球菌 株 β 溶血链球菌中主要是 A 组 (2518 株,59.3 %) 和 B 组 (1 517 株,35.7 %), 少数为 C 组 (191 株 ) 和其他 β 溶血链球菌 (19 株 ) 各组 β 溶血链球菌对青霉素和头孢曲松均很敏感, 未见耐药株 ; 但对红霉素和克林霉素耐药率均很高, 其中以 A 组的耐药率 ( 95.5 %) 为最高 除 B 组对左氧氟沙星的耐药率为 33.5 % 外, 其他各组链球菌对左氧氟沙星的耐药率为 0.2 %~10.9 % 自血液 脑脊液等无菌体液分离的草绿色链球菌对青霉素的耐药率为 5.9 % 该属细菌中未发现万古霉素和利奈唑胺耐药株, 见表 5 表 5 溶血链球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 5 Susceptibility of hemolytic Streptococcus to antimicrobial agents ( %) Antibiotic S. viridans (n=443) β- hemolytic Streptococcus Group A (n=2 518) Group B (n=1 517) Group C (n=191) R S R S R S R S Penicillin Ceftriaxone Vancomycin Linezolid Erythromycin Clindamycin Levofloxacin 革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率 肠杆菌科细菌 株肠杆菌科细菌中多数菌株对亚胺培南和美罗培南仍呈现敏感, 但不同菌种的耐药率有差异 其中大肠埃希菌对上述 2 种碳青霉烯类的耐药率分别为 1.3 % 和 2.2 %, 克 雷伯菌属的耐药率为 17.1 % 和 19.0 % 其他肠杆菌科细菌的耐药率大多 <10 % ; 但其中变形杆菌属 摩根菌属和普罗威登菌属细菌对亚胺培南的耐药率显著高于对美罗培南的耐药率, 见表 6 大肠埃希菌 克雷伯菌属 ( 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯

12 8 菌 ) 以及奇异变形杆菌中产 ESBL 菌株对受试抗菌药物的耐药率均显著高于非产 ESBL 株 分离自尿标本中的大肠埃希菌, 包括产 ESBL 和不产 ESBL 株对磷霉素的耐药率较低 (<13 %), 见表 7 肠 炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌对氨苄西林的耐药率均在 72.2 % 以上, 两者对头孢曲松的耐药率 <20 % ; 宋内志贺菌对氯霉素的敏感率为 96.9 %, 见表 8 肠杆菌科细菌对临床常用抗菌药物的耐药率, 见表 9 表 6-1 大肠埃希菌和克雷伯菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 6-1 Susceptibility of E.coli and Klebsiella spp. to antimicrobial agents E. coli Klebsiella spp ( %) Antibiotic Total (n=23 078) Class A Tertiary hospitals (n=15 611) Class B Tertiary hospitals/ Class A Secondary hospitals (n=7 467) Total (n=15 013) Class A Tertiary hospitals (n=10 071) Class B Tertiary hospitals/ Class A Secondary hospitals (n=4 932) R S R S R S R S R S R S Imipenem Meropenem Cefepime Ceftazidime Cefotaxime Cefoperazonesulbactam Piperacillin Piperacillintazobactam Cefuroxime Cefazolin Cefmetazole Ampicillin Ampicillinsulbactam Amikacin Gentamicin Ciprofloxacin Trimethoprimsulfamethoxazole Fosfomycin a NA NA NA NA NA NA a Only the isolates from urine specimen were tested. NA, not available. 表 6-2 肠杆菌属和变形杆菌属细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 6-2 Susceptibility of Enterobacter spp. and Proteus spp. to antimicrobial agents Enterobacter spp Proteus spp ( %) Antibiotic Class A Tertiary Class B Tertiary hospitals/ Class A Tertiary Class B Tertiary hospitals/ Total Total hospitals Class A Secondary hospitals hospitals Class A Secondary hospitals (n=4 178) (n=3 024) (n=2 818) (n=1 360) (n=2 046) (n=978) R S R S R S R S R S R S Imipenem a 88.1 a 5.2 a 91.0 a 3.6 a 84.9 a Meropenem Ertapenem Cefepime Ceftazidime Cefotaxime

13 9 Enterobacter spp 表 6-2( 续 ) Table 6-2(continued) Proteus spp ( %) Antibiotic Class A Tertiary Class B Tertiary hospitals/ Class A Tertiary Class B Tertiary hospitals/ Total Total hospitals Class A Secondary hospitals hospitals Class A Secondary hospitals (n=4 178) (n=3 024) (n=2 818) (n=1 360) (n=2 046) (n=978) R S R S R S R S R S R S Cefoperazonesulbactam Piperacillin Piperacillintazobactam Cefuroxime Cefazolin Cefmetazole Ampicillin Ampicillinsulbactam Amikacin Gentamicin Ciprofloxacin Trimethoprimsulfamethoxazole a Results by Kirby-Bauer disk diffusion method. Antibiotic 表 6-3 其他肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 6-3 Susceptibility of other Enterobacteriaceae species to antimicrobial agents Serratia spp (n=1 328) Citrobacter spp (n=880) Morganella spp (n=570) Providencia spp (n=121) R S R S R S R S Imipenem a 56.6 a 23.4 a 62.5 a Meropenem Ertapenem Cefepime Ceftazidime Cefotaxime Cefoperazone-sulbactam Piperacillin Piperacillin-tazobactam Cefuroxime Cefazolin Cefmetazole Ampicillin Ampicillin-sulbactam Amikacin Gentamicin Ciprofloxacin Trimethoprim-sulfamethoxazole a Results by Kirby-Bauer disk diffusion method. ( %)

14 10 Table 7 表 7 产和非产 ESBL 的大肠埃希菌 克雷伯菌属和奇异变形杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Susceptibility of ESBLs-producing and non-esbls-producing E.coli, Klebsiella spp. and Proteus mirabilis strains to antimicrobial agents (%) E. coli Klebsiella spp Proteus mirabilis Antibiotic ESBLs+ (n=9 397) ESBLs- (n=7 083) ESBLs+ (n=3 435) ESBLs- (n=7 214) ESBLs+ (n=350) ESBLs- (n=493) R S R S R S R S R S R S Imipenem Meropenem Cefepime Ceftazidime Cefotaxime Piperacillin Cefuroxime Cefazolin Cefmetazole Ampicillin Amikacin Gentamicin Ciprofloxacin Cefoperazonesulbactam Piperacillintazobactam Ampicillinsulbactam Trimethoprimsulfamethoxazole Fosfomycin a a Only the isolates from urine specimen were tested. 表 8 沙门菌属 志贺菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 8 Susceptibility of Salmonella spp. and Shigella spp. to antimicrobial agents ( %) Salmonella spp Shigella spp Antibiotic S. enteritidis (n=236) S. typhimurium (n=264) S. flexneri (n=9 a ) S. sonnei (n=36) R S R S R S R S Ampicillin Ampicillin-sulbactam Ceftriaxone Ciprofloxacin Chloramphenicol Trimethoprim-sulfamethoxazole a Number of strains presented instead of percentage when the strains tested are less than 10.

15 11 Antibiotic 表 9 肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 9 Susceptibility of Enterobacteriaceae species to antimicrobial agents Total (n=49 116) Class A Tertiary hospitals (n=33 152) ( %) Class B Tertiary hospitals/class A Secondary hospitals (n=15 964) R S R S R S Meropenem Imipenem Amikacin Piperacillin-tazobactam Cefoperazone-sulbactam Cefepime Ceftazidime Ciprofloxacin 不发酵糖革兰阴性杆菌 株铜绿假单胞菌对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别为 26.4 % 和 27.6 %, 对其他测试药物的耐药率多数在 9.1 %~26.6 % 株不动杆菌属中主要是鲍曼不动杆菌 (91.5 %) 不动杆菌属对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达 56.5 % 和 57.8 % 该菌除对头孢哌酮 - 舒巴坦和米诺环素的耐药率分别为 38.0 % 和 31.0 % 外, 对其他测试抗菌药物的耐药率均近 50 % 或以上, 见表 10-1 洋葱伯克霍尔德菌对 CLSI 推荐的 4 种抗菌药物的耐药率 25.2 % 嗜麦芽窄食单胞菌对 CLSI 推荐的 3 种抗菌药物高度敏感, 耐药率均 9.4 %, 见表 10-2 表 10-1 不发酵糖革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 10-1 Susceptibility of non-fermentative gram-negative bacilli to antimicrobial agents P. aeruginosa Acinetobacter spp ( %) Antibiotic Total (n=10 011) Class A Tertiary hospitals (n=6 827) Class B Tertiary hospitals/ Class A Secondary hospitals (n=3 184) Total (n=10 625) Class A Tertiary hospitals (n=7 234) Class B Tertiary hospitals/ Class A Secondary hospitals (n=3 391) R S R S R S R S R S R S Imipenem Meropenem Cefepime Ceftazidime Aztreonam NA NA NA NA NA NA Cefoperazone NA NA NA NA NA NA Cefoperazonesulbactam Piperacillin Piperacillintazobactam Ampicillinsulbactam NA NA NA NA NA NA Gentamicin Amikacin Ciprofloxacin Trimethoprimsulfamethoxazole NA NA NA NA NA NA Minocycline NA NA NA NA NA NA Colistin Polymycin B NA NA NA NA NA NA NA, not available.

16 12 表 10-2 不发酵糖革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 10-2 Susceptibility of non-fermentative gram-negative bacilli to antimicrobial agents (%) Antibiotic B. cepacia (n=356) S. maltophilia (n=2 827) R S R S Meropenem NA NA Ceftazidime NA NA Cefoperazone-sulbactam a NA NA Piperacillin-tazobactam b NA NA Levofloxacin NA NA Trimethoprim-sulfamethoxazole Minocycline a according to the breakpoint of cefoperazone against P. aeruginosa in 2010 CLSI guideline [5]. b according to the breakpoint of piperacillin against P. aeruginosa. NA, not available 其他革兰阴性菌 流感嗜血杆菌 株流感嗜血杆菌中成人分离株 323 株, 儿童分离株 883 株 ; 其中 β 内酰胺酶的检出率为 42.3 % 儿童株和成人株中酶的检出率分别为 36.0 % 和 44.2 % 儿童株和成人株中对头孢曲松 左氧氟沙星和阿奇霉素均高度敏感, 敏感率 85.6 % 成人株对氨苄西林 氨苄西林 - 舒巴坦 头孢呋辛和甲氧苄啶 - 磺胺甲唑的耐药率均低于儿童株, 见表 卡他莫拉菌 237 株卡他莫拉菌主要为儿童分离株 (189 株 ), 其 β 内酰胺酶的检出率为 93.1 % 对甲氧苄啶- 磺胺甲唑的敏感率高达 93.3 %, 对红霉素和阿奇霉素的耐药率在 30 % 左右 3 讨论 参加 2015 年上海市细菌耐药性监测网的医院比 2014 年 (40 所医院 ) 增加了 5 所医院, 原有 1 [6] 所医院不纳入统计 与 2014 年相比,2015 年的资料有以下特点 : 株细菌中, 革兰阴性菌占 70.7 %, 较 2014 年的 73.1 % 有所下降 ; 革兰阳性菌 29.3 %, 较 2014 年的 26.9 % 有所增加 ; 肠杆菌科细菌中沙门菌属有所增多, 但除变形杆菌属和普罗威登菌属外的肠杆菌科细菌均有所减少 ; 铜绿假单胞菌 其他假单胞菌属和伯克霍尔德菌属有所下降 革兰阳性菌中肠球菌属有所减少 ; 金葡菌 β 溶血链球菌 肺炎链球菌和 α 溶血 表 11 流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 11 Susceptibility of Haemophilus influenzae to antimicrobial agents ( %) Antibiotic Total (n=1 206) 链球菌有所增加 2 门急诊患者分离菌 (13.3 %) 较 2014 年 (11.5 %) 稍有增加, 但住院患者分离 菌 (86.7 %) 较 2014 年 (88.5 %) 略有减少 3 呼吸道分离菌 (42.0 %) 较 2014 年 (41.5 %) 略 有增加 ; 尿液分离菌 (26.6 %) 较 2014 年 (27.1 %) 略有减少 4 葡萄球菌中 MRSA 的检出率为 46.9 %, 较 2014 年的 47.4 % 稍有下降,MRCNS 为 74.2 %, 较 2014 年的 79.8 % 有所下降 ; 万古霉 素耐药屎肠球菌的检出率 (1.4 %) 略低于 2014 年 (2.0 %); 儿童非脑膜炎分离株中 PSSP 的检出率 (77.8 %) 较 2014 年 (70.1 %) 有显著增高 (P<0.01); PRSP 的检出率 (8.9 %) 较 2014 年 (15.4 %) 有 所下降 ; 奇异变形杆菌中 ESBL 的检出率较 2014 年有所上升 ; 鲍曼不动杆菌 肺炎克雷伯菌 铜 绿假单胞菌和大肠埃希菌中仍检出少数 XDR 菌株, 其中 XDR 鲍曼不动杆菌的检出率 (17.7 %) 较 2014 年 (15.4 %) 有所升高 Isolates from Adults (n=323) Isolates from children (n=883) R S R S R S Ampicillin Ampicillinsulbactam Amoxicillinclavulanic acid Cefuroxime Ceftriaxone Levofloxacin Azithromycin Chloramphenicol Trimethoprimsulfamethoxazole Overall, 42.3 % of the H. influenzae strains, specifically, 36.0 % of the trains from adults and 44.2 % of the trains from children were betalactamases producers. 二级医院和三级医院在分离菌和标本分布 耐 药菌株以及细菌的耐药率与以往资料相比存在明 显的差异 1 三级医院分离的革兰阳性菌 (31.3 %) 多于二级医院 (24.6 %), 革兰阴性菌 (68.8 %) 少于二级医院 (75.4 %); 二级医院住院患者分离 菌 (95.2 %) 高于三级医院 (83.1 %), 门急诊患

17 13 者分离菌 (4.8 %) 低于三级医院 (16.9 %) 2 二 级医院中, 常见的革兰阴性分离菌如大肠埃希菌 克雷伯菌属 不动杆菌属 铜绿假单胞菌 肠杆 菌属 变形杆菌属和沙雷菌属等较三级医院多见 ; 而嗜麦芽窄食单胞菌 嗜血杆菌属 沙门菌属 伯 克霍尔德菌属 卡他莫拉菌 各种 β 溶血链球菌 和肺炎链球菌等苛养菌在二级医院中少见 在标 本分布上, 二级医院分离自呼吸道分泌物的菌株 数占 44.2 %, 高于三级医院 (41.1 %), 而血标本 二级医院 (8.8 %) 低于三级医院 (10.1 %) 耐药 细菌的检出率显示 :1 二级医院的 MRSA 检出率 (53.6 %) 高于三级医院 (44.3 %);2 但二级医院 中万古霉素耐药粪肠球菌显著较三级医院少见 ; 3 二级医院的大肠埃希菌和奇异变形杆菌中 ESBL 检出率 (58.0 % 和 45.5 %) 高于三级医院 (56.5 % 和 40.2 %), 但克雷伯菌属 ESBL 检出率三级医院 (33.9 %) 高于二级医院 (29.0 %);4 CRE 菌株 三级医院检出率 (8.8 %) 高于二级医院 (5.2 %); 5 XDR 革兰阴性杆菌三级乙等 / 二级甲等医院较 为少见 二级医院中大多细菌对受试抗菌药物的 耐药率高于三级医院 如 :1 MRSA 株对庆大霉素 左氧氟沙星 克林霉素以及甲氧苄啶 - 磺胺甲 的耐药率 ;2 MRCNS 株对左氧氟沙星和甲氧苄 啶 - 磺胺甲 唑 唑的耐药率 ;3 肠球菌属细菌对呋喃 妥因 左氧氟沙星和磷霉素的耐药率 ;4 肠杆菌 科细菌对头孢吡肟和环丙沙星的耐药率 ;5 铜绿 假单胞菌对头孢吡肟 头孢他啶 氨曲南 头孢 哌酮 庆大霉素和环丙沙星的耐药率 三级医院 分离的不动杆菌属细菌对抗菌药物的耐药率除对 米诺环素 (31.0 % 对 32.4 %) 外, 大多较二级医 院细菌的耐药率高 在全球临床分离菌耐药日益严重的严峻形势 下,( 多 ) 黏菌素被认为是对抗多重耐药革兰阴 性菌治疗的最后一道防线 在早期的药效学评价 中, 该药抗菌活性优异, 对碳青霉烯类敏感 / 耐药 的大肠埃希菌的 MIC 50 为 0.125~1 mg/l,mic 90 为 0.5~2 mg/l ; 其对肺炎克雷伯菌的 MIC 50 为 0.25~2 mg/l,mic 90 为 0.5~2 mg/l 2015 年 Oteo 等 [7] 报道 379 株产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌 对 ( 多 ) 黏菌素的敏感率亦高达 95.5 % 当 ( 多 ) 黏菌素成为目前对付多重耐药革兰阴性菌感染的 最后可用药物后, 耐药问题接踵而来 2015 年 11 月 18 日 LIU 等 [8] 发表对 ( 多 ) 黏菌素耐药性的研 究成果 携带 MCR-1 基因的菌株对 ( 多 ) 黏菌素 表现出高度耐药性 该耐药基因由质粒介导, 可以在不同细菌间进行水平转移, 造成耐药菌的暴发感染 研究者对 420 株肺炎克雷伯菌和 株大肠埃希菌进行了 MCR-1 基因的测定, 结果显示耐药基因检出率分别为 0.7 % 和 1.4 %~20.6 % 该基因在正常健康人的肠道细菌中也存在, 提示 MCR-1 基因可能通过食物链传播给人类 本文监测资料中铜绿假单胞菌和不动杆菌属中已出现对 ( 多 ) 黏菌素的耐药株, 检出率为 1 %~2.2 % 虽然目前该类细菌耐药株数不多, 仍需引起重视, 并采取适当的控制措施 综上所述, 细菌耐药性依然严重, 应引起高度重视, 对重要病原菌坚持流行病学调查和细菌耐药性监测, 有助于临床合理使用抗菌药物 ; 并采取有效的感控措施防止耐药菌流行或引起大范围播散, 仍是当务之急 参考文献 [1] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S]. Twenty- Fifth Informational Supplement,2015,M100-S25. [2] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S]. Twenty- Second Informational Supplement,2012,M100-S22. [3] FALAGAS ME,KARAGEORGOPOULOS DE. Pandrug resistance (PDR),extensive drug resistance (XDR),and multidrug resistance (MDR)among Gram-negative bacilli : need for international harmonization in terminology[j]. Clin Infect Dis,2008,46(7): [4] CDC. FAQS about choosing and implementing a CRE definition [ED/OL]. [ ]. http :// definition.html. [5] Chinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S]. Twentieth Informational Supplement, 2010, M100-S20. [6] 郭燕, 杨洋, 朱德妹, 等 年上海市细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,2016,16(2): [7] O T E O J, O RT E G A A, B A RT O L O M É R, e t a l. Prospective multicenter study of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae from 83 hospitals in Spain reveals high in vitro susceptibility to colistin and meropenem[j]. Antimicrob Agents Chemother,2015,59(6): [8] LIU YY,WANG Y,WALSH TR,et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China :a microbiological and molecular biological study[j]. Lancet Infect Dis,2016,16(2): 收稿日期 : 修回日期 :

18 14 论著 糖尿病足部溃疡感染病原菌特点及相关因素分析 林红, 汪小清 *, 黄丽辉, 徐敏丹, 马琳, 赖人旭 ** 摘要 : 目的探讨糖尿病足部溃疡感染病原菌的特点以及相关危险因素, 并针对相关因素提出预防及干预措施, 以促进患者早日康复 方法回顾性分析 2012 年 2 月至 2014 年 5 月治疗的 120 例糖尿病足患者临床资料, 将发生糖尿病足部溃疡感染的 38 例患者作为感染组, 未发生溃疡感染的 82 例患者作为非感染组, 分析糖尿病足部溃疡感染的病原菌特点和影响感染相关危险因素 结果该研究 38 例感染患者中共分离出病原菌 43 株, 革兰阳性菌 22 株, 占 51.2 % ; 革兰阴性菌 18 株, 占 41.9 % ; 真菌 3 株, 占 7.0 % 位居前 3 的病原菌为金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌, 均为 7 株, 各占 16.3 % 单因素分析结果显示, 合并糖尿病血管并发症 合并视网膜病变 溃疡数目 >2 个 合并骨髓炎以及合并肾病等与感染密切相关 (P <0.05); 多因素分析结果显示, 高密度脂蛋白胆固醇 血红蛋白 糖尿病血管并发症以及溃疡数目 骨髓炎是糖尿病足部溃疡感染的独立危险因素 结论糖尿病足部溃疡感染是多种因素共同作用而致, 因此临床应加强对这些因素的预防和控制, 以降低糖尿病足部溃疡的感染率 关键词 : 糖尿病, 足部溃疡 ; 感染 ; 危险因素 ; 预防对策中图分类号 :R378 ;R528.1 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Pathogen profile and risk factors of infected diabetic foot ulcers LIN Hong, WANG Xiaoqing, HUANG Lihui, XU Mindan, MA Lin, LAI Renxu. (Department of Geriatrics, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhuhai Guangdong, , China) Abstract: Objective To explore and analyze the pathogen profile and risk factors of infected diabetic foot ulcers, and propose appropriate prevention and intervention measures for early recovery of patients. Methods The data of 120 patients with diabetic foot ulcers treated in our hospital from February 2012 to May 2014 were retrospectively analyzed. These patients were classified into infection group (38 patients) and non-infection group (82 patients) based on whether their ulcer was infected or not. The pathogens and risk factors of infection in diabetic foot ulcer were analyzed. Results In this study, 43 strains of pathogenic bacteria were isolated from 38 cases of infection, of which gram positive bacteria accounted for 51.2 %, gram negative bacteria 41.9 %, and fungi 7.0 %. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter cloacae were the top three pathogens, accounting for 16.3 % each. Univariate analysis showed that diabetic vascular complication, retinopathy, more than 2 foci of ulcer, osteomyelitis, and diabetic nephropathy were closely associated with infection (P<0.05). Multivariate logistic regression analysis showed that HDL-C, albumin, diabetic vascular complication, number of ulcers, osteomyelitis were independent risk factors for infection in patients with diabetic foot ulcer. Conclusions HDL-C, red blood cell, hemoglobin, diabetic complications, white blood cell, triglyceride, albumin, diabetic vascular complication and smoking are the risk factors for infection in patients with diabetic foot ulcer. These factors should be prevented and controlled to reduce the incidence of infection in diabetic foot ulcer. Key words: diabetic foot ulcer; infection; risk factor; prevention measures 作者单位 : 中山大学附属第五医院干部保健科, 广东珠海 ;* 预防保健科 ;** 消化科 作者简介 : 林红 (1974 ), 女, 本科, 主管护师, 主要从事慢性疾病的管理及研究 通信作者 : 赖人旭, lairenxu@hotmail.com 糖尿病足部溃疡 ( 糖尿病足 ) 是糖尿病患者常见的并发症之一, 此种疾病是指还未被发现周围神经病变的人群, 却已经出现足部感染 溃烂 化脓等症状, 具有很高的罹患率和致残率, 严重影响患者生活质量 [1] 糖尿病足的患病率为

19 15 2 %~3 %,15 %~20 % 糖尿病足患者在患病期间会出现足部溃疡, 糖尿病足部溃疡感染是患者住院的主要原因, 对患者的身体健康造成了非常严重的影响 相关数据表明, 足部感染是 90 % 糖尿病足患者需要截肢的原因 [2], 不仅严重影响了患者的生活质量, 也很大程度上对患者家庭以及社会带来沉重的经济负担 明确糖尿病足部溃疡感染的相关危险因素对治疗具有重要的意义 基于此, 我院选取 120 例糖尿病足患者作为研究对象, 以分析糖尿病足部溃疡感染的相关危险因素以及相应的治疗对策 1 材料与方法 1.1 材料 病例选择回顾性分析 2012 年 2 月至 2014 年 5 月在我院治疗的 120 例糖尿病足患者资料, 根据感染的诊断标准将入组患者分为感染组和非感染组 并根据感染的严重程度进行分级, 本回顾性研究经过伦理委员会批准, 免除签署知情同意书 纳入及排除标准纳入标准 :1 本组所有患者均符合国际糖尿病足工作组的相关诊断标准 [3] ;2 糖尿病足感染诊断标准参照 实用抗感染治疗学 ( 第 2 版 ) 中相关诊断标准 [4] 排除标准: 1 不符合纳入标准者 ;2 患者足溃疡与糖尿病无关 ;3 恶性肿瘤长期化疗形成的足溃疡 1.2 方法依据糖尿病足感染诊断标准回顾性分析本组所有患者入院前溃疡病程 溃疡发病情况等, 进行了解和记录, 进一步分析影响糖尿病足部溃疡感染的危险因素 糖尿病足溃疡感染严重程度分级参照美国感染病协会和糖尿病足国际工作组关于糖尿病足感染的临床分类指南进行分级 (Wagner 分级 ) [5] : 1 级 ( 无感染 ), 无感染体征及感染症状 ;2 级 ( 轻度感染 ), 存在皮肤损伤, 未涉及到皮下组织损伤或系统紊乱, 且临床症状至少有以下 2 项 ( 局部疼痛 流脓 局部发热 溃疡面积在 0.5~2 cm 2 局部硬化或肿胀 );3 级 ( 中度感染 ), 涉及皮下组织损伤或系统紊乱, 无全身炎性反应 ; 溃疡面积在 2 cm 以上, 且临床症状至少有一项 ( 淋巴管炎 感染性筋膜炎或关节炎 骨髓炎 );4 级 ( 重度感染 ), 存在全身炎性反应, 且临床症状至少有以下 2 项 ( 脉搏 >90 次 /min 呼吸 >20 次 /min 体温 <36 或 >39 白细胞计数 < /L 或 > /L 不成熟白细胞 >0.10 %) 病原菌分离培养本组患者首次换药时, 首先对患者足部溃疡面进行清创 引流, 并给予聚维酮碘消毒, 无菌生理盐水冲洗 ; 在患者溃疡基底部采用灭菌棉拭子取材, 并将其放置在灭菌试管内,30 min 内送到细菌室进行细菌分离培养 统计学方法本研究所得数据均先录入 Excel 表格中, 接着采用统计学应用软件 SPSS 19.0 进行数据分析, 在对单项资料进行单因素分析的基础上, 将单因素中具有显著差异的变量等级化, 然后对这些变量通过多因素 Logistic 回归分析, 以 P<0.05 表示差异有统计学意义 2 结果 2.1 一般资料根据纳入及排除标准, 本研究共入组 120 例, 将其中出现感染的 38 例糖尿病足溃疡患者作为感染组, 未出现溃疡感染患者作为非感染组 感染组患者中男 22 例, 女 16 例, 平均年龄 65 岁, 平均糖尿病病程 (13.6±7.1) 年 糖尿病足病程 (36.8±6.4)d ; 其中急性感染 17 例 [ 体温在 (38.4±1.2) 外周血白细胞计数在(6.0~10.0) 10 3 /L], 慢性感染 21 例 ;Wagner 分级 :2 级 12 例, 3 级 20 例,4 级 6 例 ; 非感染组患者中男 46 例, 女 36 例, 平均年龄 66 岁, 糖尿病病程 (14.1±7.1) 年, 糖尿病足病程 (36.0±7.1)d 2.2 糖尿病足部溃疡感染病原菌特征分析本研究 38 例感染患者中共分离出病原菌 43 株, 革兰阳性菌占 51.2 %, 革兰阴性菌占 41.9 %, 真菌占 7.0 % 位居前 3 的病原菌为金黄色葡萄球菌 ( 金葡菌 ) 铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌, 各占 16.3 %, 见表 1 单一菌感染占 44.7 %(17 例 ); 复数菌感染 ( 2 株 ) 占 55.3(21 例 ) 复数菌感染亦称为混合感染, 细菌组合种类为 : 金葡菌合并大肠埃希菌 6 例 ; 铜绿假单胞菌合并阴沟肠杆菌 5 例 ; 铜绿假单胞菌合并大肠埃希菌 5 例 ; 大肠埃希菌合并真菌感染 3 例 ; 其他 2 例 2.3 糖尿病足部溃疡感染危险因素的单因素分析通过对糖尿病足部溃疡感染危险因素的单因素分析得知, 糖尿病病程以及糖尿病足病程 体重指数 高血压 冠心病等与感染没有相关性 (P >0.05); 而合并糖尿病血管并发症 合并视网膜病变 溃疡数目 >2 个 感染前合并骨髓炎以及合

20 16 表 1 糖尿病足部溃疡感染病原菌分布 Table 1 Distribution of the pathogenic bacteria isolated from infected diabetic foot ulcer Pathogen Strains/n Proportion / % Gram-positive Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Streptococcus Enterococcus faecium Others Gram-negative Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae Others Fungus Candida albicans Others Total 并肾病等与感染密切相关 (P<0.05), 见表 影响糖尿病足部溃疡感染的多因素分析通过对表 2 中 P<0.05 的因素进行多因素 Logistic 回归分析得知, 高密度脂蛋白胆固醇 (HDC-L) 外周血白细胞计数 C 反应蛋白 血红蛋白 糖尿病血管并发症以及溃疡数目 骨髓炎为糖尿病足部溃疡感染的独立危险因素, 见表 3 3 讨论糖尿病足溃疡作为糖尿病患者一种常见的并发症, 其病因大多为神经系统病变 血管病变 循环障碍以及皮肤生长的重要条件胰岛素生长因子的减少 而糖尿病足溃疡感染使患者的病情进一步加重, 不仅有较高的致残率和致死率, 而且带给患者非常大的精神和肉体上的痛苦, 严重影响患者的生活质量 有关统计显示, 糖尿病足溃疡患者的感染率达到了 68 % 左右 [6], 已经成为影响糖尿病患者治疗和康复的重要因素 但目前对糖尿病足部溃疡感染的原因尚不明确, 给糖尿病 表 2 溃疡感染危险因素的单因素分析 Table 2 Univariate analysis of risk factors for infections in diabetic foot ulcer Factor Infection group (n=38) Non-infection group (n=82) x 2 /t value P value Duration of diabetes mellitus / years 13.6± ± Diabetic foot disease /d 36.8± ± Body mass index /(kg/m 2 ) 21.3± ± Hypertension / n (%) 22 (57.9) 46 (56.1) Coronary heart disease / n (%) 9 (23.7) 21 (25.1) Diabetic vascular complication / n (%) 25 (65.8) 29 (35.1) Smoking / n (%) 27 (71.1) 40 (48.8) Diabetic retinopathy / n (%) 28 (73.7) 39 (47.6) More than 2 foci of ulcer / n (%) 26 (68.4) 32 (39.0) Infection with osteomyelitis / n (%) 20 (52.6) 17 (23.2) HDL-C /(mmol/l) 0.8± ± <0.001 LDL-C /(mmol/l) 2.4± ± TG /(mmol/l) 1.3± ± Albumin /(g/l) 31.5± ± <0.001 Hemoglobin /(g/l) 121.0± ± <0.001 Total protein /(g/l) 64.2± ± FPG /(mmol/l) 8.2± ± TC /(mmol/l) 3.9± ± HDL-C,high-density lipoprotein cholesterol ;LDL-C,low-density lipoprotein cholesterol ;TG,triglyceride ;FPG,fasting plasma glucose ; TC,total cholesterol.

21 17 表 3 糖尿病足部溃疡感染的多因素分析 Table 3 Multivariate analysis of risk factors for infections in diabetic foot ulcer Risk factor Regression coefficient Standard error Wald P value OR 95 % CI High-density lipoprotein cholesterol Hemoglobin Diabetic vascular complication Number of ulcers Osteomyelitis before infection 足部溃疡患者治疗带来巨大的压力 目前糖尿病足部溃疡感染病原菌多以细菌为主 国外学者认为, 糖尿病足部溃疡感染主要以革兰阳性菌为主, 主要为金葡菌 肠球菌以及 B 组链球菌等, 而混合感染是由多种细菌共同作用而致 [7] 本研究结果显示,38 例感染患者中共分离出病原菌 43 株, 革兰阳性菌占 51.2 %, 革兰阴性菌占 41.9 %, 真菌占 7.0 % 位居前 3 的病原菌为金葡菌 铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌, 各占 16.3 % ; 其中单一菌感染占 44.7 %(17 例 ); 复数菌感染 ( 2 株 ) 占 55.3%(21 例 ), 提示糖尿病足部溃疡感染主要以革兰阳性菌和革兰阴性菌为主, 且复数菌感染比例较高 3.1 糖尿病足溃疡感染的危险因素分析 HDL-C 因素 HDL-C 与血管疾病的发病率和病变程度成负相关, 随着 HDL-C 的降低, 患者体内血管疾病的病变程度就越严重 本研究表明, 感染组患者体内的 HDL-C 相对较低, 容易造成糖尿病足部溃疡感染的出现 感染前因素感染前存在骨髓炎是糖尿病足部溃疡感染的主要危险因素, 目前对其病因尚不完全清楚, 诸多学者认为, 由于骨髓炎患者多数存在软组织感染, 当糖尿病足患者骨髓炎达到中等以上程度的感染时, 将会造成骨破坏, 造成骨负重能力下降, 从而造成糖尿病患者足部很容易受伤, 最终导致糖尿病足溃疡形成, 进而发生 感染 [8] 血红蛋白因素血红蛋白相对较高, 不仅能够增加糖尿病足部溃疡患者感染面积, 而且能够提高其感染程度, 对患者的生活质量水平有着非常严重的影响 溃疡数目这是导致糖尿病足部溃疡感染的独立危险因素, 可能是由于糖尿病足部溃疡发生后, 溃疡数目越多, 将会造成感染发生概率增加 溃疡数目以及深度不仅影响感染程度的轻重, 同 时也容易造成清创不彻底, 最终造成糖尿病患者截肢 本研究结果也显示, 糖尿病足部溃疡数量越多, 患者发生感染概率越大 糖尿病血管并发症由于糖尿病血管并发症患者血糖控制差 炎性因子以及糖基化终末产物增多, 很容易引起肢体缺血, 再加上糖尿病患者自身免疫缺陷, 对感染和损伤反应差, 组织修复下降, 进而导致溃疡愈合时间延长, 最终造成细菌通过表面皮肤侵入深部组织, 发生感染 其发生糖尿病足部溃疡感染的概率大约是未发生血管并发症患者的 2 倍 本研究结果也显示, 糖尿病血管并发症也是导致糖尿病足部溃疡感染的独立危险因素 3.2 预防及控制对策分析 严格控制患者的血糖水平通过合理的护理方式结合相关药物, 对患者的血糖水平进行严格控制 从而能够提高患者的免疫功能, 降低患者糖尿病足溃疡感染的发生率 改善患者的饮食习惯和生活方式向患者说明正确的饮食习惯和生活方式的重要性, 通过帮助患者制订合理的饮食方案和适当的锻炼方案, 来提高患者的生活质量 对拥有不良生活习惯的患者, 进行正确的引导和劝阻, 以帮助患者戒烟并形成经常对足部进行保养和护理的好习惯 合理的足部护理根据每例患者的实际情况, 每日用温水浸泡双脚 10~15 min, 同时要对患者所穿的袜子以及鞋子给出合理的建议, 来降低患者足部溃疡感染的发生概率 制定更具针对性的治疗方案和护理方案要根据患者足部溃疡的面积大小以及渗出程度, 对于创面较小的患者, 要进行聚维酮碘擦拭以及涂抹腐生肌, 保持足部的干燥 ; 对于创面较大的患者, 要进行局部的清创, 再用相应的药物湿敷, 病程中一旦出现感染迹象, 需根据药敏合理选用抗生素以降低糖尿病足部溃疡患者感染加

22 18 重 [9-10] 综上所述, 糖尿病足部溃疡感染的因素来自于多个方面, 因此在该病临床治疗中, 要针对上述因素进行合理有效的预防和控制, 以降低糖尿病足部溃疡感染发生率, 从而提高患者的生活质量和身体健康水平 参考文献 [1] 陈军, 王富华, 王育林, 等. 感染对老年糖尿病足部溃疡患者预后的影响 [J]. 中国老年学杂志,2014,34(4): [2] MACIOCH T,SOBOL E,MROZIKIEWICZ-RAKOWSKA B, et al. Health related quality of life in patients with diabetic foot ulceration-observational study in Poland[J]. Value Health, 2015, 18(7):A616. [3] 李翔.2011 年囯际糖尿病足工作组有关糖尿病足溃疡处理特别指南 [J]. 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 ),2011,6(4): [4] 汪复, 张婴元. 实用抗感染治疗学 [M]. 2 版, 北京 : 人民卫生出版社,2012 :747. [5] [6] [7] [8] [9] [10] BOULTON AJM.Foot problems in patients with diabetes mellitus[m]. Testbook of Diabetes. London :Basil Blackwell, 1997 :1-20. WIRSING PG,HABROM AD,ZEHNDER TM,et al. Wireless micro current stimulation - an innovative electrical stimulation method for the treatment of patients with leg and diabetic foot ulcers[j]. Int Wound J,2015,12(6): CHARLES PG,UÇKAY I,KRESSMANN B,et al. The role of anaerobes in diabetic foot infections[j]. Anaerobe,2015, 34 (8):8-13. PARSA H,SAMANI S. Microbiological features and risk factors in patients with diabetic foot ulcers[j]. Wounds,2015,27(11): ABBAS M,UÇKAY I,LIPSKY BA. In diabetic foot infections antibiotics are to treat infection,not to heal wounds[j]. Expert Opinion Pharmacotherapy,2015,16(6): TROISI N,ERCOLINI L,CHISCI E,et al. Diabetic foot infection :preliminary results of a fast-track program with early endovascular revascularization and local surgical treatment[j]. Ann Vasc Surg,2015,31(15): 收稿日期 : 修回日期 : 信息交流 季节性流感疫苗 Fluad 上市 FDA approves first seasonal influenza vaccine containing an adjuvant 美国食品药品监督管理局 (FDA) 于 2015 年 11 月 24 日批准了新的季节性流感疫苗 Fluad 上市, 用于预防老年人的季节性流感 Fluad 是三价疫苗, 可以预防 3 种流感病毒株 (2 个 A 亚型 1 个 B 型 ) 的感染 为了提高免疫原性,Fluad 采用了角鲨烯油作为其免疫佐剂 角鲨烯油广泛存在于人类 动物和植物中, 其形成的水包油性乳液是疫苗制备过程中常用的免疫佐剂 美国及其他多个国家曾进行了一项多中心临床试验, 比较 Fluad 与 Agriflu( 另一 FDA 批准的三价季节性流感疫苗 ) 的安全性及免疫原性 ( 产生抗体应答的能力 ), 结果未发现 Fluad 有安全性 问题, 其主要不良反应为注射部位疼痛 肌肉痛 头痛和疲劳 ;Fluad 诱导抗体的水平与 Agriflu 相当, 但 Fluad 仍需要进行一项验证性研究以确证其临床效果 鉴于 65 岁以上老年人的免疫系统随着年龄的增长而减弱, 这些人群流感发病率高, 同时因患流感而住院者所占比例也较高,Fluad 正为此类患者提供了另一种安全有效的预防措施 News. FDA approves first seasonal influenza vaccine conaining an adjuvant. Clin Infect Dis, 2016:62 (15 February). 叶美萍摘译王明贵审校 收稿日期 :

23 19 论著 曲霉气管支气管炎 4 例临床分析 赵伟业, 刘菁, 刘学东 摘要 : 目的探讨曲霉气管支气管炎的临床表现 辅助检查 诊断及治疗 方法回顾性分析 2012 年 6 月 年 9 月在青岛市立医院呼吸科收治的 4 例曲霉气管支气管炎患者的临床资料, 并复习相关文献 结果临床表现主要有咳嗽 咯痰 喘息 发热及咯血 4 例患者均有易感因素 CT 表现为气管壁增厚狭窄 管腔阻塞或可无明显异常 支气管镜下表现为黏膜糜烂 坏死 气管狭窄, 以及假膜阻塞气道等 均经抗曲霉治疗,2 例气道狭窄者行气管镜下介入治疗 本组 4 例患者 1 例治愈,1 例好转,2 例死亡 结论曲霉气管支气管炎的临床表现及胸部影像学检查无特异性, 支气管镜检查是重要的诊断手段 早期诊断及正确的抗曲霉药物治疗是改善预后的关键 关键词 : 曲霉 ; 支气管炎 ; 支气管镜 ; 诊断 ; 治疗中图分类号 :R562 ;R519.8 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Clinical analysis of 4 patients with Aspergillus tracheobronchitis ZHAO Weiye, LIU Jing, LIU Xuedong. (Department of Respiratory Medicine, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao Shandong , China) Abstract: Objective To investigate the clinical manifestations, auxiliary examination, diagnosis and therapy of Aspergillus tracheobronchitis (ATB). Methods Clinical data of 4 ATB patients treated in Qingdao Municipal Hospital from June 2012 to September 2015 were analyzed retrospectively. The related literature was also reviewed. Results The main clinical manifestations were cough, sputum production, short of breath, fever and hemoptysis. All the four patients had predisposing factors. The findings of CT scan mainly included bronchial wall thickening, obstruction of bronchial lumen or no significant abnormality. Bronchoscopy showed mucosal erosion, necrosis, tracheal stenosis and obstruction of airway by pseudo-membrane. The diagnosis was confirmed by histopathology in all the four cases. They were treated with anti-aspergillus therapy. The two patients with airway stenosis were treated with interventional therapy via bronchoscope. As for the outcome, one patient was improved after therapy. Another was cured. The remaining two patients died. Conclusions The clinical manifestations and chest imaging of ATB are nonspecific. Bronchoscopy is an important tool for diagnosis of ATB. Early diagnosis and proper anti-aspergillus treatment are critical for improving prognosis. Key words: Aspergillus; bronchitis; bronchoscopy; diagnosis; treatment 曲霉气管支气管炎 ( Aspergillus tracheobronchitis, ATB) 和侵袭性肺曲霉病 (invasive pulmonary aspergillosis,ipa) 是侵袭性支气管肺曲霉病 (invasive bronchial-pulmonary aspergillosis,ibpa) 的两种表现形式 [1] ATB 是曲霉在气管内定植及 作者单位 : 青岛市立医院呼吸科, 山东青岛 作者简介 : 赵伟业 (1976 ), 女, 硕士, 主治医师, 主要从事肺部感染研究 通信作者 : 刘学东, xuedongliu@263.net 生长所致的疾病总称, 是曲霉病的一种少见类型, 临床报道少, 缺乏特异性临床表现, 容易误诊 近年来, 随着支气管镜检查的推广和提高而逐渐被认识 本研究回顾性分析我院收治的 4 例 ATB 患者的临床资料, 并复习相关文献, 以增强对该病的认识, 及早诊断与治疗 1 材料与方法 1.1 研究对象收集 2012 年 6 月 年 9 月在青岛市立医

24 20 院呼吸科诊断为 ATB 的 4 例患者的临床资料, 其 中男 2 例, 女 2 例, 年龄 50~85 岁 4 例患者均 有易感因素 临床资料见表 1 表 1 4 例曲霉气管支气管炎患者临床资料 Table 1 Clinical data of 4 patients with Aspergillus tracheobronchitis Case Age /years Gender Female Male Male Female Past history Symptom Radiotherapy for esophageal cancer Cough, expectoration, shortness of breath Resection of submandibular gland tumor Chronic obstructive pulmonary disease Therapy for lung cancer Cough, sputum, and wheeze Cough and wheeze Cough, dyspnea, hemoptysis, fever GM test (serum and BALF) Not done Positive Positive Not done Sputum culture or BALF culture Chest CT scan Bronchoscopy Histopathology Aspergillus fumigatus Aspergillus negative Aspergillus fumigatus Aspergillus negative No significant Bronchial stenosis of right middle trunk Chronic bronchitis, Tracheal stenosis, abnormality and lower lobe, exudation of right lower emphysema, pulmonary mass in left upper lobe bulla lobe Hyperplasia, nodular Multiple diffuse mucosal erosion in right Multiple mucosal erosion Tracheal stenosis, changes in mucosa middle trunk and right middle lobe and and new yellow nodules in and necrotic of the lower segment basal segment of lower lobe bronchus, left upper bronchus tissue and pus in of main trachea and yellow pseudo membrane attachment bronchial lumen above carina and and proliferation of granulation, stenosis covered with yellow of dorsal segment of right lower lobe, pus hyperplasia of yellow pseudo membrane, complete obstruction of bronchial lumen Chronic inflammation Large amount of degeneration and necrosis, Severe inflammation of Large amount of of mucosal tissue, and and aspergillus hyphae in some areas mucosa, focal necrosis, and necrotic tissue, aspergillus hyphae some aspergillus hyphae aspergillus visible hyphae Treatment Voriconazole, Voriconazole, amphotericin B, and Voriconazole, amphotericin Voriconazole amphotericin B amphotericin B aerosol B aerosol aerosol Outcome Improved Died Cured Died GM, aspergillus galactomannan antigen assay; BALF, bronchoalveolar lavage fluid. 1.2 研究方法回顾性分析 ATB 的临床表现 胸部影像学及支气管镜检查资料 诊治过程及预后, 并复习国内外相关文献 1.3 仪器采用 PENTAX EPM-3500 支气管镜主机, PENTAX EPM T3 电子支气管镜 2 结果 2.1 临床表现所有患者均有咳嗽 喘息或憋气,2 例有咯痰, 1 例发热,1 例咯血 3 例患者可闻及哮鸣音,1 例患者肺部体征无异常 2.2 实验室检查 2 例行支气管肺泡灌洗液 (BALF) 及血曲霉半乳甘露聚糖抗原测定 (GM) 试验的患者均阳性 ( 均以 <0.5 为参考值 ),2 例患者痰及 BALF 培养示烟曲霉生长 2.3 影像学表现胸部 CT 检查示 : 气管 支气管壁不同程度增厚并狭窄 2 例,1 例仅见慢性支气管炎 肺气肿, 1 例无特异性表现 见图 气管镜下表现 4 例患者均有脓苔附着或伪膜, 支气管黏膜糜烂 坏死 3 例, 气管狭窄 2 例, 支气管阻塞 2 例 其中支气管镜下冷冻治疗 2 例 见图 2

25 21 Large amount of necrotic tissues aspergillus hyphae and spores. Bronchial wall thickening obstruction of bronchial lumen or no significant abnormality. 图 3 4 例患者的黏膜活检病理 Figure 3 Biopsy of bronchial mucosa 图 1 胸部 CT Figure 1 CT scan 气管镜检查活检确诊 很快死亡 余患者接受过 2 次 1 例 4 次 1 例 6 次 1 例 支气管镜介 入治疗 治疗有效的患者治疗后复查支气管镜示 支气管黏膜糜烂 伪膜阻塞明显减轻 镜下未见 脓苔覆盖 抗真菌疗程 2 d 30 周 其中痊愈 1 例 显效 1 例 死亡 2 例 1 例死亡病例与早期误诊 抗曲霉治疗不及时有关 另 1 例患者确诊后先后 应用伏立康唑及两性霉素 B 治疗 30 周 在其临床 表现 支气管镜下表现缓慢改善情况下 合并铜 绿假单胞菌血流感染死亡 3 讨论 ATB 是发生于气管支气管壁的曲霉病 发病 率目前无确切的流行病学数据 最常见的病原真 Obstruction of airway by pseudo-membrane mucosal erosion necrosis and tracheal stenosis. 图 2 支气管镜下表现 Figure 2 Bronchoscopy 菌是烟曲霉 国际上对它的归类无统一标准 多 数学者将其归为半侵袭性曲霉病 [2] 有学者认为 ATB 是 IPA 进 展 中 的 某 一 阶 段 即 早 期 仅 发 生 ATB 而晚期可进展为 IPA 也可以两者并存 是 2.5 误诊情况 一种疾病的两种表现形式或两个不同阶段 [3] 临床 1 例患者考虑为肺癌压迫气道 1 例考虑为支 上将其据气管镜下表现分为侵袭性 溃疡性 假 气管哮喘 2.6 确诊 全部患者为支气管镜下组织活检病理确诊 见图 治疗及预后 膜坏死性和气管支气管腔内曲霉栓 4 种类型 [4] ATB 的发病机制不明 有学者认为患者免疫 系统受损较轻或者全身免疫功能正常 曲霉侵袭 局限于气道而不侵犯肺实质或向其他器官播散 气道黏膜屏障破坏是曲霉侵袭气管的主要原因 所有患者均经抗曲霉药物治疗 包括伏立康 如气管插管或者切开 气道内感染及肿瘤 局部 唑 两性霉素 B 其中 3 例单用伏立康唑治疗 1 放疗都会破坏气管黏膜的屏障功能 利于曲霉定 例采用伏立康唑联合两性霉素 B 治疗 全部联合 植或者侵袭 [5-6] 其易感因素与 IPA 类似 包括肿 两性霉素 B 雾化吸入治疗 两性霉素 B 10 mg 加 瘤放化疗后 粒细胞缺乏和骨髓或实体肿瘤移植 入灭菌纯化水 10 ml 雾化吸入 每日 2 次 接 长期服用糖皮质激素或免疫抑制剂 糖尿病 慢 受支气管镜下介入治疗 2 例 方法为活检钳钳夹 性肺部疾病 广谱抗生素使用 AIDS 及入住 ICU 冷冻及局部吸引 1 例患者因病情危重仅行 1 次支 的危重患者 [7] 也可见于无基础病或无免疫缺陷

26 22 患者 [8] 本文病例均有危险因素 ATB 患者无特异性的临床表现, 最常见的症 状为咳嗽 咯痰 发热 喘憋 咯血 咳嗽 喘 憋多见于假膜性坏死性 ATB 患者, 如假膜形成或 病变累及 2 个肺叶以上的支气管时, 有窒息可能 可有剥脱的灰黄色假膜组织咳出, 咯出类似支气 管树的曲霉痰栓是气管支气管腔内曲霉菌栓的最 常见表现 表 1 中患者 2 就有上述典型表现 而 大咯血常在曲霉破坏气道周围大血管时发生, 这 在溃疡性和侵袭性 ATB 患者中最常见 [9-10] ATB 需病理学确诊, 若痰 肺切除标本 支 气管镜活检或经皮穿刺活检标本内见曲霉菌丝或 孢子可确诊 痰 咽喉部或气管内的分泌物培养, 因常被污染, 阳性率低, 仅为 10 %~30 % 血清 或者 BALF GM 试验对诊断有一定的帮助, 近年在 临床上得到推广应用, 对高危患者连续动态检测 具有早期诊断价值 此外, 曲霉抗体的检测, 尤 其是曲霉抗体 IgG 及曲霉沉淀素的检测意义虽然 更大, 但因国内尚无试剂盒, 目前尚无法检测 ATB 与 IPA 的影像学表现不同, 因为肺实质 不受曲霉直接影响, 可为正常无特征性的影像表 现, 偶尔有气管或者支气管壁增厚 胸部 X 线可 无异常, 而高分辨率 CT 可有气道阻塞或气道壁破 坏征象 [11] 本文 2 例患者有轻度的气管狭窄 另 外 2 例无曲霉感染特异性表现 ATB 主要靠组织活检病理学确诊, 病理提示 曲霉浸润到气管 支气管黏膜基层, 因此支气管 镜检查活检是诊断的主要方法 镜下表现多样 : 1 炎性改变, 病变部位气道黏膜充血 水肿 糜 烂, 表面覆盖黄白色脓苔 2 腔内新生物, 气管 管腔内息肉样新生物 3 结节样增生改变 4 气管 支气管出现狭窄或者阻塞 [12] 本文中 3 例有糜烂 结节样增生,2 例有脓苔附着,2 例有管腔阻塞 ATB 的治疗包括抗曲霉药物治疗 支气管镜 介入治疗和免疫增强治疗 抗曲霉药物包括三唑 类的伏立康唑 伊曲康唑 多烯类的两性霉素 B 及两性霉素 B 脂质体和棘白菌素类的卡泊芬净 伏立康唑首选, 对烟曲霉 黄曲霉 黑曲霉等均 有杀菌作用 [13] 两性霉素 B 因肾脏毒性较大, 全 身不良反应多, 临床全身静脉应用较少, 对不能 耐受者可改用两性霉素 B 脂质体, 但其可用于雾 化吸入治疗, 全身用药配合雾化吸入两性霉素 B 可明显提高疗效 [14], 有助于高浓度多烯类药物到 达局部感染部位, 但该方法尚未标准化 [4] 本文 所有病例均联合两性霉素 B 雾化吸入治疗加强疗效 有学者发现伊曲康唑 (400 mg/d) 口服治疗气道曲霉病效果良好 [9] 卡泊芬净通过抑制真菌细胞壁的合成, 对曲霉也有良好的抗菌活性, 且不良反应少 药物治疗的疗程根据患者对治疗的反 应决定, 可从数周至 1 年 [15] 不能耐受抗曲霉治疗且未累及主气管及隆突的局部病变患者 肺功能良好者, 或经积极的抗曲霉治疗急性症状已得到控制但仍有局部病灶者, 可行手术治疗 病变部位在主支气管以上的中央气道者, 在药物治疗的同时, 可联合支气管镜下介入治疗 通过激光 高频电刀 氩气刀 冷冻 微波等解除支气管内狭窄或炎性肉芽肿, 缓解气道阻塞 球囊扩张术治疗气管支气管狭窄作用直接, 伤害性最小, 但容易发生早期再狭窄, 因此有学者主张介入治疗气道狭窄首选球囊扩张, 发生再狭窄时, 再采用支架置入 [16] 一些增强机体吞噬细胞功能的免疫增强剂, 如人白细胞集落刺激因子 γ 干扰素等也有利于该病的治疗 ATB 临床报道少, 临床表现与影像学无特异性, 容易误诊或延迟诊断 活检病理为确诊的依据 它的全身药物治疗同 IPA, 但气道内治疗对改善气道梗阻及呼吸困难更重要 早期诊断及治疗可大大改善预后 参考文献 [1] DE PAUW B,WALSH TJ,DONNELLY JP,et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/lnvasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG)Consensus Croup[J]. Clin Infect Dis,2008, 46(12): [2] KADAKAL F,UYSAL MA,OZGUL MA,et al. A case report of endobronchial semi-invasive aspergillosis[j]. Tuberk Toraks, 2004,52(2): [3] HE H,DING L,LI F,et al. Clinical features of invasive bronchial-pulmonary aspergillosis in critically ill patients with chronic obstructive respiratory diseases :a prospective study [J]. Crit Care,2011,15(2):R5. [4] WALSH TJ,ANAISSIE EJ,DENNING DW,et al. Treatment of aspergillosis :clinircal practice guiclelines of the Infectious Diseases Society of America [J]. Clin Infect Dis,2008,46(3): [5] WU N,HUANG Y,LI Q,et al. Isolated invasive Aspergillus tracheobronchitis :a clinical study of 19 cases[j]. Clin Microbiol Infect,2010,16(6): [6] C L A R K E A, S K E LT O N J, F R A S E R R S. F u n g a l

27 23 tracheobronchitis. Report of 9 cases and review of the literature[j]. Medicine(Baltimore),1991,70(1):1-14. [11] 黄海东, 李强. 曲霉菌性气管支气管炎 [J]. 第二军医大学学 [7] CHAKRABARTI A,CHACTERJEE SS,DAS A,et al. 报,2011,32(12): Invasive aspergillosis in developing countries[j]. Med Mycol, [12] 曹鄂洪, 施毅, 赵蓓蕾, 等. 气道支气管曲霉病 1 例报告及 2011,49 (Suppl l):s35-s47. 文献复习 [J]. 中国感染与化疗杂志,2008,8(6): [8] 李玉苹, 陈成水, 叶民, 等. 无免疫缺陷者侵袭性气道肺曲 [13] 黄怡, 白冲, 李强, 等. 气道侵袭性曲霉感染 19 例分析 [J]. 霉病的支气管镜和胸部 CT 表现 [J]. 中华结核和呼吸杂志, 中国感染与化疗杂志,2005,5(4): ,32(6): [14] KARNAK D,AVERY RK,GILDEA TR,et al. Endobronchial [9] MEHRAD B,PACIOCCO G,MARTINEZ FJ,et al. Spectrum fungal disease :an under-recognized entity[j]. Respiration, of Aspergillus infection in lung transplant recipients :case series 2007,74(1): and review of the literature [J]. Chest,2001,119(1):169- [15] 李培, 苏欣, 施毅. 气道侵袭性曲霉病 [J]. 中华结核和呼吸 175. 杂志,2011,34(9): [10] SANCHO JM,RIBERA JM,ROSELL A,et al. Unusual [16] 李强. 阻塞性气管 支气管曲霉病 [J]. 中华内科杂志, invasive bronchial aspergillosis in a patient with acute 2006,45(8): lymphoblastic leukemia[jl. Haematologica,1997,82(6): 收稿日期 : 修回日期 : 信息交流 寨卡病毒暴发流行期针对妊娠妇女的暂定指南 Interim guidelines for pregnant women during a Zika virus outbreak 寨卡病毒可通过母婴传播, 虽然在流产胎儿的标本中发现寨卡病毒的 RNA, 但寨卡病毒与流产的关系尚不明确 新生儿小头畸形已被证实与孕妇寨卡病毒感染有关, 在此次巴西寨卡病毒的暴发流行期间, 小头畸形新生儿的出生率明显上升 但是, 与寨卡病毒感染确定相关的小头畸形发生率尚不清楚 疾病预防与控制中心建议所有的孕妇暂缓前往寨卡病毒暴发流行区旅行 如必须前往, 须严密防护避免室内外的蚊虫叮咬 妊娠期间曾前往寨卡病毒流行区域的所有孕妇必须进行寨卡病毒感染的评估和检测 出现临床症状后的 1 周内, 可检测孕妇血清中寨卡病毒的 RNA 量 抗寨卡病毒 IgM 和中和抗体在寨卡病毒感染症状出现后的第 4 天才能检测到 不推荐对没有感染症状的孕妇进行相关检查, 除非存在胎儿小头畸形或颅内钙化的孕妇 也可以进行羊水寨卡病毒的 RT-PCR 检测, 如阳性提示存在宫内感染 寨卡病毒相关的检测已在美国疾病预防与控 制中心及其他的国立卫生机构中展开 对于疑为 孕妇或胎儿寨卡病毒感染者, 分娩后推荐作下述 检查 : 胎盘和脐带的病理检查及其冰冻切片的寨 卡病毒 RNA 检测 ; 脐带血抗寨卡病毒和登革热病 毒 IgM 及中和抗体检测 如果一个曾到寨卡病毒 流行地区旅行的孕妇发生了流产, 或者分娩出的 新生儿有小头畸形, 需要对胎儿组织包括胎盘和 脐带进行寨卡病毒的 RT-PCR 和免疫组化检测 编辑评论 : 根据泛美卫生组织的监测 :2000 年巴西的小头畸形的发生率是 5.5 例 / 例, 2010 年为 5.7 例 / 例 自寨卡病毒暴发流 行以来, 新生儿的小头畸形发生率上升了 20 倍, 达 99.7 例 / 例 然而, 以上数据尚不能推 断出寨卡病毒感染孕妇分娩出小头畸形新生儿的 概率 News. Interim guidelines for pregnant women during a Zika virus outbreak. Clin infect Dis,2016:62(15 April). 丁百兴摘译王明贵审校 收稿日期 :

28 24 论著 低水平乙型肝炎病毒表面抗原核苷类似物经治患者序贯 α 干扰素治疗的初步研究 李朋, 李天驹, 李子益, 秦波 摘要 : 目的观察经核苷 ( 酸 ) 类似物 (NA) 治疗获得病毒学应答, 且 HBsAg 低水平的 HBeAg 阴性慢性乙型肝炎 (CHB) 患者序贯 α 干扰素 (IFNα) 治疗的疗效, 并探讨 HBsAg 消失的相关因素 方法长期接受 NA 治疗并获得病毒学应答 (HBV-DNA<1 000 拷贝 /ml, 持续时间 >12 个月 ), 且 HBsAg 低水平 (HBsAg U/mL) 的 HBeAg 阴性 CHB 患者, 转为 IFNα 治疗 48 周 检测患者治疗前和治疗 周时血清 HBV-DNA 定量,HBV 血清学标志物, 肝功能和血常规, 停药后随访 24 周 以 HBsAg 消失或血清学转换 HBsAg<10 U/mL 为疗效评价指标 Logistic 回归用于分析相关因素, 受试者工作特征曲线 (ROC 曲线 ) 用于确定 HBeAg 阴转史及 HBsAg 变化情况对治疗后 HBsAg 消失的预测价值 结果 83 例患者被纳入研究 停药 24 周时,15 例 (18.1 %) 获得 HBsAg 消失,5 例 (6.0 %) 获得 HBsAg 血清学转换,9 例 (10.8 %) 达到 HBsAg<10 U/mL HBsAg 消失组中 HBeAg 自发阴转的患者比例高于 HBsAg 未消失组, 差异有统计学意义 (χ 2 =9.527, P=0.002) 治疗 12 周时 HBsAg 水平较基线下降 0.5 log U/mL 者治疗后更易实现 HBsAg 消失 (χ 2 =16.576,P<0.001), 其预测 HBsAg 消失的曲线下面积 (AUC) 为 0.810(95 % CI :0.686~0.935,P<0.001) 结论经 NA 治疗获得病毒学应答, 且 HBsAg 低水平的 HBeAg 阴性 CHB 患者, 序贯 IFNα 治疗可获得较高 HBsAg 消失率 ;HBeAg 阴转史及治疗早期 HBsAg 变化情况可用于预测及指导治疗 关键词 : 肝炎, 乙型, 慢性 ; 肝炎表面抗原, 乙型 ; α 干扰素 ; 核苷 ( 酸 ) 类似物中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Preliminary study on the efficacy of sequential therapy with nucleotide analogues followed by interferon alpha in chronic hepatitis B patients with low HBsAg level LI Peng, LI Tianju, LI Ziyi, QIN Bo. (Department of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing , China) Abstract: Objective To investigate the efficacy of interferon alpha (IFNα) followed by nucleotide analogues (NAs) treatment in patients with negative hepatitis B e antigen (HBeAg), undetectable serum HBV-DNA and low hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels. Methods The enrolled HBeAg-negative chronic hepatitis B patients had undetectable HBV-DNA level (HBV-DNA<1 000 copies/ml for at least 12 months) and low HBsAg level (HBsAg U/mL) with long-term NAs treatment. These patients switched their therapy sequentially from NAs regimens to IFNα for 48 weeks. The treatment response was evaluated in terms of serum HBV DNA load, serological HBV markers, liver function tests and routine blood test before treatment and 12, 24 and 48 weeks of treatment. The patients were followed up for 24 weeks after treatment. The primary endpoint was HBsAg loss or seroconversion and HBsAg<10 U/mL. Logistic regression analysis was conducted to examine relevant predictive factors. Receiver operating characteristic curve was used to evaluate the value of prior HBeAg seroconversion and on-treatment HBsAg dynamics in predicting HBsAg loss. Results A total of 83 patients were included in 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) the study. At 24 weeks after the end of treatment, HBsAg loss 作者单位 : 重庆医科大学附属第一医院感染科, 重庆 was found in 15 (18.1%) patients, HBsAg seroconversion in 5 作者简介 : 李朋 (1989 ), 男, 硕士研究生, 主要从事病毒性 (6.0%) patients, and HBsAg<10 U/mL in 9 (10.8%) patients. 肝炎的研究和治疗 通信作者 : 秦波, cqqinbo@126.com More patients in HBsAg loss group showed spontaneous

29 25 HBeAg seroconversion than in HBsAg persistence group (χ 2 =9.527, P=0.002). HBsAg loss was more likely in the patients who had HBsAg decline at least 0.5 log U/mL from baseline at week 12 of treatment (χ 2 =16.576, P<0.001). The area under the ROC curve for prediction of HBsAg loss was (95% CI, to 0.935, P<0.001). Conclusions The HBeAg-negative chronic hepatitis B patients with positive virological response and low HBsAg level after NAs treatment are more likely to achieve HBsAg clearance when switched to IFNα treatment. Prior HBeAg seroconversion and on-treatment HBsAg dynamics are useful in predicting and guiding IFNα sequential therapy. Key words: chronic hepatitis B; hepatitis B surface antigen; interferon-alpha; nucleotide analogue 慢性乙型肝炎 (CHB) 抗病毒治疗药物主要分为核苷 ( 酸 ) 类似物 [nucleos(t)ide analogues, NA] 和 α 干扰素 (interferon alpha,ifnα) 两类 NA 能直接抑制 HBV 复制, 快速降低 HBV DNA 载量, 但其诱导的应答不持久且停药后易复发 [1] ; IFNα 具有抗病毒和免疫调节双重作用, 可实现停 药后持久应答, 然而仅有部分患者获得应答 [2] HBsAg 消失是 CHB 抗病毒治疗的理想终点 [3], 近年来一些探索性研究发现, 长期接受 NA 治疗的 CHB 患者序贯干扰素治疗可获得更高治疗目标, 其中 HBsAg 低水平者更易实现 HBsAg 消失或血清学转换 [4-5] 本研究旨在评价经 NA 治疗获得病毒学应答, 且 HBsAg 低水平的 HBeAg 阴性患者序贯干扰素治疗疗效, 并探讨 HBsAg 消失的相关因素 1 材料与方法 1.1 资料来源 2008 年 7 月至 2014 年 3 月于重庆医科大学附属第一医院感染科门诊就诊, 符合 慢性乙型肝炎防治指南 (2010 年版 ) [6] 诊断标准的 HBeAg 阴性 CHB 患者中, 入选经 NA 治疗获得病毒学应答 (HBV DNA<1 000 拷贝 /ml, 持续时间 >12 个月 ), 且 HBsAg U/mL 者, 序贯 IFN α 治疗 48 周 ( 干扰素 α-1b,500 万 U, 隔日 1 次, 或聚乙二醇干扰素 α-2a,180 μg, 每周 1 次, 皮下注射, 根据患者经济情况选用 ) 序贯治疗前 8 周采用 NA 加干扰素联合治疗, 联合治疗 8 周后使用干扰素单药治疗 排除标准 : 同时感染其他类型肝炎病毒 HIV 等, 合并肝硬化 肝细胞癌 自身免疫性肝炎等肝病, 酗酒 吸毒 精神疾病史等 1.2 方法 观察指标 IFNα 治疗前检测患者基线 HBV DNA 定量 HBV 血清学标志物 肝功能和血常规 治疗期间, 每 12 周检测血清 HBV DNA 定量 HBV 血清学标志物 肝功能和血常规 ; 前 12 周, 每 4 周复查肝功能和血常规, 治疗结束后随访 24 周 以停药 24 周时 HBsAg 消失或血清学转换 HBsAg<10 U/mL 为疗效评价指标 实验室测量 HBV DNA 定量采用上海罗氏公司全自动实时荧光定量 PCR 检测, 检测下限为 拷贝 /ml,hbv 血清学标志物采用雅培公司 Abbott Architecti 2000 试剂检测 统计学处理所有统计分析采用 SPSS 19.0 软件处理 连续性变量以中位数表示, 分类变量以构成比表示, 采用 χ 2 检验 ; 相关因素分析采用 Logistic 回归分析 受试者工作特征曲线 (ROC 曲线 ) 曲线下面积 (AUC) 用于评估 HBeAg 阴转史及治疗过程中 HBsAg 变化情况对治疗后 HBsAg 消失的预测意义 双侧检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 患者一般情况 96 例患者接受 IFNα 序贯治疗, 其中 8 例 IFNα 治疗疗程大于 48 周,5 例在治疗早期因难以耐受不良反应而终止, 最终有 83 例患者被纳入分析 男 37 例, 女 46 例 ; 中位年龄 35(22~59) 岁 ;CHB 病程中位时间为 9(3~59) 年 ;NA 治疗中位时间为 3(1~5) 年 ; 接受干扰素 α-1b 治疗 65 例, 聚乙二醇干扰素 α-2a 治疗 18 例 IFNα 治疗前, 接受拉米夫定治疗 29 例 阿德福韦酯治疗 25 例 恩替卡韦治疗 21 例 拉米夫定耐药后联合阿德福韦酯治疗 8 例 ;HBsAg 水平中位数为 2.97(1.26~3.30)log U/mL ;ALT 水平中位数为 25(11~40)U/L NA 治疗前,HBsAg 水平中位数为 3.32(2.63~3.88)log U/mL ;ALT 水平中位数为 105(46~349)U/L ;HBV DNA 定量水平中位数为 5.50(3.84~8.27)log U/mL HBeAg 阴转史 : 根据患者 CHB 病史, 未经抗病毒治疗 HBeAg 自发阴转的患者 42 例 ( 自发阴转 ); 经抗病毒治疗 HBeAg 阴转, 停药后病毒复发的患者 41 例 ( 经

30 26 治疗阴转 ) 2.2 停药后应答情况停药 24 周时, 共 15 例 (15/83,18.1 %) 患者获得 HBsAg 消失, 其中 5 例 (5/83,6.0 %) 获得 HBsAg 血清学转换 ; 另有 9 例 (9/83,10.8 %) 达到 HBsAg<10 U/mL 2.3 HBsAg 消失与未消失患者的基线比较 HBsAg 消失组基线年龄及 HBsAg 水平均低于 HBsAg 未消失组, 差异有统计学意义 (t=2.027, P=0.046 ;t=2.389,p=0.030) HBsAg 消失组中 HBeAg 自发阴转的患者比例高于 HBsAg 未消失组, 差异有统计学意义 (χ 2 =9.527,P=0.002) 两组其他基线因素差异无统计学意义 ( 均 P>0.05) 见表 1 Logistic 回归分析显示,HBeAg 阴转史是治疗后 HBsAg 消失的独立相关因素 (OR :0.150, 95 % CI :0.030~0.749,P=0.021) ROC 曲线结果显示 HBeAg 阴转史预测治疗后 HBsAg 消失的 AUC 为 0.720(95 % CI :0.590~0.850,P=0.008) 表 1 HBsAg 消失组与未消失组患者的基线特征比较 Table 1 Baseline patient characteristics in terms of HBsAg status Characteristic HBsAg loss HBsAg persistence P value Number of patients Male 5 (33 %) 32 (47 %) Age /years 30 (23-48) 36 (22-59) Course of CHB /years 10 (3-48) 9 (4-59) Duration of NAs treatment /years 3 (1-5) 3 (1-4) IFNα (PEG-IFNα) 5 (33 %) 13 (19 %) NAs Lamivudine 5 (33 %) 24 (35 %) Adefovir dipivoxil 4 (27 %) 21 (31 %) Entecavir 5 (33 %) 16 (24 %) Lamivudine + Adefovir dipivoxil 1 (7 %) 7(10 %) HBsAg/(log U/mL) 2.91 ( ) 3.14 ( ) Spontaneous HBeAg seroconversion 13 (87 %) 29 (43 %) ALT/(U/L) 25 (15-37) 25 (11-40) ALT before NAs treatment /(U/L) 97 (58-322) 115 (46-349) HBV-DNA before NAs treatment /(log U/mL) 4.98 ( ) 5.67 ( ) HBsAg before NAs treatment /(log U/mL) 3.53 ( ) 3.37 ( ) HBeAg,hepatitis B e antigen ;HBsAg,hepatitis B surface antigen ;ALT,alanine aminotransferase ;NAs,nucleotide analogues. 2.4 治疗过程中 HBsAg 变化情况与 HBsAg 消失关系在治疗 周时,HBsAg 消失组的 HBsAg 水平较基线下降幅度均明显大于未消失组, 两组比较差异有统计学意义 (P=0.002,0.001, <0.001) 见图 1 ROC 曲线分析认为, 治疗 12 周和 24 周时 HBsAg 变化情况与治疗后 HBsAg 消失具有相关性, 其预测治疗后 HBsAg 消失的 AUC 分别为 0.810(95 % CI :0.686~0.935,P<0.001) 和 0.842(95 % CI :0.736~0.947,P<0.001) 治疗 12 周时,HBsAg 水平较基线下降 0.5 log U/mL 者治疗后更易获得 HBsAg 消失 (47.6 % 比 8.1 %, χ 2 =16.576,P<0.001) HBeAg 自发阴转者, 治疗 12 周时有 11 例 图 1 治疗过程中两组患者 HBsAg 水平变化情况 Figure 1 HBsAg dynamics during IFNα treatment in chronic hepatitis B patients

31 27 HBsAg 水平较基线下降 0.5 log U/mL, 其中 8 例治疗后 HBsAg 消失, 阳性预测值 (positive predictive value,ppv) 为 72.7 % ; 治疗 24 周时, HBsAg 水平较基线下降 0.9 log U/mL 的 PPV 为 87.5 % HBeAg 经治疗阴转者, 治疗 12 周时有 31 例 HBsAg 水平较基线下降 <0.5 log U/mL, 治疗后均未获得 HBsAg 消失, 阴性预测值 (negative predictive value,npv) 为 100 % ; 治疗 24 周时, HBsAg 水平较基线下降 <0.9 log U/mL 的 NPV 同样为 100 % 见表 2 表 2 基线因素及治疗过程中 HBsAg 变化情况预测 HBsAg 消失 Table 2 Role of baseline factors and on-treatment HBsAg dynamics in prediction of subsequent HBsAg loss Treatment response and characteristics HBsAg loss HBsAg persistence PPV / % NPV / % Number of patients Spontaneous HBeAg seroconversion week treatment HBsAg decline 0.5 log U/mL at week Spontaneous HBeAg seroconversion + HBsAg decline 0.5 log HBsAg decline<0.5 log On-treatment HBeAg seroconversion + HBsAg decline 0.5 log week treatment + HBsAg decline<0.5 log HBsAg decline 0.9 log U/mL at week Spontaneous HBeAg seroconversion + HBsAg decline 0.9 log HBsAg decline<0.9 log On-treatment HBeAg seroconversion + HBsAg decline 0.9 log HBsAg decline<0.9 log HBeAg,hepatitis B e antigen ;HBsAg,hepatitis B surface antigen ;PPV,positive predictive value ;NPV,negative predictive value. 3 讨论 随着 NA 抗病毒治疗广泛普及, 越来越多 的 HBeAg 阴性 CHB 患者经过治疗获得有效应 答 但其具体疗程不确定, 且停药后肝炎复发率 高, 因此治疗疗程宜长, 以到达理想的治疗终点 即 HBsAg 消失 [7] 然而 Chevaliez 等 [8] 研究显示, NA 治疗实现 HBsAg 消失平均需要 52.5 年, 如此 漫长的疗程致使越来越显著耐药 依从性欠佳 经济负担等问题逐步显现, 大多数患者不能坚持 长期用药, 随意停药甚至会导致暴发性肝炎 [9] Li 等 [10] 一项回顾性研究显示, 长期 NA 治疗的 CHB 患者序贯联合干扰素治疗疗效优于继续 NA 治疗, 基线 HBsAg<1 000 U/mL 者, 治疗后可获得更 高 HBsAg 消失率 NEW SWITCH [11] 研究结果显 示,NA 经治患者如已获得部分应答且 HBsAg 水 平下降至较低水平, 接受干扰素序贯治疗 HBsAg 清除率较高, 基线 HBsAg 定量 <1 500 U/mL 者 序贯干扰素治疗 48 周,HBsAg 清除率达 31.2 % 这些研究结果提示, 经 NA 治疗获得部分应答且 HBsAg 低水平的患者, 序贯干扰素治疗能获得较高 HBsAg 消失率 本研究回顾性分析 83 例 HBeAg 阴性, 接受 NA 治疗获得病毒学应答且 HBsAg 低水平, 再转为 IFNα 治疗的 CHB 患者 治疗后 HBsAg 消失率为 18.1 %, 略低于其他研究报道 [4,11], 分析其原因可能为 :1 本研究入选患者均为 HBeAg 阴性 CHB 患者, 其干扰素治疗应答率可能相对较低 ; 2 78 % 的患者为序贯普通 IFNα 治疗, 相比于聚乙二醇干扰素 α-2a 疗效略低 研究发现, 干扰素治疗结束时 HBsAg 水平与其治疗后 HBsAg 消失率密切相关,HBsAg<10 U/mL 者治疗后更易获得 HBsAg 消失 [12-13] 本研究中, 停药 24 周时有 10.8 % 患者达到 HBsAg<10 U/mL, 其可能会有更多患者实现 HBsAg 消失 我们对 HBsAg 消失和未消失患者基线情况进行比较分析发现, 基线 HBeAg 阴转史与治疗后 HBsAg 消失具有相关性 经抗病毒治疗阴转的 HBeAg 阴性 CHB 患者,NA 治疗后序贯 IFNα 不易实现 HBsAg 消失, 可能原因为 :1 停药后病毒

32 28 复发, 其本身也表明患者免疫状况欠佳 ;2 研究认为 HBV 突变能影响干扰素治疗应答 [14],HBeAg 自发阴转和经治疗阴转患者的 HBV 变异可能存在差异, 从而影响干扰素治疗应答率 治疗过程中 HBsAg 变化情况也是预测疗效 的一个重要指标 Peng 等 [15] 的荟萃分析认为对 于 HBeAg 阴性 CHB 患者, 治疗过程中 HBsAg 变化情况能有效指导干扰素治疗 本研究结果显示, 序贯治疗 12 周时 HBsAg 水平较基线下降 0.5 log U/mL 者治疗后更易获得 HBsAg 消失 (47.6 % 比 8.1 %,χ 2 =16.576,P<0.001) ROC 曲线分析认为, 治疗 12 周时 HBsAg 变化情况对治疗后 HBsAg 消失具有预测价值 (AUC=0.810) HBeAg 自发阴转者, 若在治疗 12 周时 HBsAg 水平较基线下降 0.5 log U/mL, 则有 72.7 % 的患者治疗后获得 HBsAg 消失 ;HBeAg 经治疗阴转者, 若治疗 12 周 HBsAg 较基线下降 <0.5 log U/mL, 其阴性预测值为 100 %, 因此, 对于此类患者建议终止干扰素治疗, 尽早调整治疗方案 本研究还存在以下几点不足 :1 样本量较少, 没有对基线 HBsAg 水平进行分层分析 ;2 由于本研究为回顾性分析, 研究中存在混杂因素, 没有对普通干扰素和聚乙二醇干扰素治疗患者进行比较分析 ;3 虽然根据患者 CHB 病史,HBeAg 自发阴转者均为未经治疗 HBeAg 自发转阴性, 但由于未检测其病毒基因, 不能完全排除其中存在病毒为野生型的患者, 有待设计随机对照研究, 进一步阐明影响序贯治疗疗效的相关因素 ;4 对获得 HBsAg 消失或血清转换的患者还应进行长期随访观察 综上所述, 经 NA 治疗获得病毒学应答, 且 HBsAg 低水平的 HBeAg 阴性 CHB 患者, 序贯 IFNα 治疗可获得较高 HBsAg 消失率 基线 HBeAg 阴转史及治疗早期 HBsAg 变化情况可作为 HBsAg 消失的预测指标 参考文献 [1] KIM SS,CHEONG JY,CHO SW. Current nucleos(t)ide analogue therapy for chronic hepatitis B [J]. Gut Liver,2011,5 (3): [2] LIAW YF. Impact of therapy on the outcome of chronic hepatitis B[J]. Liver Int,2013,33(Suppl 1): [3] European Association For The Study Of The Liver. EASL Clinical Practice Guidelines :management of chronic hepatitis B virus infection[j]. J Hepatol,2012,57(1): [4] NING Q,HAN M,SUN YT,et al. Switching from entecavir to PegIFN alfa-2a in patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B :a randomized open-label trial (OSST trial)[j]. J Hepatol, 2014,61(4): [5] BROUWER WP,XIE Q,SONNEVELD MJ,et al. Adding pegylated interferon to entecavir for hepatitis B e antigenpositive chronic hepatitis B :A multicenter randomized trial (ARES study)[j]. Hepatology,2015,61(5): [6] 中华医学会肝病学分会, 中华医学会感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南 (2010 年版 )[J]. 中华传染病杂志,2011,29 (2): [7] SETO WK,HUI AJ,WONG VW,et al. Treatment cessation of entecavir in Asian patients with hepatitis B e antigen negative chronic hepatitis B :a multicentre prospective study [J]. Gut, 2015,64(4): [8] CHEVALIEZ S,HÉZODE C,BAHRAMI S,et al. Long-term hepatitis B surface antigen (HBsAg)kinetics during nucleoside/ nucleotide analogue therapy :finite treatment duration unlikely [J]. J Hepatol,2013,58(4): [9] LIM SG,WAI CT,RAJNAKOVA A,et al. Fatal hepatitis B reactivation following discontinuation of nucleoside analogues for chronic hepatitis B[J]. Gut,2002,51(4): [10] LI GJ,YU YQ,CHEN SL,et al. Sequential combination therapy with pegylated interferon leads to loss of hepatitis B surface antigen and hepatitis B e antigen(hbeag) seroconversion in HBeAg-positive chronic hepatitis B patients receiving long-term entecavir treatment[j]. Antimicrob Agents Chemother,2015,59(7): [11] HU P,JIA S,ZHANG W,et al. A multi-center randomized study on the efficacy and safety of switching to peginterferonα- 2a (40KD)for 48 or 96 weeks in HBeAg positive CHB patients with a prior NUC history for 1 to 3 years :an interim analysis of NEW SWITCH study [J]. Hepatology,2014,60(Suppl 6): 1273a-1274a. [12] MARCELLIN P,BONINO F,YURDAYDIN C,et al. Hepatitis B surface antigen levels :association with 5-year response to peginterferon alfa-2a in hepatitis B e-antigen-negative patients[j]. Hepatol Int,2013,7(1): [13] BRUNETTO MR,MORICONI F,BONINO F,et al. Hepatitis B virus surface antigen levels :a guide to sustained response to peginterferon alfa-2a in HBeAg-negative chronic hepatitis B[J]. Hepatology,2009,49(4): [14] YANG HC,CHEN CL,SHEN YC,et al. Distinct evolution and predictive value of hepatitis B virus precore and basal core promoter mutations in interferon-induced hepatitis B e antigen seroconversion [J]. Hepatology,2013,57(3): [15] PENG H,WEI F,LIU JY,et al. Response-guided therapy of regimens based on PEG-interferon for chronic hepatitis B using on-treatment hepatitis B surface antigen quantification :a metaanalysis[j]. Hepatol Int,2015,9(4): 收稿日期 : 修回日期 :

33 29 论著 流感病毒两种快速抗原检测方法的对比分析 陈晨, 范清琪, 陈刚, 朱梦琪, 吴晶, 张文宏, 金嘉琳 摘要 : 目的分析比较两种流感病毒抗原检测试剂盒 ( 胶体金免疫层析法 ) 检测的一致性, 评价新型的基于银盐扩增技术的流感病毒抗原检测试剂盒在临床中的应用 方法选择 2015 年 1 月 1 日 2 月 28 日在复旦大学附属华山医院就诊的体温 >37.5, 且具有流感样症状的患者, 同时采集双份鼻拭子标本 采用 IMMUNO AG Cartridge Flu AB 试剂盒 ( 简称 AG1 法 ) 与甲型 / 乙型流感病毒抗原检测试剂盒 ( 简称 CV 法 ) 同时检测, 并作 PCR 检测以确证 结果共检测患者 91 例,AG1 法测定甲型流感病毒阳性 7 例, 乙型流感病毒阳性 53 例 ;CV 法测定甲型流感病毒阳性 7 例, 其中弱阳性 3 例, 乙型流感病毒阳性 50 例, 其中弱阳性 4 例 ;PCR 法检测甲型流感病毒阳性 8 例, 乙型流感病毒阳性 60 例 AG1 法检测甲型流感病毒灵敏度 87.5 %, 特异度 100 %, 乙型流感病毒灵敏度 88.3 %, 特异度 100 % CV 法检测甲型流感病毒灵敏度 87.5 %, 特异度 100 %, 乙型流感病毒灵敏度 83.3 %, 特异度 100 % AG1 法与 CV 法两种抗原快速检测甲型流感病毒检测的阳性符合率 100 %, 乙型流感病毒的阳性符合率 94.3 % 结论两种流感病毒快速抗原检测方法一致性较好,AG1 检测法可以减少针对弱阳性标本的人为判读误差, 可应用于流感早期诊断 关键词 : 流感 ; 快速抗原检测 ; 免疫层析法中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j A new silver amplification immunochromatography system compared with conventional rapid antigen assay for the diagnosis of influenza A and B CHEN Chen, FAN Qingqi, CHEN Gang, ZHU Mengqi, WU Jing, ZHANG Wenhong, JIN Jialin. (Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai , China) Abstract: Objective To analyze the consistency of two rapid antigen assays for the diagnosis of influenza A and B. We evaluated the clinical usefulness of silver amplification immunochromatography influenza virus detection kit. Methods Nasopharyngeal swab samples were collected from patients who were suspected of influenza at Huashan Hospital between January and February Two samples were collected from the same one patient. The samples were tested simultaneously by using IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit (AG1) and commercial immunochromatographic assay kit, Clearview exact influenza A&B (CV). PCR method was used as reference. Results A total of 91 samples were tested, of which 7 were positive for influenza A and 53 positive for influenza B by AG1 system; 7 positive for influenza A and 50 positive for influenza B by CV system; and 8 positive for influenza A and 60 positive for influenza B by PCR. The sensitivity and specificity of the AG1 system were 87.5 % and 100 % for influenza A, and 88.3 % and 100 % for influenza B; while the CV system showed sensitivity and specificity of 87.5 % and 100 % for influenza A, 83.3 % and 100 % for influenza B. The AG1 system was 100 % consistent with the CV system in the positive rate of influenza A, and 94.3 % consistent with the CV system in the positive rate of influenza B. Conclusions The AG1 system is well consistent with the conventional immunochromatography-based diagnostic tests in diagnosis of influenza. The AG1 system is useful in earlier diagnosis of influenza due to fewer human error in result interpretation. Key words: i n f l u e n z a ; r a p i d a n t i g e n a s s a y ; 基金项目 : 上海市级医院新兴前沿技术项目 (SHDC ) immunochromatographic system 作者单位 : 复旦大学附属华山医院感染科, 上海 作者简介 : 陈晨 (1981 ) 女, 硕士, 主治医师, 主要从事感染性疾病的临床诊疗 通信作者 : 金嘉琳, jinjialin@fudan.edu.cn 近年来流感的疫情频繁出现,2005 年 H5N1

34 30 人禽流感,2009 年新甲型 H1N1 流感,2013 年的 H7N9 禽流感疫情, 引起了人们对流感更多的认识与关注 流感流行对社会稳定和经济发展造成很大影响, 根据中国疾病预防控制中心数据,2014 年我国报告流行性感冒病例 21 万例, 死亡 43 例 虽然目前尚无特效药物可以完全治愈流感, 但是早期应用合适的抗病毒治疗可缩短疾病的持续时 间, 减轻症状的严重程度, 减少并发症的发生 [1-2], 并采取适当隔离防护措施, 为阻断病毒在人群流行提供帮助 鉴于流感临床症状的非特异性, 迫切需要一种准确的早期诊断方法, 以期能早期应用抗病毒药物, 及时控制病情 本研究通过比较两种流感病毒抗原检测方法试剂盒 ( 胶体金免疫层析法 ) 检测的一致性, 以 PCR 核酸检测作为确证依据, 评价富士医疗器械 ( 中国 ) 投资公司提供的流感病毒抗原检测方法试剂盒 ( 胶体金免疫层析法 ) 在临床验证中的效能 1 材料与方法 1.1 材料 研究对象 2015 年 1 月 1 日至 2 月 28 日, 于复旦大学附属华山医院就诊, 符合体温 > 37.5, 并伴有以下症状之一 : 头痛 关节疼痛 肌肉痛 咳嗽 喉咙痛 流涕乏力等全身症状的患者, 所有患者均签署知情同意书 总共 91 例患者, 其中男 44 例, 女 47 例, 年龄 17~83 岁, 平均 47 岁 试剂与仪器富士医疗器械 ( 中国 ) 投资公司提供的 IMMUNO AG Cartridge Flu AB 试剂盒和 FUJI DRI-CHEM IMMUNO AG1 分析仪 (AG1 法 );Clearview 甲型 / 乙型流感病毒抗原检测试剂盒 ( 胶体金法 )(CV 法 ), 生产厂家为艾博生物医药 ( 杭州 ) 公司 ; 甲型和乙型流感病毒核酸检测试剂盒 (PCR- 荧光探针法 ), 生产厂家为中山大学达安基因股份有限公司,PCR 分析仪厂家为 ABI 公司, 型号 :VII 方法 标本采集与处理由经过培训的医务人员用 2 支灭菌棉棒同时采取患者同一侧鼻拭子样本, 分别按照两个抗原快速检测试剂盒说明书操作, 将上述两份检测标本的残余液混合后行 PCR 检测 AGI 法操作流程将棉棒放入含有抽取液的软管中, 从软管外侧用手指挤压棉棒数次, 然后绞干拔出棉棒, 换装滴注头, 向 AG1 试剂盒滴注 4 滴, 将试剂盒插入 FUJI DRI-CHEM IMMUNO AG1 分析仪, 盖上盒盖后检测自动开始,15 min 后仪器自动判读并打印报告 CV 法操作流程向软管内滴 6 滴抽取液, 将 1 支棉棒放入后, 旋转挤压棉头, 拔出棉棒, 将检测试剂条放入软管,15 min 后医务人员根据条带判读结果 反转录实时 (RT-Realtime)PCR 检测流感病毒核酸将上述两种抗原检测的剩余液各留取一部分混合后用于 RT-Realtime PCR 检测 采用中山大学达安基因股份有限公司生产的甲型和乙型流感病毒核酸检测试剂盒 (PCR- 荧光探针法 ), ABI 公司 VII7 型 PCR 分析仪, 严格按照说明书操作 利用 RT-Realtime PCR 检测技术, 采用一对针对甲型或乙型流感病毒核蛋白 (NP) 基因的特异性引物和一条特异性 TagMan 荧光探针, 实现对样本中流感病毒的定性检测 统计学方法使用 State 11.0 统计软件, 以 RT-Realtime PCR 法为参照评价两种快速抗原检测的诊断价值, 阳性率比较采用卡方检验, 并作灵敏度和特异度分析, 两种快速抗原检测结果的一致性分析采用 Kappa 检验 2 结果 2.1 抗原快速检测与 PCR 核酸检测结果在 91 例发热伴流感样症状患者鼻拭子标本中,PCR 法检测出甲型流感病毒阳性 8 例, 阳性率 8.8 %, 乙型流感病毒阳性 60 例, 阳性率 65.9 %, 其中有 1 例甲型流感病毒与乙型流感病毒均为阳性 AG1 法检测出甲型流感病毒阳性 7 例, 阳性率 7.7 %, 乙型流感病毒阳性 53 例, 阳性率 58.2 % ;CV 法检测出甲型流感病毒阳性 7 例, 阳性率 7.7 %, 其中弱阳性 3 例, 乙型流感病毒阳性 50 例, 阳性率 54.9 %, 其中弱阳性 4 例, 见表 1 AG1 法与 PCR 核酸检测甲型流感的阳性率比较差异无统计学意义 (χ 2 = ,P=0.788),CV 法与 PCR 核酸检测甲型流感的阳性率比较差异无统计学意义 (χ 2 = ,P=0.788),AG1 法与 PCR 核酸检测乙型流感的阳性率比较差异无统计学意义 (χ 2 = ,P=0.285),CV 法与 PCR 核酸检测乙型流感的阳性率比较差异无统计学意义 (χ 2 = ,P=0.130),AG1 法与 CV 法检测甲型流感的阳性率比较差异无统计学意义 (χ 2 =0.000, P=1.000),AG1 法与 CV 法检测乙型流感的阳性率比较差异无统计学意义 (χ 2 = ,P=0.654)

35 31 表 1 抗原快速检测与 PCR 结果比较 Table 1 Comparison between rapid antigen assays and PCR PCR Rapid antigen assay Influenza A Influenza B Positive Negative Positive Negative AG CV Total AG1,IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit ;CV,Clearview exact Influenza A&B. 2.2 两种快速检测法结果比较 AG1 法与 CV 法两种抗原快速检测的一致性 较好, 甲型流感病毒检测的阳性符合率 100 %, 乙 型流感病毒的阳性符合率 94.3 %, 见表 2 两种 快速抗原检测的临床效能比较见表 3, 两种抗原快 速检测法对于甲型和乙型流感病毒检测阳性预测 值均为 100 %,AG1 法对于甲型和乙型流感病毒 检测阴性预测值分别为 98.8 % 和 81.6 %,CV 法 对于甲型和乙型流感病毒检测阴性预测值分别为 98.8 % 和 75.6 % 表 2 AG1 法与 CV 法一致性比较 Table 2 Consistency between IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit and Clearview exact Influenza A&B system in identifying Influenza Coincidence rate Influenza A Influenza B Positive coincidence rate /% Negative coincidence rate /% Total coincidence rate /% Kappa value Table 3 表 3 两种抗原快速检测的灵敏度和特异度 Sensitivity and specificity of IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit versus Clearview exact Influenza A&B system in diagnosis of Influenza Rapid antigen assay Influenza A Influenza B Sensitivity Specificity PPV NPV Sensitivity Specificity PPV NPV AG CV PPV,positive predictive value ;NPV,negative predictive value ;AG1,IMMUNO AG Cartridge Flu AB kit ;CV,Clearview exact Influenza A&B. 3 讨论目前用于流感病毒的检测技术主要包括病毒分离培养法, 免疫荧光技术 (IFA), 酶联免疫测定法 (ELISA), 胶体金免疫层析技术,RT-PCR 等 流感病毒分离培养是流感病毒诊断的金标准, 细胞培养逐渐发展取代传统鸡胚培养,RT-PCR 有很高的灵敏度, 两者可用于病毒亚型的鉴定和抗原变异分析, 但是两者操作技术要求高, 费时费力 基于胶体金免疫层析技术的流感抗原快速检测已有商品化试剂盒, 操作简便, 虽不能作亚型鉴定, 但优势在于能在短短数分钟时间内快速作出定性诊断, 阳性者可以进一步通过 PCR 法或病毒分离培养行亚型鉴定 一方面在流感早期诊断中起了重要的作用, 早期使用神经氨酸酶抑制剂, 控制病情发展, 缓解症状, 而对于检测阴性者可以避免过度治疗 另一方面, 在流感流行季节也是疫情检测调查的有效手段, 可以及时与普通上 呼吸道感染等区分鉴别, 采取隔离措施, 同病种隔离, 能够有效阻断流感播散, 避免疫情扩大 根据此次筛查监测结果,2015 年 1 月至 2 月间, 来本院就诊的季节性流感以乙型流感为主 一般情况下快速检测的特异度超过 90 %, 灵敏度在 10 %~90 %, 灵敏度的差异受拭子材料 患者年龄 病程 呼吸道标本种类等影响 [3] 为 了提高检测效能, 人们尝试了一些新的技术, 例如采用铂代替胶体金 [4] 酶免疫测定 [5] 新型的富士医疗器械 ( 中国 ) 投资公司提供的流感病毒抗原检测方法试剂盒 ( 胶体金免疫层析法 ), 使用银盐增幅照相技术, 自动放大洗净功能 [6], 比普通免疫层析法灵敏度更高 本研究结果显示 AG1 法乙型流感的检出灵敏度 (88.3 %) 高于现有的商品化试剂盒 (83.3 %), 特异度达到 100 %, 考虑需要更大样本的数据进一步评价 这种新的检测方法更多的优势是配合 FUJI DRI-CHEM IMMUNO AG1 分析仪, 能够检测自动判读, 降低人为误差

36 32 在本试验中有 4 例乙型及 3 例甲型流感患者,CV 法肉眼判读为弱阳性, 若在欠经验操作者手中存在判读为阴性的可能而造成漏诊 ; 判读标本结果需要 15 min, 时间过长或过短都可能造成错误判断, 传统的试剂盒必须人为计时, 而机器自动操作无需时时监测, 提高工作效率 综上所述, 该试剂盒可以作为初步筛查和诊断参考 参考文献 [1] 李龙芸, 蔡柏蔷, 王孟昭, 等. 磷酸奥司他韦治疗流行性感冒的多中心临床研究 [J]. 中华内科杂志,2001,40(12): [2] 林江涛, 于学忠, 崔德健, 等. 磷酸奥司他韦治疗高危人群流行性感冒多中心临床随机对照研究 [J]. 中华结核和呼吸杂志,2004,27(7): [3] [4] [5] [6] CHARTRAND C,LEEFLANG MM,MINION J,et al. Accuracy of rapid influenza diagnostic tests :a meta-analysis[j]. Ann Intern Med,2012,156(7): TAKASAKI Y,SHINDO S,YAMASHITA Y,et al. Evaluation of ImunoAce Flu influenza rapid diagnostic kit using new platinum-gold colloid technology[j]. Clin Pract Res,2008,85 (12): MITAMURA K,YAMAZAKI M,ICHIKAWA M,et al. Evaluation of an immunochromatography test using enzyme immunoassay for rapid detection of Influenza A and B viruses[j]. J Jpn Assoc Infect Disease,2004,78(7): MITAMURA K,SHIMIZU H,YAMAZAKI H,et al. Clinical evaluation of highly sensitive silver amplification immunochromatography systems for rapid diagnosis of influenza[j]. J Virol Methods,2013,194(1-2): 收稿日期 : 修回日期 : 信息交流 西半球的寨卡病毒疫情 Zika in the western hemisphere 寨卡病毒疫情在美洲暴发 (Wkly Epidemiol Rec,2015,90 : ) 尽管寨卡病毒感染早先仅在美洲和亚洲有散发病例的报道, 但 2007 年在雅浦群岛出现寨卡病毒感染暴发标志着该病毒已成为一种重要的蚊媒病原体 2013 年法属波利尼西亚出现寨卡病毒感染病例, 此后该病遍及太平洋地区, 与登革热和基孔肯雅热同时流行 2014 年, 智利报道首例本土发生的寨卡病毒感染病例 但该例系在距离圣地亚哥约 5 h 航程的复活节岛获得感染 2015 年 5 月, 巴西东北部地区确认有寨卡病毒的流行,2015 年 10 月巴西有 14 个州波及 同月, 在哥伦比亚的玻利瓦尔省也发现了疫情 截至 10 月 16 日, 哥伦比亚共发现 9 例实验室确诊病例 11 月 11 日, 世界卫生网发布哥伦比亚寨卡病毒感染疫情 : 疑似病例 486 例, 其中 185 例发生在卡塔赫纳市, 确诊病例 341 例 疫情最严重的省份包括 : 玻利瓦尔省 (81 例 ) 安蒂奥基亚省 (47 例 ) 北桑坦德省 (44 例 ) 圣安 德烈斯 (37 例 ) 和里萨拉尔达 (18 例 ) 该国卫生部指出有 万哥伦比亚人存在感染该病毒风险 ( 详见 http ://promedmail.org) 截至 2015 年 12 月底, 北至墨西哥南至巴拉圭, 已有 12 个拉美国家出现了寨卡病毒感染病例 寨卡病毒最早于 1947 年分离自乌干达孜卡森林的恒河猴, 而首例人感染病例发现于 1952 年 寨卡病毒感染通常引起轻微 自限性发热, 但重症病例也有报道 该病毒感染可能与患者发生格林 - 巴利综合征, 以及感染该病毒的孕妇生产小头畸形婴儿有关 美国可能存在寨卡病毒本土感染, 因为美国很多州存在该病毒的传播媒介 伊蚊 如果有本土感染发生, 寨卡病毒将与登革热同时在美国流行, 而基孔肯雅热尚未在美国报道, 尽管它已播散至墨西哥和加勒比海地区 In the literature. Zika in the western hemisphere. Clin Infect Dis, 2016 :62(1 March). 盛滋科摘译徐晓刚审校 收稿日期 :

37 33 论著 spo0a 基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用 宋晓蕾, 周芬芬, 吴湜, 高琼, 黄海辉, 陈轶坚 摘要 : 目的了解 spo0a 基因对艰难梭菌临床分离株生长和芽孢产生的影响 方法采用 ClosTron 敲除技术构建艰难梭菌临床分离株 C25 的 spo0a 基因突变株, 分光光度计检测菌液浓度并绘制生长曲线, 孔雀绿染色法计数芽孢和营养细胞 结果艰难梭菌临床分离株 C25 的 spo0a 基因敲除突变株和敲除前亲代株的 48 h 生长曲线无明显差异, 但突变株不再产生芽孢 结论 spo0a 基因是艰难梭菌芽孢形成过程中的关键基因, 但并非其生长过程中的主要基因 关键词 : 艰难梭菌 ; 芽孢 ; spo0a 基因 ; 生长曲线中图分类号 :R378.8 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j The role of spo0a gene in growth and sporulation of Clostridium difficile SONG Xiaolei, ZHOU Fenfen, WU Shi, GAO Qiong, HUANG Haihui, CHEN Yijian. (Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University; Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai , China) Abstract: Objective To investigate the role of spo0a gene in growth and sporulation of Clostridium difficile clinical isolates. Methods ClosTron gene knock-out system was used to knock out the spo0a gene of C. difficile strain C25. Bacterial growth curve was plotted by measuring D 600 with spectrophotometer in different phases of bacterial growth. Malachite green staining technique was used to count the number of vegetative cells and spores under optical microscope. The sporulation rate was calculated. Results The spo0a mutant and its C25 parental strain showed similar patterns of growth. However, after knock-out of spo0a gene, an asporogenous phenotype was built, while the parental strain could produce spores as usual. Conclusions The spo0a gene plays a key role in sporulation but not growth of C. difficile strain. Key words: Clostridium difficile; sporulation; spo0a gene; growth curve 艰难梭菌 (Clostridium difficile) 为革兰阳性厌氧芽孢杆菌, 是医院获得性腹泻最主要的病原菌, 约 25 %~33% 抗生素相关性腹泻以及 90 % 假膜性肠炎由艰难梭菌所致, 统称为艰难梭菌感染 (Clostridium difficile infection,cdi) [1] 大多数的 CDI 发生在住院患者中, 但近 10 年社区获得 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ) 作者单位 : 复旦大学附属华山医院抗生素研究所, 卫生部抗生素临床药理重点实验室, 上海 作者简介 : 宋晓蕾 (1988 ), 女, 硕士研究生, 主要从事感染性疾病的诊断治疗 通信作者 : 陈轶坚, chenyijian@fudan.edu.cn CDI 急剧上升, 约占新发感染的 1/3 [2] 芽孢是艰难梭菌在外界环境中的主要存在形式, 也是艰难梭菌感染广泛传播的原因之一 DNA 结合蛋白 Spo0A 是细胞从营养生长期进入芽孢形成时期的关键应答调节蛋白 对模式微生物枯草芽孢杆菌的研究表明, 当 Spo0A 的含量和磷酸化水平达到一定阈值后, 芽孢形成才开始启动 [3-4] 有报道 Spo0A 在艰难梭菌持续感染和传播中起重要作用 [5-6] 本研究采用 ClosTron 技术构建艰难梭菌 spo0a 基因突变株, 对 Spo0A 在艰难梭菌临床分离株生长和芽孢形成中的作用进行研究

38 34 1 材料与方法 1.1 材料 实验菌株艰难梭菌临床株 C25 分离自我院腹泻患者粪便 经鉴定该菌株为核糖体 014 型, 产 A 毒素和 B 毒素 VPI10463 为实验室标准菌株, 产 A 毒素和 B 毒素 大肠埃希菌感受态细胞 HB101 购自日本 TaKaRa 公司 pmtl007-e2 质粒为英国诺丁汉大学 Nigel Minton 惠赠 主要试剂 Brucella 琼脂为美国 BBL Microbiology system 产品, 蛋白胨 - 酵母基础肉汤 (TY 肉汤 ) 和 SAB 肉汤为英国 OXOID 公司产品 环丝氨酸 头孢西丁等药物购自大连美仑生物技术有限公司 引物由 DNA 2.0 公司 ( 美国 ) 或上海生物工程技术服务有限公司合成 TargeTron gene knockout system kit 为美国 Sigma-Aldrich 公司产品 孔雀绿为中国国药集团化学试剂有限公司 产品 番红染液为上海科玛嘉微生物技术有限公司产品 1.2 方法 构建艰难梭菌 spo0a 基因突变株在 http : // 中选取合适的目的基因突变位点, 生成 IBS EBS2 EBS1d EBS Universal 引物序列, 由 DNA2.0 公司合成上述引物序列并进行 PCR, 纯化突变所需内含子片段, 按 TargeTron gene knockout system kit 说明书操作完成该内含子片段与 pmtl007-e2 质粒的重组 将重组质粒导入 E. coli HB101 感受态细胞, 氯霉素平皿筛选 将筛选后含有重组质粒的大肠埃希菌与亲代菌株混合培养进行接合实验 用甲砜霉素 - 头孢西丁 - 环丝氨酸平皿与红霉素平皿筛选艰难梭菌接合子 [5,7] 在含红霉素的筛选平皿上随机挑取 6 个接合子菌落, 采用 3 对验证引物进行 PCR 并测序 引物序列见表 1 表 1 引物及序列 Table 1 Primers and the corresponding oligonucleotide sequences in this study Primers Sequence (5 3 ) IBS EBS1d EBS2 EBS Universal Cd-spo0A-F1 Cd-spo0A-R1 ErmRAM-F ErmRAM-R AAAAAAGCTTATAATTATCCTTATTATTCCATCTAGTGCGCCCAGATAGGGTG CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCCATCTAGTTAACTTACCTTTCTTTGT TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTAATAATCGATAGAGGAAAGTGTCT CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC TTTTAGCAGATGACAATAAGG GTCAACTTTTCCTCTACTCCA TATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG GCGACTCATAGAATTATTTCCTCCCG 绘制细菌生长曲线纯分后的艰难梭菌菌株在厌氧工作站中 (Ruskinn, 英国 )37 培养 16 h 后取 1 ml 菌液加入到 150 ml 预还原 TY 肉汤中, 置于摇床上厌氧培养, 记为 0 h 前 18 h 中每隔 3 h 从厌氧培养 TY 肉汤中取样 3 ml, 于紫外可见光分光光度计上测量 D 600 值, 之后于 24 h 48 h 取样测量 D 600 值, 绘制生长曲线 计算产芽孢率分别于第 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 取上述菌液 1 ml, 离心 g,10 min, 留取沉淀, 加入适量 PBS 和 5 % 孔雀绿水溶液等量混合,100 加热 25 min, 涂片, 干燥, 加热固定,ddH 2 O 冲洗玻片, 直至流出的水无色为止, 用 0.5 % 番红溶液复染 3 min, 使用洗耳球吹去多余染液, 吹干玻片 油镜下芽孢呈绿色, 菌体呈红色 分别计数 10 个单独的视 野 产芽孢率 = 芽孢数 /( 芽孢数 + 营养细胞数 ) 100 % 2 结果 2.1 艰难梭菌 spo0a 突变株验证用 Cd-spo0A-F1/Cd-spo0A-R1 引物进行 PCR 后, 琼脂糖凝胶电泳显示突变株扩增产物的长度较亲代株长, 测序结果证实该段序列中含有 Ⅱ 类内含子 用 ErmRAM-F/ErmRAM-R 引物 PCR 后其测序结果证实了 RAM 片段在突变过程中发生重组 用插入序列一端引物 EBS Universal 和 spo0a 基因一端引物 Cd-spo0A-R1 进行 PCR 后结果则进一步证实了 spo0a 基因中有内含子插入序列, 突变株构建成功, 见图 1

39 35 (A) Diagram of spo0a and surrounding genes in C. difficile C25. (B) The spo0a mutant in which the intron integration has inserted. (C-E) Three PCR screens routinely carried out on 6 putative ClosTron mutants. (C) Flanking primers Cd-spo0A-F1 and Cd-spo0A-R1 are used to screen the target gene on either side of the insertion. The product obtained from the C25 spo0a mutant will be larger than the wild type. (D) Primers RAM-F and RAM-R are used to demonstrate the spliced form of the RAM in the mutant. The spliced RAM will give a product approximately 400 bp smaller than the unspliced RAM (pmtl007-spo0a). (E) Primers Cd-spo0A-R1 and EBS Universal are used to screen one of the intron exon junctions of the mutant. A product should not be visible in the C25 wild type. Figure 图 1 艰难梭菌 spo0a 突变株验证 PCR confirmation of intron integration into spo0a gene 生长曲线 以 实 验 室 标 准 菌 株 VPI10463 为 对 照 可 见 VPI10463 C25 与 C25 spo0a 突变株生长情况相似 株在 48 h 开始有芽孢产生 产芽孢率 0.1 % 而后 随时间增长产芽孢率亦增加 但 C25 spo0a 突变 株至 120 h 均没有芽孢产生 见图 3 在前 9 h 均处于指数生长期 12 h 后进入稳定生长 期 各个时间点 C25 与 C25 spo0a 突变株菌液浓 度也相仿 见图 2 Three independent experiments were done to get the growth curve. The results are presented in log scale. The error bars indicate standard deviations. The sporulation experiment was performed three times. The error bars indicate standard deviations. Figure 3 图 2 VPI10463 C25 C25 spo0a 突变株生长曲线 Figure 2 Growth curve of three Clostridium difficile strains, VPI10463, C25 and C25 spo0a mutant 2.3 产芽孢率 VPI10463 在 48 h 即开始有芽孢产生 产芽孢 率 0.3 % 而后随时间增长产芽孢率增加 C25 菌 3 图 3 spo0a 基因对芽孢产生的影响 Effect of spo0a gene inactivation on sporulation capacity of C. difficile 讨论 艰难梭菌作为一种芽孢杆菌 可在恶劣的条 件下产生芽孢 临床上营养缺乏 抗生素暴露

40 36 消毒剂的使用均可能使之产生芽孢 因此芽孢是艰难梭菌传播的主要形式, 亦可能与艰难梭菌感染停药后反复发作相关 [8] 文献报道欧美广泛传播的 NAP1/BI/027 菌株产芽孢能力明显高于其他菌株, 且该菌株感染更容易复发 [9] 因此当前很多研究者对艰难梭菌芽孢形成机制进行研究, 以期为治疗艰难梭菌感染提供新靶点和新思路 Spo0A 是近年来研究的热点之一, 其在营养细胞生长 芽孢产生 毒素分泌以及生物膜形成方面的作用均有报道 [10] 但由于在艰难梭菌中基因敲除比较困难, 因此基因功能研究明显落后于其他病原菌, 直至 2007 年 Nigel Minton 教授研发并共享 ClosTron 技术 [11] 本课题组亦是在 Nigel Minton 惠赠关键质粒后方成功敲除 spo0a 基因 本研究发现 spo0a 基因敲除前后突变菌株与亲代菌株的生长趋势相仿, 均在 9 h 后进入稳定生长期, 且各个生长阶段吸光度值 D 600 均相近, 表明 spo0a 基因并非艰难梭菌 C25 菌株生长过程中 的主要基因 虽 Pettit 等 [6] 研究显示部分与细胞壁 合成相关的基因也受 Spo0A 调控, 但敲除 spo0a 基因对于艰难梭菌营养细胞的生长并无明显影响 本研究中艰难梭菌临床分离株 C25 和实验室标准菌株 VPI10463 在 TY 肉汤中培养 48 h 即开始产生芽孢, 之后随着培养时间的延长产芽孢率明显增加, 但 C25 spo0a 突变株在整个研究阶段均无芽孢产生, 提示 Spo0A 是艰难梭菌芽孢产生的必要蛋白 这与其他研究者的结果相一致 :Mackin 等 [12] Underwood 等 [7] 和 Deakin 等 [5] 对 spo0a 基因敲除后的 Δerm 的研究均发现 spo0a 基因敲除后突变株不产生芽孢 并且 Deakin 等 [5] 还发现 spo0a 基因敲除后突变株在小鼠中的 传播和持续感染均受到影响, 可能与 spo0a 基因敲除后艰难梭菌芽孢产生障碍有关 本研究的局限在于未进行 spo0a 基因回补试验, 且仅敲除核糖体型 014 菌株 今后将增加不同核糖体型别的研究菌株, 特别是国内主要的核糖体型 017 流行株 ; 增加回补实验及动物实验, 为了解 Spo0A 在艰难梭菌感染发病和传播中的作 用提供更多依据 参考文献 [1] [2] [3] [4] LESSA FC,WINSTON LG,MCDONALD LC. Burden of Clostridium difficile infection in the United States[J]. N Engl J Med,2015,372(24): KHANNA S,PARDI DS,ARONSON SL,et al. The epidemiology of community-acquired Clostridium difficile infection :a population-based study[j]. Am J Gastroenterol, 2012,107(1): 孙静, 陈建华. 枯草芽孢杆菌形成芽孢时母细胞中基因表达 的调控 [J]. 生物技术,2007,17(3): 刘燕, 秦玉昌, 潘宝海. 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 在 芽孢形成过程中的几个关键事件 [J]. 生命科学,2005,17(4): [5] DEAKIN LJ,CLARE S,FAGAN RP,et al. The Clostridium difficile spo0a gene is a persistence and transmission factor[j]. Infect Immun,2012,80(8): [6] PETTIT LJ,BROWNE HP,YU L,et al. Functional genomics reveals that Clostridium difficile Spo0A coordinates sporulation, virulence and metabolism[j]. BMC Genomics,2014,15 :160. [7] UNDERWOOD S,GUAN S,VIJAYASUBHASH V,et al. Characterization of the sporulation initiation pathway of Clostridium difficile and its role in toxin production[j]. J Bacteriol,2009,191(23): [8] GERDING DN,JOHNSON S. Clostridium difficile infection in 2010 :advances in pathogenesis,diagnosis and management of CDI[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2011,8(2): [9] MERRIGAN M,VENUGOPAL A,MALLOZZI M,et al. Human hypervirulent Clostridium difficile strains exhibit increased sporulation as well as robust toxin production[j]. J Bacteriol,2010,192(19): [10] PAREDES CJ,ALSAKER KV,PAPOUTSAKIS ET. A comparative genomic view of clostridial sporulation and physiology[j]. Nat Rev Microbiol,2005,3(12): [11] HEAP JT,CARTMAN ST,KUEHNE SA,et al. ClosTrontargeted mutagenesis[j]. Methods Mol Biol,2010,646 : [12] MACKIN KE,CARTER GP,HOWARTH P,et al. Spo0A differentially regulates toxin production in evolutionarily diverse strains of Clostridium difficile[j]. PLoS One,2013,8(11): e 收稿日期 : 修回日期 :

41 37 论著 安徽省滁州市儿童医院 2014 年临床分离菌的耐药性监测 陈玲, 曹明杰, 谢强, 徐添天 摘要 : 目的了解滁州市儿童医院 2014 年常见病原菌的临床分布及耐药情况 方法回顾性分析各类临床标本分离菌的分布及耐药性 结果 2014 年共分离细菌 382 株, 其中革兰阳性菌 143 株, 占 37.4 % ; 革兰阴性菌 239 株, 占 62.6 % 居前 5 位的细菌分别是 : 大肠埃希菌 (18.8%) 肺炎克雷伯菌(16.8 %) 凝固酶阴性葡萄球菌(13.1%) 肺炎链球菌(9.4%) 和金黄色葡萄球菌 (9.2%) 葡萄球菌属中 MRSA 和 MRCNS 的检出率分别为 28.6 % 和 76.0 % 葡萄球菌属中未见达托霉素 利奈唑胺和万古霉素的耐药株 肠球菌属中粪肠球菌和屎肠球菌对达托霉素 利奈唑胺和万古霉素全部敏感 未检出青霉素耐药肺炎链球菌 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBL) 菌株的检出率分别为 58.3 % 和 28.1 % 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类最敏感,188 株肠杆菌科细菌中检出 3 株碳青霉烯类耐药株, 检出率为 1.6 % 铜绿假单胞菌除对哌拉西林的耐药率为 13.3 % 和对左氧氟沙星的耐药率为 6.7 % 外, 对其余所测抗菌药物全部敏感 不动杆菌属对碳青霉烯类的敏感率最高, 仅检出 1 株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌, 检出率为 4.3 % 结论 2014 年该院临床分离菌以革兰阴性菌为主, 多重耐药率较高, 尤其是碳青霉烯类耐药肠杆菌料细菌的出现, 对临床抗感染治疗构成严重威胁, 应引起足够重视, 加强耐药性监测 关键词 : 耐药性 ; 多重耐药 ; 抗菌药物中图分类号 :R378 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Surveillance of antimicrobial resistance in the clinical isolates from Children's Hospital of Chuzhou during 2014 CHEN Ling, CAO Mingjie, XIE Qiang, XU Tiantian. (Department of Laboratory Medicine, Chuzhou First Hospital, Chuzhou Anhui , China) Abstract: Objective To investigate the distribution and antimicrobial resistance of the clinical isolates from Children's Hospital of Chuzhou during Methods A retrospective analysis was conducted with the bacterial strains isolated from various clinical specimens in Results A total of 382 clinical isolates were collected during 2014, of which gram positive organisms and gram negative organisms accounted for 37.4 % and 62.6 %, respectively. The top 5 most frequently isolated microorganisms were E. coli (18.8 %), K. pneumoniae (16.8 %), coagulase negative Staphylococcus (13.1 %), S. pneumoniae (9.4 %) and S. aureus (9.2 %). The prevalence of MRSA was 28.6 % in S. aureus and the prevalence of MRCNS was 76 % in CNS. All staphylococcal strains were susceptible to daptomycin, linezolid and vancomycin. All the E. faecalis and E. faecium isolates were sensitive to daptomycin, linezolid and vancomycin. All the S. pneumoniae strains were susceptible to penicillin. The prevalence of extended spectrumlactamases (ESBLs) positive strains was 58.3 % in E. coli and 28.1 % in K. pneumoniae. The Enterobacteriaceae strains were highly sensitive to carbapenems. Only 3 (1.6 %) carbapenem-resistant strains were identified in the Enterobacteriaceae isolates. About 13.3 % and 6.7 % of the P. aeruginosa isolates were resistant to piperacillin and levofloxacin, respectively. All the P. aeruginosa strains were sensitive to the other antimicrobial agents. The percentage of carbapenem-resistant Acinetobacter strains 作者单位 : 安徽省滁州市第一人民医院检验科, 安徽滁州 作者简介 : 陈玲 (1967-), 女, 本科, 副主任检验师, 主要从 was lower than 10 %. Only one carbapenem-resistant A. 事临床检验诊断方面的研究 baumannii strain was identified. Conclusions Gram negative 通信作者 : 陈玲, @qq.com microorganisms account for most part of the clinical bacterial

42 38 isolates in The antimicrobial resistance is still very serious in this hospital, especially the emergence of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, which is of great concern. Key words: antimicrobial resistance; multi-drug resistance; antimicrobial agent 近年来, 随着广谱抗菌药物在临床上的广泛使用, 导致细菌对常用抗菌药物的耐药率逐年增高, 多重耐药和广泛耐药株在临床上不断出现, 细菌耐药问题已成为严重的公共卫生问题 本院同时参加全国细菌耐药监测网和安徽省细菌耐药监测网的监测工作, 为临床合理使用抗菌药物提供参考依据 现将滁州市第一人民医院附属儿童医院 2014 年临床分离菌的分布及其耐药性监测结果进行总结, 报道如下 1 材料与方法 1.1 材料 菌株来源收集本院附属儿童医院 2014 年 1-12 月的临床分离菌 382 株, 剔除同一患者相同部位的重复菌株 药敏纸片和培养基药敏纸片和药敏试验用 MH 琼脂培养基均购自英国 OXOID 公司,E 试验条购自法国生物梅里埃公司 质控菌株大肠埃希菌 ATCC 铜绿假单胞菌 ATCC 金黄色葡萄球菌( 金葡菌 ) ATCC 粪肠球菌 ATCC 流感嗜血杆菌 ATCC 和肺炎链球菌 ATCC 49619, 均购自卫生部临床检验中心 1.2 方法 菌株鉴定和药敏试验采用德国西门子公司的 MicroScanWalkAway 96 PLUS 全自动细菌鉴定仪及配套的 NC50 和 PC33 检测卡对临床菌株进行鉴定和药敏试验 补充药敏试验 ( 头孢唑林 头孢曲松和厄他培南 ) 采用纸片扩散法 药敏试 验结果根据 CLSI 2014 标准判断 [1] 甲氧西林耐药葡萄球菌 (MRS) 和产 ESBL 株的检测 MicroScan WalkAway 96 PLUS 全自动细菌鉴定仪根据鉴定和药敏结果自动判断 MRS 和产 ESBL 株 肺炎链球菌青霉素 E 试验用 1 μg / 片的苯唑西林纸片测定, 抑菌圈直径 20 mm 为青霉素敏感肺炎链球菌, 当抑菌圈直径 19 mm 时, 用青霉素 E 试验测其 MIC 值, 按 CLSI 2014 脑膜炎和非脑膜炎肺炎链球菌标准, 分别判定敏感 中 介和耐药株 1.3 统计分析使用 WHONET 5.6 软件对实验结果进行统计分析 2 结果 2.1 细菌分布 2014 年共收集临床非重复菌株 382 株, 其中革兰阳性菌 143 株, 占 37.4 %; 革兰阴性菌 239 株, 占 62.6 % ; 住院患者分离株占 99.5 %, 门诊患者分离株占 0.5 % ; 菌株来源于痰液 血液 尿液 分泌物 粪便和咽拭子, 分别为 293 株 (76.7%) 60 株 (15.7%) 17 株 (4.5%) 8 株 (2.1%) 2 株 (0.5%) 和 2 株 (0.5%) 菌株分布见表 1 其中, 痰液标本中分离菌主要为大肠埃希菌 64 株 (21.8%) 肺炎克雷伯菌 60 株 (20.5%) 肺炎链球菌 35 株 (11.9%) 和金葡菌 32 株 (10.9%); 血液标本中分离菌主要为凝固酶阴性葡萄球菌 47 株 (78.3%) 粪肠球菌 2 株 (3.3%) 和大肠埃希菌 2 株 (3.3%); 尿液标本中分离菌主要为屎肠球菌 7 株 (41.2%) 大肠埃希菌 4 株 (23.5%) 和肺炎克雷伯菌 2 株 (11.8%) 表 年临床分离菌株的分布 Table 1 Distribution of clinical isolates in 2014 Microorganism Number of strains % E. coli K. pneumoniae Coagulase negative Staphylococcus S. pneumoniae S. aureus E. cloacae P. aeruginosa E. aerogenes A. baumannii A. lwoffii E. faecium E. faecalis S. maltophilia H. influenzae 3 0.8

43 39 表 1( 续 ) Table 1(continued) Microorganism Number of strains % B. cepacia Salmonella spp K. oxytoca S. marcescens S. liquefaciens P. mirabilis P. vulgaris C. freundii C. amalonaticus E. avium S. pyogenes S. agalactiae Others Total 主要革兰阳性菌对抗菌药物的耐药率 葡萄球菌属葡萄球菌属中 MRSA 和 MRCNS 的检出率分别为 28.6 % 和 76.0 % 葡萄球菌属细菌对达托霉素 万古霉素和利奈唑胺全部敏感,MRSA 除对庆大霉素和四环素的耐药率低于 MSSA, 对各类测试药物的耐药率高于 MSSA MRCNS 对各类测试药物的耐药率高于 MSCNS, MSCNS 对测试抗菌药物的敏感性较好,MRCNS 对莫西沙星和利福平的耐药率均较低,<16%, 而对奎奴普丁 - 达福普汀的耐药率仅为 2.6 % 见表 肠球菌属 14 株肠球菌属细菌中屎肠球菌 8 株, 占 57.1 % ; 粪肠球菌 4 株, 占 28.6 % ; 其他肠球菌 2 株, 占 14.3 % 肠球菌属细菌对万古霉素 利奈唑胺和达托霉素全部敏感 8 株屎肠球菌对氨苄西林 青霉素 红霉素 左氧氟沙星和环丙沙星全耐药, 对高浓度链霉素和呋喃妥因均敏感 ; 表 2 葡萄球菌属细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 2 Susceptibility of Staphylococcus isolates to antimicrobial agents (%) Antimicrobial agent MRSA (n=10) MSSA (n=25) MRCNS (n=38) MSCNS (n=12) R S R S R S R S Penicillin Oxacillin Ceftriaxone Cefuroxime Cefazolin Erythromycin Ciprofloxacin Moxifloxacin Levofloxacin Tetracycline Clindamycin Gentamicin Rifampin Trimethoprim-sulfamethoxazole Quinupristin-dalfopristin Daptomycin Linezolid Vancomycin 株粪肠球菌对氨苄西林 青霉素 呋喃妥因和利福平全敏感,3 株 (3/4) 对左氧氟沙星和环丙沙星敏感 肺炎链球菌共分离 36 株肺炎链球菌, 对 青霉素 100 % 敏感 具体药敏结果见表 主要革兰阴性菌对抗菌药物的耐药率 肠杆菌科细菌大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产 ESBL 菌株的检出率分别为 58.3 % 和 28.1 %

44 40 表 3 肺炎链球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 3 Susceptibility of S. pneumoniae strains to antimicrobial agents (%) Antimicrobial agent S. pneumoniae (n=36) Penicillin Erythromycin Clindamycin Levofloxacin Trimethoprim-sulfamethoxazole Linezolid Vancomycin R S 两者对大多数抗菌药物的耐药率明显高于非产 ESBL 株 本次监测中检出 3 株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌 (CRE)( 对亚胺培南和美罗培南中任一种药物耐药者 ), 检出率为 1.6 % 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌和其他肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率见表 不发酵糖革兰阴性杆菌铜绿假单胞菌除对哌拉西林的耐药率为 13.3 % 和对左氧氟沙星的耐药率为 6.7 % 外, 对其余所测抗菌药物全敏感 不动杆菌属细菌中的鲍曼不动杆菌和洛菲不动杆菌对所测抗菌药物的敏感率较高, 仅检出 1 株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌, 检出率为 4.3 %, 见表 5 表 4 肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 4 Susceptibility of Enterobacteriaceae species to antimicrobial agents (%) Antimicrobial agent E. coli (n=72) K. pneumoniae (n=64) Enterobacter (n=45) R S R S R S Ampicillin Piperacillin Piperacillin-tazobactam Aztreonam Cefepime Cefotaxime Ceftazidime Ceftriaxone Cefazolin Cefoxitin Tetracycline Ciprofloxacin Levofloxacin Gentamicin Amikacin Tobramycin Trimethoprim-sulfamethoxazole Imipenem Meropenem Ertapenem 讨论本次监测结果显示,2014 年滁州市儿童医院共分离出非重复菌株 382 株, 其中革兰阳性菌占 37.4 % ; 革兰阴性菌占 62.6 % 细菌分布前 5 位的分别是 : 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 凝固酶阴 性葡萄球菌 肺炎链球菌和金葡菌 肺炎链球菌是引起儿童肺炎的主要病原菌, 检出率为 9.4 %, 明显高于滁州地区 2013 年细菌耐药监测的结果, 其检出率仅为 0.4 % [2] 葡萄球菌中 MRSA 和 MRCNS 的检出率分别为 28.6 % 和 76.0 %, 均低于 2014 年 CHINET 监

45 41 表 5 不发酵糖革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 5 Susceptibility of non-fermentative gram-negative bacilli to antimicrobial agents (%) Antimicrobial agent 测数据的 44.6 % 和 83.0 % [3] 本结果中,MRCNS 主要来自新生儿病区的血培养标本, 由于新生儿 体重较轻, 所以来自新生儿病区的血培养均为单 侧单瓶送检, 结合临床和再次送检的结果显示, MRCNS 存在外源性污染的可能性 本结果中的 MRSA 主要来自痰液标本, 菌株是否存在克隆播 散, 有待进一步研究 监测显示 MRSA 对常用抗 菌药物的耐药率明显高于 MSSA, 未检出对达托 霉素 利奈唑胺和万古霉素耐药的葡萄球菌, 葡 萄球菌对喹诺酮类 利福平和甲氧苄啶 - 磺胺甲 唑保持着较高的敏感性, 这些药物可用于葡萄球 菌感染的经验性治疗用药, 但喹诺酮类禁用于儿 童患者 肠球菌属中未检出耐万古霉素菌株, 屎 肠球菌对常用抗菌药物 ( 除达托霉素 利奈唑胺 和万古霉素外 ) 的耐药率明显高于粪肠球菌, 这 与秦惠宏等 [4] Acinetobacter spp (n=23) 报道一致 本次共检出肺炎链球菌 36 株, 未发现对青霉素耐药的菌株 P. aeruginosa (n=15) R S R S Piperacillin Piperacillin-tazobactam Cefepime Ceftazidime Ciprofloxacin Levofloxacin Tobramycin Gentamicin Amikacin Imipenem Meropenem Trimethoprim-sulfamethoxazole 本结果中, 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产 ESBL 的检出率分别为 58.3 % 和 28.1 %, 低于有关 文献报道 [4-5] 目前碳青霉烯类药物对肠杆菌科细 菌仍保持着高度活性, 但随着该类药物在临床上 的广泛使用,CRE 也逐年增加, 尤其以耐碳青霉 烯类的肺炎克雷伯菌最为常见 [6] 本次监测中共 检出 3 株 CRE, 检出率为 1.6 %, 显著低于 2014 年 CHINET 的监测数据 [3] 产 ESBL 的检出率和 CRE 的检出率均较低, 这可能与儿童患者所使用 的抗菌药物较单一, 使用较规范有关 不发酵糖革兰阴性杆菌, 在滁州儿童医院以 铜绿假单胞菌和不动杆菌属检出率最高 本次结 果显示, 铜绿假单胞菌除对哌拉西林的耐药率为 13.3 % 和对左氧氟沙星的耐药率为 6.7 % 外, 对其 余所测抗菌药物全部敏感 ; 不动杆菌属细菌中的 鲍曼不动杆菌和洛菲不动杆菌对所测抗菌药物的 敏感率较高, 仅检出 1 株耐碳青霉烯类鲍曼不动 杆菌, 检出率为 4.3 % 本次监测结果表明,2014 年滁州儿童医院分 离菌对抗菌药物产生了不同程度的耐药, 同时也 检出了碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌和鲍曼不 动杆菌, 尤其 CRE 的出现, 应引起高度重视 所 以, 临床医师应根据药敏结果合理选用抗菌药物, 加强手卫生和多重耐药菌患者的隔离, 延缓多重 耐药菌的产生和传播 参考文献 [1] [2] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for Antimicrobial susceptibility testing [S]. 2014,M100-S24. 谢强, 曹明杰, 陶良萍, 等. 安徽省滁州地区 2013 年细菌 耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,2015,15(2): [3] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等 年 CHINET 中国细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,2015,15(5): [4] 秦惠宏, 孔菁, 王春, 等 年上海市儿童医院细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,2015,15(2): [5] 杨青, 陈晓, 孔海深, 等. Mohnarin 2011 年度报告 :0 ~14 岁儿童细菌耐药监测 [J]. 中华医院感染学杂志,2012,22(24): [6] PENA I,PICAZO JJ,RODRÍGUEZ-AVIAL C,et al. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in a tertiary hospital in Madrid,Spain :high percentage of colistin resistance among VIM-1-producing Klebsiella pneumoniae ST11 isolates [J]. Int J Antimicrob Agents,2014,43(5): 收稿日期 : 修回日期 :

46 42 论著 MicroScan WalkAway 仪器对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌检测能力的评价 赵志常 1, 刘茂柏 1, 李彬 *, 陈玮媛 2, 张婧玲 2, 黄丽雅 2, 刘蕊 2, 林齐立 2 摘要 : 目的评价 MicroScanWalkAway 96 Plus (MSW) 全自动微生物分析仪在碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 (CRE) 鉴定与预警中的指导价值 方法同时用 PCR 法和 MSW 系统检测福建医科大学附属协和医院实验室保存的 81 株 CRE 以纸片扩散法和 PCR 法为金标准, 比较该分析仪器对 CRE 菌株鉴定及预测是否产碳青霉烯酶的可靠性 结果 MSW 判定 CRE 的符合率为 69.1 %(56/81) PCR 检测有 48 株细菌携带碳青霉烯类耐药基因 ; 仪器法检测这些菌株时, 高级专家系统 (AES) 预测产碳青霉烯酶的灵敏度为 93.8 %, 特异度为 42.4 %, 阳性预测值为 70.3 %, 阴性预测值为 82.4 %, 准确度为 72.8 % 结论 MSW 系统对 CRE 具有较强的检测能力 关键词 :MicroScan WalkAway 96 Plus 仪器 ; 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 ; 高级专家系统中图分类号 :R378.2 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Evaluation on the performance of MicroScan WalkAway in detecting carbapenem-resistant Enterobacteriaceae ZHAO Zhichang, LIU Maobai, LI Bin, CHEN Weiyuan, ZHANG Jingling, HUANG Liya, LIU Rui, LIN Qili. (Department of Pharmacy, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou , China) Abstract: Objective To investigate the performance of MicroScan WalkAway 96 Plus (MSW) system in detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE). Methods A total of 81 stock CRE strains were used in this study. Bacterial identification and antimicrobial susceptibility test were performed by MSW system. Beta-lactamases genes bla KPC, bla IMP, bla VIM, bla OXA-48 and bla NDM were amplified by PCR and subjected to sequencing analysis. Disk diffusion method and PCR were used as gold standard to evaluate the performance and reliability of MSW system in identifying carbapenem-resistant and carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae. Results Overall, 69.1 % (56/81) of the Enterobacteriaceae strains were identified as CRE by the MSW system. The results of PCR showed that 48 strains were carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. When carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae strains were identified by the instrument using an advanced expert system, the sensitivity was 93.8 % and specificity was 42.4 %. The positive predictive value was 70.3 %, the negative predictive value was 82.4 % and the predictive accuracy value was 72.8 %. Conclusions The MicroScan WalkAway 96 Plus system has shown good performance in detection of CRE. Key words: MicroScan WalkAway 96 Plus system; carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; advanced expert system 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 福建省高校杰青项目 (JA13134); 福建省卫计委中青年骨干人才培养项目 (2015-ZQN-ZD-15) 作者单位 :1. 福建医科大学附属协和医院药剂科, 福州 ; * 检验科 ; 2. 福建医科大学医学与技术工程学院 作者简介 : 赵志常 (1982-), 女, 硕士研究生, 主要从事细菌耐药机制研究 通信作者 : 李彬, leonlee307@hotmail.com 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 (CRE) 常表现出多重耐药或广泛耐药的特点 ;CRE 形成的机制很多, 其中产碳青霉烯酶是主要原因之一 [1] CRE 给临床治疗用药增加了很大的困难, 应予高度重视, 根据细菌对药物的敏感性制定治疗方案, 减少细菌耐药性的产生, 提高治疗效果 MicroScan WalkAway 96 Plus (MSW) 全自动微生物分析仪可以便捷快速地鉴定药敏信息, 已在临床广泛使用

47 43 本研究拟探讨该系统在 CRE 检测和预测产碳青霉 1.4 耐药基因的 PCR 检测及基因测序 煮沸法制备细菌 DNA 模板 参照文献采用 烯酶的可靠性和临床价值 1 PCR 检测碳青霉烯类耐药基因 A 组 KPC GES 材料与方法 1.1 SME IMI 和 NMC-A B 组 NDM-1 IMP VIM 实验菌株 SPM 和 GIM D 组 OXA-48 测序阳性产物确定 收集 2011 年 8 月 3 日 2012 年 8 月 3 日福建 基因型 [2] 1.5 MSW 仪器 AES 性能指标 医科大学附属协和医院通过纸片扩散法确认 CRE AES 是自动化仪器中自带的软件程序 可以 81 株 CRE 为对亚胺培南 美罗培南或多利培南 用来代替有丰富经验的专家审核 该系统能产生 任一耐药的肠杆菌科细菌 1.2 主要仪器与试剂 自动检测报告中的技术错误和异常的药物表型 MicroScanWalkAway 96 Plus 全自动微生物分 AES 每天审核异常药敏规则 使检验医师可对报 析仪 德国西门子公司 SIEMENS NC 50 鉴定 告进行修订或重复处理 本研究以 PCR 扩增检测 药敏卡 1.3 细菌鉴定与药敏试验 的碳青霉烯酶基因为金标准 进行 AES 提示产碳 青霉烯酶的相关性能指标的统计分析 以 MSW 全自动微生物分析仪 SIEMENS NC 50 鉴定药敏卡进行细菌鉴定与药敏试验 并对仪 2 结果 器高级专家系统 AES 的提示产碳青霉烯酶信息 2.1 MSW 检测 CRE 菌株对临床常用抗菌药物的 进行统计 SIEMENS NC 50 鉴定药敏卡质控菌株 敏感性 81 株 CRE 菌株对临床常用抗菌药物的敏感率 根据仪器系统要求选择产酸克雷伯菌 ATCC 和耐药率 见图 1 和大肠埃希菌 ATCC The cefepime-intermediate strains are susceptible-dose dependent. Figure 图 1 81 株 CRE 菌株对临床常用抗菌药物的敏感率和耐药率 Susceptibility profile of 81 strains of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae to commonly used antimicrobial agents CRE 菌株的分布和 MSW 系统鉴定 CRE 菌株分布及 MSW 系统鉴定见表 1 以纸 片扩散法为比对标准 MSW 判定 CRE 菌株的符 合率为 69.1 % 56/81 其中肺炎克雷伯菌的符合 率最高 为 86.1 % 31/36 而大肠埃希菌的符合 率仅为 38.9 % 7/ PCR 和 MSW AES 系统检测 81 株 CRE 中碳青霉烯酶阳性菌株经 PCR 证 实有 48 株携带产碳青霉烯类耐药基因 而 MSW AES 系统提示碳青霉烯酶阳性菌株共 64 株 见表 PCR 基因分型和 MSW 判定 PCR 扩增碳青霉烯酶基因及测序结果的碳青 表 1 CRE 菌株的分布和 MSW 对不同菌种鉴定情况 Table 1 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains identified by the MSW system Species CRE identified Coincidence rate of Strain/ Percentage/ by WalkAway CRE detection using n % System /n WalkAway AES / % E. coli K. pneumoniae E. cloacae E. aerogenes K. oxytoca a S. marcescens Total CRE carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. a The figure represents number of strains.

48 44 表 2 CRE 菌株的 PCR 提示产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌和 MSW 提示碳青霉烯酶阳性菌株对比 Table 2 Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae strains identified by PCR versus the advanced expert system of MicroScan WalkAway 96 Plus Species CPE identified by PCR /n CPE identified by WalkAway AES /n E. coli (n=18) 7 8 K. pneumoniae (n=36) E. cloacae (n=21) E. aerogenes (n=1) 0 1 K. oxytoca (n=4) 2 4 S. marcescens (n=1) 0 0 Total (n=81) CPE,carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. 霉烯酶基因型分布见表 3 在 48 株携带不同碳青霉烯酶基因型的 CPE 菌株中,MSW 判定为 CRE 菌株的能力以及 AES 检测碳青霉烯酶阳性的提示情况有所不同, 见表 MSW AES 检测碳青霉烯酶的参数指标以 PCR 扩增及基因测序的结果为金标准, MSW AES 检测碳青霉烯酶的灵敏度为 93.8 %, 特异度为 42.4 %, 阳性预测值为 70.3 %, 阴性预测值为 82.4 %, 准确度为 72.8 %, 见表 5 3 讨论碳青霉烯类抗生素被认为是目前治疗多重耐药肠杆菌科细菌感染的最有效药物, 然而随着后抗生素时代的到来,CRE 的检出率呈逐年上升的 表 3 碳青霉烯酶基因型病原菌构成 Table 3 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in terms of carbapenemase genotype Species IMP-4 IMP-8 NDM-1 KPC-2 n % n % n % n % E. coli NA 0 NA K. pneumoniae a NA 6 NA E. cloacae NA 1 NA E. aerogenes NA 0 NA K. oxytoca b NA 1 NA S. marcescens NA 0 NA Total NA 8 NA a One strain produces both IMP-4 and NDM-1. b One strain produces both KPC-2 and IMP-8. NA,not appropriate. Table 4 表 4 MSW 对不同碳青霉烯酶基因型菌株的判定和提示产酶情况 Performance of MicroScan WalkAway 96 Plus in differentiation of different carbapenemase genotypes of carbapenemresistant Enterobacteriaceae strains Genotype Number of positive isolates using PCR a Number of CRE detected by WalkAway Coincidence rate of CRE detection using WalkAway Number of CPE detected by WalkAway Coincidence rate of CPE detection using WalkAway AES IMP % % IMP % % KPC b 8 8 b NDM b 5 5 b CRE,carbapenem-resistant Enterobacteriaceae ;CPE,carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. a One strain produces both IMP-4 and NDM-1,and one strain produces both KPC-2 and IMP-8. b The figures are number of strains. 趋势 [3], 在临床治疗用药上增加了难度 本研究分 离的 CRE, 分别以纸片扩散法和 PCR 法检测基因 型为金标准, 统计分析 MSW 检测 CRE 菌株的性 能指标, 探讨全自动微生物分析仪对 CRE 菌株鉴 定与预警的指导价值和临床意义 本研究中 CRE 菌株对临床常用抗生素耐药情

49 45 表 5 MSW AES 检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的参数指标 Table 5 Performance of MicroScan WalkAway 96 Plus advanced expert system in predicting carbapenemase production of Enterobacteriaceae strains Results of detection using WalkAway system Positive PCR 况严重, 对头孢菌素类和头霉素类耐药率尤为突 出 ( 均 >90 %) 值得关注的是其对氨基糖苷类抗 生素阿米卡星耐药率最低, 提示临床治疗时可适 当考虑选择该药物 此外, 收集到的菌株以肺炎 克雷伯菌最多, 与现阶段的碳青霉烯类耐药肠杆 菌科细菌的分布相符 [3-4] 但从 CRE 菌株的分布数 据可见 CRE 已出现在多个肠杆菌科种属中, 这需 引起我们的高度重视 MSW 判定 CRE 的符合率 为 74.1 %, 其中大肠埃希菌的符合率较低 (38.9 %) 以往研究也发现 MSW 在检测 CRE 时的灵敏度和 特异度有限, 且有时也存在漏检 [5-6] 因此, 当临 床实验室使用 MSW 判定待测大肠埃希菌是否为 CRE 菌株时, 应考虑结合使用纸片扩散法或琼脂 稀释法加以验证, 以确保无漏检 Negative MSW AES 一般是根据药敏结果中所有第三 代头孢菌素和碳青霉烯类的亚胺培南与厄他培南 结果进行推断肠杆菌科细菌是否产生碳青霉烯酶 当第三代头孢菌素不敏感, 且同时亚胺培南或厄 他培南不敏感时, 仪器则会推断该菌株产酶 在 本研究中 MSW AES 检测 CRE 菌株的碳青霉烯酶 阳性提示率比 PCR 法检测其中的碳青霉烯酶基因 的检出率高, 这可能是因为 MSW 仅是表型监测, 其他非基因因素 ( 如生长温度 ph 值等环境因素 ) 引起的假阳性影响检出率, 也可能与 PCR 未检测 到的其他当前未知碳青霉烯酶基因有关 [7] Total Positive Negative Total 此外,MSW 判定为 CRE 的菌株数少于 AES 提示碳青霉烯酶阳性的菌株数 出现这种矛盾结 果, 我们分析可能是由于一些菌株出现碳青霉烯 类抗生素中介 ( 如本仪器配套药敏卡中的 3 种药 物 ), 因而仪器并未判定为 CRE 因此, 当日常工 作中遇到此类矛盾结果时, 我们建议实验室应加 贴碳青霉烯类药敏纸片, 如果条件允许, 分子生物学方法 ( 如 PCR) 也可考虑使用 MSW 及其 AES 对携带有 IMP VIM NDM-1 或 KPC 的 CRE 的判定能力均较高 ( 见表 4) 但值得注意的是携带 IMP-8 的 CRE 菌株存在差异, AES 预警信息相对于仪器对 CRE 直接鉴定上似乎更有优势 (93.0% 对 78.6 %) 这也再次给实验室一个提醒, 实际操作中我们应该更加重视 AES 系统提示信息! 由于本次研究菌株的数量与菌属种类有限, 且可供参考的国内相关报道较少, 因此, 有必要使用更多的样本来减少实验中的偶然误差, 进一步确认此仪器判定 CRE 的性能 总之,MSW 和 AES 预测 CRE 菌株快速简便, 灵敏度好, 可信度高, 适宜在临床实验室中常规使用, 但必要时仍需要结合纸片扩散法, 以防止漏检 参考文献 [1] NORDMANN P,DORTET L,POIREL L. Carbapenem resistance in Enterobacteriaceae :here is the storm [J]. Trends Mol Med,2012,18(5): [2] LI B,XU XH,ZHAO ZC, et al. High prevalence of metallo-βlactamase among carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniaein a teaching hospital in China [J]. Can J Microbiol,2014,60(10): [3] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等 年中国 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,2014,14(5): [4] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等. CHINET 检测 2010 年碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌的分布特点和药物敏感性 [J]. 中国感染与化疗杂志,2013,13(1):1-7. [5] WOODFORD N,EASTAWAY AT,FORD M,et al. Comparison of BD Phoenix,Vitek 2,and MicroScan automated systems for detection and inference of mechanisms responsible for carbapenem resistance in Enterobacteriaceae [J]. J Clin Microbiol,2010,48(8): [6] Gordon NC,Wareham DW. Failure of the MicroScanWalkAway system to detect heteroresistance to carbapenems in a patient with Enterobacter aerogenes bacteremia [J]. J Clin Microbiol, 2009,47(9): [7] 魏丹丹, 刘洋, 万腊根.Vitek 2 Compact 和 MicroScanWalk Away 40 SI 检测 MRSA 的性能评价 [J]. 实验与检验医学, 2014,32(5): 收稿日期 : 修回日期 :

50 46 论著 喹诺酮类耐药福氏志贺菌的相关耐药基因研究 张雯霞 1, 张珏 1, 陈洪友 2, 屠丽红 2, 陈敏 2 摘要 : 目的 了解 年上海市各区县医院 139 株福氏志贺菌的耐药性, 探讨福氏志贺菌对喹诺酮类药物的耐药 机制 方法 用纸片扩散法测定菌株对 14 种抗菌药物的敏感性, 用环丙沙星 E 试验条测定其最低抑菌浓度 ; 采用 PCR 法 检测 DNA 旋转酶 A 亚单位 (gyra) 拓扑异构酶 Ⅳ C 亚单位 (parc) 基因的喹诺酮类药物耐药决定区 (QRDR), 同时对 质粒介导喹诺酮类耐药 (PMQR) 基因 qnra qnrb qnrs 和氨基糖苷乙酰转移酶变异基因 aac(6')-ib-cr 进行筛选 扩增 产物进行 DNA 测序 结果 福氏志贺菌对氨苄西林 链霉素 四环素 萘啶酸的耐药率都达到了 90 % 以上, 对环丙沙星 的耐药率达到了 40.3 %, 同时有 30.2 % 菌株对头孢吡肟产生了耐药 gyra 和 parc 基因的突变率分别为 98.6 % 和 97.8 % gyra 基因存在 Ser83 Asp87 和 His211 3 个位点的突变,parC 基因只检测到 Ser80 1 个位点的突变 ; 共检测到 9 株 qnrs 和 6 株 aac(6')-ib-cr 喹诺酮耐药质粒 结论 上海地区福氏志贺菌耐药情况严重 QRDR 相关基因突变率高,Asp87 的突变 对喹诺酮类抗菌药物的耐药起着主导作用, 而耐药质粒起着重要的辅助作用 关键词 : 志贺菌 ; 喹诺酮类 ; 耐药基因 中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Genes conferring quinolone resistance in Shigella flexneri ZHANG Wenxia, ZHANG Jue, CHEN Hongyou, TU Lihong, CHEN Min. (Department of Clinical Laboratry, Shanghai Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditionaly Chinese Medicine, Shanghai , China) Abstract: Objective To investigate the antimicrobial resistance profile of Shigella flexneri in Shanghai from 2010 to 2014 and examine the mechanism of fluoroquinolone resistance. Methods Kirby-Bauer method was used to determine the susceptibility of the S. flexneri strains to 14 antibiotics. The minimum inhibitory concentration (MIC) of ciprofloxacin was tested by E-test. Mutations within quinolone resistance determining regions (QRDR) of gyra and parc and plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes, qnra, qnrb, qnrs and aac(6')-ib-cr were identified by polymerase chain reaction (PCR). All the products were subjected to sequencing analysis. Results More than 90 % of the 139 S. flexneri isolates were resistant to ampicillin, streptomycin, tetracycline, and nalidixic acid, 40.3 % to ciprofloxacin and 30.2 % to cefepime, respectively. Genetic mutation of gyra and parc was found in 98.6 % and 97.8 % of the strains, respectively. Three point mutations (Ser83, Asp87 and His211) were detected in gene gyra and one point mutation (Ser80) was found in in gene parc. Plasmid-mediated resistant gene qnrs was found in 9 strains and aac(6')-ib-cr in 6 strains. Conclusions The antibiotic resistance of S. flexneri is serious in Shanghai. The mutation rate within QRDR is high. Point mutation in Asp87 of gyra is the main mechanism of quinolone resistance. The plasmid-mediated quinolone-resistant genes also play an important supplementary role. Key words: Shigella; quinolone; resistant gene 基金项目 : 上海市公共卫生重点学科卫生微生物学 (12GWZX 0801) 作者单位 : 1. 上海中医药大学附属曙光医院检验科, 上海 ; 2. 上海市疾病预防控制中心细菌检测实验室 作者简介 : 张雯霞 (1981 ), 女, 硕士, 主管技师, 主要从事肠道致病菌耐药机制研究 通信作者 : 陈敏, chenmin@scdc.sh.cn 细菌性痢疾是全世界范围内流行的最常见的腹泻性疾病之一, 亚洲每年感染志贺菌的患者约 1.25 亿例, 死亡人数达 1.4 万例 [1] 合理的抗菌治疗可有效减轻症状, 降低并发症发生的风险 氟喹诺酮类药物一直是临床治疗细菌性痢疾的一线抗菌药物 然而随着此类药物的广泛应用, 志贺

51 47 菌对氟喹诺酮类药物的耐药性不断增加, 特别是福氏志贺菌的耐药情况更加严重 为了解福氏志贺菌的耐药情况和对喹诺酮药物的耐药机制, 本研究对 年从上海各区县医院临床分离的 139 株福氏志贺菌进行了抗菌药物敏感性试验, 并对喹诺酮类药物耐药决定区 (QRDR) 相关基因, 即 DNA 旋转酶 A 亚单位 (gyra) 拓扑异构酶 Ⅳ C 亚单位 (parc) 进行检测, 对质粒介导喹诺酮耐药 (PMQR) 基因 qnra qnrb qnrs 和 aac(6')- Ib-cr 进行筛选 现将结果报道如下 1 材料与方法 1.1 材料 菌株来源收集上海市各区县医院 年从门诊腹泻患者中分离得到 139 株福氏志贺菌, 经法国生物梅里埃 VITEK2 生化鉴定仪鉴定, 并用日本 Denka Seiken 生研公司的志贺菌诊断血清进行血清学确认 PMQR 基因 PCR 筛选的 qnra qnrb qnrs 和 aac (6')-Ib-cr 阳性对照株均由复旦大学附属华山医院抗生素研究所赠送 仪器和试剂药敏纸片 MH 琼脂 E 试验条购自英国 OXOID 公司 ; 细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自德国 Qiagen 公司 ;TaKaRa ExTaq DNA 聚合酶 TaKaRa DL2000 DNA Maker Agarose 琼脂糖购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ; 溴化乙锭 (EB) 购自美国 Sigma 公司 ;PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成 主要仪器包括 PCR 基因扩增仪 (Bio-Rad DNA Engine Dyad) 脉冲场凝胶电泳仪 (Bio-Rad CHEF Mapper) 凝胶成像系统 (Bio-Rad GEL Doc2000) 1.2 方法 药物敏感性试验药物敏感性试验采用改良的纸片扩散法和最低抑菌浓度法 抗菌药物包括氨苄西林 环丙沙星 头孢噻肟 头孢吡肟 甲氧苄啶 - 磺胺甲唑 左氧氟沙星 阿莫西林 - 克拉维酸 氯霉素 头孢西丁 萘啶酸 诺氟沙星 链霉素 四环素 磺胺复合物等 14 种 质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922, 结果判断参照 2015 年美国临床和实验室标准化协会 (CLSI) 标准 [2] PCR 扩增试验细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌株的基因组 DNA,PCR 法检测 QRDR 相关基因 gyra parc 和 PMQR 基因 qnra qnrb qnrs aac (6')-Ib-cr 引物序列长度及退火温度见表 1 [3-8], 扩增条件 :94 预变性 2 min ;94 1 min,54~61 1 min,72 1 min,35 个循环 ; 72,4 min PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳, EB 染液染色, 在紫外灯下观察结果, 且采用 GEL Doc 2000 凝胶成像系统凝胶成像, 出现与阳性对照相当的目的条带即判为阳性 DNA 测序 PCR 扩增产物原液送上海迈浦生物科技有限公司双向测序 测序结果经拼接后在 GenBank 中经 BLAST 进行比对分析 gyra parc 以福氏志贺菌 F2a 301(GenBank 中的参比号为 AE005674) 作为参比菌株 2 结果 2.1 药物敏感性试验 139 株福氏志贺菌对 14 种抗菌药物的敏感性试验结果显示志贺菌的耐药情况严重, 对氨苄西林 链霉素 四环素 萘啶酸的耐药率在 90 % 以上, 分别为 94.2 % 95.0 % 93.5 % 和 98.6 % 对喹诺酮类抗菌药物环丙沙星的耐药率达到了 40.3 %, 同时有 30.2 % 菌株对第四代头孢菌素头孢吡肟产生了耐药, 见表 QRDR 相关基因的突变分析 139 株福氏志贺菌中,137 株菌株发生了 gyra 基因的突变, 突变率达到了 98.6 % ; 有 136 株菌株发生了 parc 基因的突变, 突变率达到了 97.8 % gyra 基因检测到 Ser83 Asp87 和 His211 这 3 个位点的点突变, 其中 Ser83 Leu 位点突变的有 137 株,Asp87 Asn 位点突变有 48 株, Asp87 Gly 位点突变有 15 株,His211 Tyr 位点突变有 131 株 ParC 基因只检测到 Ser80 这一个位点的点突变, 其中有 132 株表现为 Ser80 Ile 位点突变,4 株表现为 Ser80 Arg 的位点突变 139 株菌株中, 仅有 2 株未检测到 QRDR 任何氨基酸的突变, 其环丙沙星的 MIC 分别为 和 mg/l, 见表 3 发生氨基酸突变的 137 株福氏志贺菌中有 136 株呈现出 gyra 和 parc 2 个亚基的同时突变, 仅有 1 株只表现为 gyra 基因的突变 其中有 45 株菌株有 gyra 基因的 Ser83 Asp87 His211 3 个位点和 parc 基因 Ser80 位点的同时突变, 占 32.4 %, 其环丙沙星的 MIC 为 2~24 mg/l ; 最为普遍的是 gyra 基因的 Ser83 His211 和 parc 基因 Ser80 这 3 个位点的突变, 占 50.4 % (70/139), 其环丙沙星的 MIC 为 0.19~32 mg/l 56 株环丙沙星耐药的福氏志贺菌中, 有 44 株

52 48 表 1 喹诺酮类耐药相关基因引物序列 Table 1 Primer sequences for amplifying the genes related to quinolone resistance Target gene Primer sequence (5 3 ) Product size /bp Annealing temperature / Reference gyra-r TACACCGGTCAACATTGAGG [3] gyra-f TTAATGATTGCCGCCGTCGG gyrb-r TGAAATGACCCGCCGTAAAGG [4] gyrb-f GCTGTGATAACGCAGTTTGTCCGGG parc-r GTACGTGATCATGGACCGTG [4] parc-f TTCGGCTGGTCGATTAATGC pare-r ATGCGTGCGGCTAAAAAAGTG [4] pare-f TCGTCGCTGTCAGGATCGATAC qnra-r GGCAGCACTATTACTCCCA [5] qnra-f TCAGCAAGAGGATTTCTCA qnrb-r ATGACGCCATTACTGTATAA [6] qnrb-f GATCGCAATGTGTGAAGTTT qnrs-r AGTGATCTCACCTTCACCGC [7] qnrs-f CAGGCTGCAATTTTGATACC aac(6' )-Ib-cr-R TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA [8] aac(6' )-Ib-cr-F CTCGAATGCCTGGCGTGTTT 表 株福氏志贺菌对 14 种抗菌药物的耐药率和敏感率 Table 2 Susceptibility of 139 strains of Shigella flexneri to 14 antimicrobial agents (%) Antimicrobial agent R S Ampicillin Cefotaxime Cefepime Streptomycin Chloramphenicol Amoxicillin-clavulanic acid Tetracycline Sulfonamides Nalidixic acid Ciprofloxacin Norfloxacin Levofloxacin Cefoxitin Trimethoprim-sulfamethoxazole 表现为 Ser83 Asp87 His211 和 Ser80 这 4 个位 点的同时突变, 占 81.5 %, 而在环丙沙星敏感菌 株中没有出现 4 个位点的同时突变 64 株环丙沙 星敏感的福氏志贺菌中, 有 90.6 % 的菌株表现为 表 3 志贺菌 QRDR 氨基酸突变和喹诺酮类药物耐药性关系 Table 3 Relationship of amino acid mutations in QRDR and resistance to quinolones Amino acid mutation / n(%) Ciprofloxacin gyra parc MIC /(mg/l) Ser83 Asp87 His211 Ser80 2 (1.4) 0.006, (50.4) >32 Leu - Tyr Ile 45 (32.4) 2-24 Leu Asn Tyr Ile 4 (2.9) Leu - - Arg 15 (10.8) Leu Gly Tyr Ile 2 (1.4) 32 Leu Asn - Ile 1 (0.7) 4 Leu Asn Tyr - Ser83 His211 和 Ser80 这 3 个位点的同时突变 所有环丙沙星敏感的菌株均未出现 gyra 基因的 Asp87 位点的突变 2.3 喹诺酮耐药质粒的鉴定 139 株福氏志贺菌中, 检测到 9 株 qnrs 和 6 株 aac (6')-Ib-cr 喹诺酮耐药质粒, 分别占 6.5 % 和 4.3 %, 见表 4, 未检测到 qnra 和 qnrb 基因 qnrs 测序结果在 NCBI GenBank 上进行同源性比对, 其 基因核苷酸序列均与注册号为 KP 的 qnrs1 基因序列号同源性为 100 % 携带有 PMQR 基因 的菌株, 其环丙沙星的 MIC 为 0.5~32 mg/l, 同

53 49 时均伴有 gyra 基因的 Ser83 His211 和 parc 基 因 Ser80 这 3 个位点的突变, 除了菌株 SH12-13 和 SH12-33 同时伴有 gyra 基因的 Ser83 Asp87 His211 3 个位点和 parc 基因 Ser80 位点的突变 表 4 QRDR 氨基酸的突变和耐药质粒对环丙沙星 MIC 值的影响 Table 4 Effect of amino acid mutation and resistance plasmid on MIC value of ciprofloxacin Strain Ciprofloxacin MIC /(mg/l) Genes of PMQR Mutations in QRDR gyra parc Ser83 Asp87 His211 Ser80 SH aac(6' )-Ib-cr Leu - Tyr Ile SH aac(6' )-Ib-cr Leu - Tyr Ile SH aac(6' )-Ib-cr Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH aac(6' )-Ib-cr Leu - Tyr Ile SH aac(6' )-Ib-cr Leu - Tyr Ile SH aac(6' )-Ib-cr Leu Asn Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu Asn Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile SH qnrs1 Leu - Tyr Ile MIC,minimum inhibitory concentration ;QRDR,quinolone resistance-determining region ;PMQR,plasmid-mediated quinolone resistance. 3 讨论氟喹诺酮类一直是临床治疗细菌性痢疾的常用抗菌药物, 随着氟喹诺酮类药物在临床以及农业 畜牧业的长期使用, 其耐药率近年来有明显的上升趋势 最近美国 CDC 通过对 2014 年 5 月到 2015 年 2 月的宋内志贺菌进行分析, 发现其对环丙沙星的耐药率达到了 87 % [9] 本研究显示, 福氏志贺菌对环丙沙星 诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率分别达到了 40.3 % 27.3 % 和 11.5 % 这就提示我们有必要对志贺菌进行长期的耐药监测, 以指导临床进行有效用药 氟喹诺酮类的耐药主要是 DNA 旋转酶和拓扑异构酶 Ⅳ 的 QRDR 发生突变所致 [10-11], 通常在 gyra 基因的 Ser83 和 Asp87 氨基酸残基突变的基础上, 进一步发生 parc 基因的 Ser80 和 Glu84 氨基酸残基的替换才会导致肠杆菌科细菌对喹诺酮类药物高水平耐药 [12] 本研究对 139 株福氏志贺菌的研究发现, 所有菌株 gyra 基因的 83 位 丝氨酸都被亮氨酸所替换, 并且同时存在其他位点的突变, 除了 SH10-35 和 SH14-1 这 2 株未检测到 QRDR 任何氨基酸的突变, 其环丙沙星的 MIC 分别为 和 mg/l gyra 基因除了 Ser83 和 Asp87 这 2 个位点突变之外, 同时检测到 His211 这个位点的突变, 其突变率达到了 94.2 % (131/139) His211 Tyr 的氨基酸改变是新发现的突变位点, 乌拉圭于 2014 年在福氏志贺菌中最新检测到这个位点的突变 [13], 在国内未曾有过报道 可见, 上海地区福氏志贺菌在 QRDR 区氨基酸的突变率极高 64 株环丙沙星敏感菌株中, 均未检测到 gyra 基因 Asp87 这个位点的突变 ;56 株环丙沙星耐药菌株中, 只有 9 株未检测到 Asp87 的突变 可见 Asp87 这个位点的突变对喹诺酮类的耐药起着主导作用 首先是 gyra 基因 Ser83 发生突变, 如果联合 His211 或 / 和 parc 基因 Ser80 的突变, 菌株对于喹诺酮类的敏感率就会下降 一旦发生 gyra 基因 Asp87 的突变就很有可能导致菌株对喹诺酮

54 50 类的耐药 之前的研究表明 gyra 基因中 Ser83 和 Asp87 的双重突变与福氏志贺菌对喹诺酮类的耐药 密切相关 [14], 我们的结论与之相符 本研究中发现, 64 株环丙沙星敏感的福氏志贺菌中, 有 90.6 % 的 菌株表现为 Ser83 His211 和 Ser80 这 3 个位点的 同时突变, 如果再合并 Asp87 氨基酸的突变, 那 就会导致菌株对喹诺酮类的耐药 PMQR 是近 10 年来新发现的细菌耐药机制, 耐药质粒是染色体之外, 具有独立自主遗传功能 的双链 DNA, 通过接合转移 转化 转导 转座 及整合等方式进行水平传播, 并可编码一种或多 种抗菌药物的耐药性, 从而传播耐药性 目前已 报道的 PMQR 包括 qnra qnrb qnrc qnrd qnrs aac(6')-ib-cr 和 qepa 其中携带 qnr 基因 的喹诺酮耐药质粒在世界范围流行 在杭州,15 株喹诺酮耐药的志贺菌中检测到 5 株携带 qnrs 耐 药质粒,2 株携带 aac(6')-ib-cr 耐药质粒 [10] 在 安徽,53.8 %(14/26) 志贺菌检测到喹诺酮耐药 质粒, 其中 qnra1 qnrs1 qnrs2 aac(6')-ib-cr 和 qepa 分别占 30.8 % 11.5 % 3.8 % 19.2 % 和 11.5 % [15] 在河南,293 株志贺菌中检测到 6 株携 带有 qepa 基因,19 株携带有 aac(6')-ib-cr 基因, 分别占 2.05 % 和 6.48 % [3] 本研究中,139 株福氏 志贺菌中检测到 qnrs 基因和 aac(6')-ib-cr 各 9 和 6 株, 分别占 6.5 % 和 4.3 %, 未检测到 qnra 和 qnrb 基因 可见, 携带有喹诺酮类耐药质粒的志贺菌 在中国存在的年代已久, 因其能够进行水平传 播, 故质粒所介导的耐药菌株在不断的扩散和蔓 延 同时,PMQR 基因对染色体介导的喹诺酮类 耐药起重要的辅助作用, 使细菌更容易发生高水 平的耐药 [16] 在本研究中,9 株 87 位没有氨基酸 改变却对环丙沙星耐药的菌株中有 7 株携带有喹 诺酮耐药质粒 aac(6')-ib-cr 或 qnrs1, 更加证实 了这一结论 也有研究表明, 在各耐药质粒中, qnrs 基因在菌株的耐药中起到主导作用 [17-18] 我 们的试验结果也与之相符 :9 株携带有 qnrs 耐药 质粒的菌株其环丙沙星的 MIC 均要高于携带有 aac(6')-ib-cr 耐药质粒的菌株, 除了有 1 株菌株 SH10-48, 其环丙沙星的 MIC 达到了 32 mg/l, 而 其携带的是 aac(6')-ib-cr 耐药质粒, 可能是这株 菌株同时存在着其他耐药机制, 导致对喹诺酮 类药物的高度耐药, 值得我们进一步去研究和 探讨 参考文献 [1] BARDHAN P,FARUQUE AS,NAHEED A,et al. Decrease in shigellosis-related deaths without Shigella spp.-specific interventions,asia[j]. Emerg Infect Dis,2010,16(11): [2] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[s]. Twenty fifth informational supplement,2015,m100-s25. [3] YANG H,DUAN G,ZHU J,et al. Prevalence and characterisation of plasmid-mediated quinolone resistance and mutations in the gyrase and topoisomerase IV genes among Shigella isolates from Henan,China,between 2001 and 2008[J]. Int J Antimicrob Agents,2013,42(2): [4] DUTTA S,KAWAMURA Y,EZAKI T,et al. Alteration in the GyrA subunit of DNA gyrase and the ParC subunit of topoisomerase IV in quinolone-resistant Shigella dysenteriae serotype 1 clinical isolates from Kolkata,India[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(4): [5] WANG M,SAHM DF,JACOBY GA,et al. Emerging plasmidmediated quinolone resistance associated with the qnr gene in Klebsiella pneumoniae clinical isolates in the United States[J]. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(4): [6] JACOBY GA,WALSH KE,MILLS DM,et al. qnrb,another plasmid-mediated gene for quinolone resistance[j]. Antimicrob Agents Chemother,2006,50(4): [7] CATTOIR V,WEILL FX,POIREL L,et al. Prevalence of qnr genes in Salmonella in France[J]. J Antimicrob Chemother, 2007,59(4): [8] PARK CH,ROBICSEK A,JACOBY GA,et al. Prevalence in the United States of aac(6')-ib-cr encoding a ciprofloxacinmodifying enzyme[j]. Antimicrob Agents Chemother,2006,50 (11): [9] BOWEN A,HURD J,HOOVER C,et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States,May 2014-February 2015[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2015,64(12): [10] PU XY,PAN JC,WANG HQ,et al. Characterization of fluoroquinolone-resistant Shigella flexneri in Hangzhou area of China[J]. J Antimicrob Chemother,2009,63(5): [11] PAZHANI GP,NIYOGI SK,SINGH AK,et al. Molecular characterization of multidrug-resistant Shigella species isolated from epidemic and endemic cases of shigellosis in India[J]. J Med Microbiol,2008,57(Pt 7): [12] HATA M,SUZUKI M,MATSUMOTO M,et al. Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shigella flexneri 2b[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005, 49(2): [13] AZMI IJ,KHAJANCHI BK,AKTER F,et al. Fluoroquinolone resistance mechanisms of Shigella flexneri isolated in Bangladesh[J]. PLoS One,2014,9(7):e [14] OONAKA K,FUKUYAMA M,TANAKA M,et al. Mechanism

55 51 of resistance of Shigella flexneri 2a resistant to new quinolone antibiotics [J]. Kansenshogaku Zasshi,1998,72(4): [15] XIONG Z,LI J,LI T,et al. Prevalence of plasmid-mediated quinolone-resistance determinants in Shigella flexneri isolates from Anhui Province,China[J]. J Antibiot (Tokyo),2010,63 (4): [16] DAVIES J,DAVIES D. Origins and evolution of antibiotic resistance[j]. Microbiol Mol Biol Rev,2010,74(3): [17] [18] 虞丹丹. 志贺菌流行特性及其对喹诺酮类耐药机制研究 [D]. 温州医学院,2011. PU XY,PAN JC,ZHANG W,et al. Quinolone resistancedetermining region mutations and the plasmid-mediated quinolone resistance gene qnrs played important roles in decreased susceptibility to fluoroquinolones among Shigella isolates in southeast China between 1998 and 2013[J]. Int J Antimicrob Agents,2015,45(4): 收稿日期 : 修回日期 : 信息交流 艾沙康唑和伏立康唑 Isavuconazole versus voriconazole 10 余年前在一项侵袭性曲霉病的随机临床试验中, 已证实伏立康唑疗效优于两性霉素 B, 因此前者被公认为治疗曲霉病的首选抗真菌药 此后相继研发了对曲霉及毛霉有效的新的三唑类药物如泊沙康唑 艾沙康唑 Maertens 和他的研究小组进行了一项随机对照 双盲非劣性试验, 在 527 例侵袭性曲霉病 ( 占 75%) 和其他丝状真菌感染患者中比较艾沙康唑和伏立康唑的疗效 516 例意向性治疗患者中 ( 至少接受 1 剂试验用药 ),84% 患有血液系统恶性疾病,20% 接受异体造血干细胞移植,66% 为中性粒细胞减少症 其中 65 例 (13%) 为侵袭性真菌感染确诊患者, 207 例 (40%) 为很可能患者,196 例 (38%) 为可能患者,48 例 (9%) 无真菌感染的依据 用药第 42 天, 意向性治疗患者中艾沙康唑组的 258 例患者中 48 例 (19%) 死亡, 而伏立康唑组的 259 例患者中 52 例 (20%) 死亡 统计学分析表明艾沙康唑的疗效不比伏立康唑差 接受艾沙康唑和伏立康唑治疗的两组患者药物不良事件的发生率无区别, 但艾沙康唑治疗组患者肝功能损害 视力减退和皮肤软组织损害的发生率均明显低于伏 立康唑组 艾沙康唑硫酸盐为艾沙康唑的前体药, 有口服 和静脉两种剂型 用药的第 1 和第 2 天每 8 小时给 药 200 mg, 之后每天 200 mg 口服药物的生物利 用度可达 98%, 并不受进食的影响, 不经过肾脏清 除, 终末消除半衰期可达 100~130 h, 在体内经细 胞色素氧化酶 CYP3A4 和 CYP3A4 代谢失活 与 伏立康唑相比, 接受艾沙康唑治疗的患者血药浓度 的个体差异不大 同时接受抑制 CYP3A4 药物治 疗的患者, 血清中的艾沙康唑浓度可受影响 本研究中 2 例毛霉病患者, 艾沙康唑治疗有 效 最近的一项研究显示艾沙康唑对毛霉的 MIC 90 高达 4~16 mg/l, 对曲霉 MIC 90 是 1 mg/l 本研究表明, 艾沙康唑治疗侵袭性曲霉感染 的疗效不比伏立康唑差, 患者对艾沙康唑的耐受 性更好, 提示本品长疗程用药可能安全性更好 In the literature. Isavuconazole versus voriconazole. Clin Infect Dis, 2016:62(1June). 丁百兴摘译王明贵审校 收稿日期 :

56 52 论著 应用碳青霉烯酶失活法检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌 牛翠 1, 杨靖 2, 时东彦 2 摘要 : 目的评估碳青霉烯酶失活法 (carbapenem inactivation method,cim) 试验检测耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌产生碳青霉烯酶的能力 方法收集 121 株鲍曼不动杆菌, 应用全自动细菌鉴定仪进行菌株鉴定和药敏试验,CIM 检测鲍曼不动杆菌所含碳青霉烯酶, 应用 PCR 方法检测 OXA-23 型碳青霉烯酶基因 结果 121 株鲍曼不动杆菌中 68 株对亚胺培南和美罗培南耐药, 其中 65 株菌 PCR 显示携带 OXA-23 基因,66 株菌 CIM 试验为阳性 52 株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感, 其中 49 株菌 OXA-23 阴性,52 株菌 CIM 试验全为阴性 1 株菌对亚胺培南耐药 对美罗培南敏感, CIM 试验阴性,OXA-23 阳性 CIM 试验的敏感性和特异性分别为 94.2% 和 98.1% 结论与 PCR 方法相比较 CIM 试验操作简便, 成本小, 结果易读, 易于在实验室开展 应用 CIM 试验可以检测鲍曼不动杆菌 OXA-23 型碳青霉烯酶, 关键词 : 鲍曼不动杆菌 ; 碳青霉烯酶失活法 ; OXA-23 型碳青霉烯酶中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Application of carbapenem inactivation method in detection of carbapenemaseproducing Acinetobacter baumannii NIU Cui, YANG Jing, SHI Dongyan. (Department of Laboratory Medicine, the Third Hospital of Xingtai, Xingtai Hebei , China) Abstract: Objective To evaluate the utility of carbapenem inactivation method (CIM) in detecting carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii. Methods A total of 121 strains of A. baumannii were identified and subjected to antimicrobial susceptibility testing by VITEK compact. Carbapenem inactivation method (CIM) was applied to detect the carbapenemase in the A. baumannii strains. The OXA-23 type carbapenemase-encoding genes were analyzed by common PCR method. Results Six-eight of the 121 strains showed resistance to imipenem and meropenem. PCR showed that 65 of the 68 strains carried OXA-23 gene. CIM was positive in 66 of the 68 strains. And 52 of the 121 A. baumannii strains were susceptible to imipenem and meropenem. PCR showed that OXA-23 gene was negative in 49 of the 52 strains. CIM was negative in the 52 strains of non-carbapenemase-producing A. baumannii. Only one strain was resistant to imipenem but susceptible to meropenem. CIM was negative but QXA-23 was positive for this strain. The sensitivity and the specificity of CIM was 94.2% and 98.1% respectively in detecting carbapenemase-producing A. baumannii. Conclusions The results of CIM were consistent with the results obtained by PCR to detect the encoding gene of OXA- 23. CIM is inexpensive, easier to operate and interpret than PCR method. CIM is applicable to detect OXA-23 type carbapenemase rapidly in A. baumannii. Key words: Acinetobacter baumannii; carbapenem inactivation method; OXA-23 type carbapenemase 作者单位 :1. 邢台市第三医院检验科, 河北邢台 ; 2. 河北医科大学第二医院检验科 作者简介 : 牛翠 (1985 ), 女, 硕士研究生, 主管检验师, 主要从事细菌学专业 通信作者 : 时东彦, shidongyan73@126.com 鲍曼不动杆菌因其导致医院感染和在重症患者间的传播越来越被关注 [1] 在过去 10 年, 对碳青霉烯类药物耐药的鲍曼不动杆菌的比例越来越高, 成为治疗该菌感染的严重挑战 [2] 鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因是产碳青霉烯酶, 其次为膜孔蛋白的缺失或下降导致膜

57 53 通透性的减低, 青霉素结合蛋白的改变等 [3] 因此快速检测鲍曼不动杆菌是否含有碳青霉烯酶可以为临床及时治疗提供有效的依据 1 材料与方法 1.1 材料 菌株来源选择河北医科大学第二医院 2015 年 5-6 月和邢台市第三医院 2014 年 1 月 年 6 月从临床标本分离鲍曼不动杆菌菌株 121 株, 剔除同一患者同一部位分离菌, 全部菌株均采用 VITEK 2-Compact 全自动细菌鉴定药敏仪进行验证 菌株采用无菌纸片 -20 保存 选取肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705 碳青霉烯酶阳性对照质控菌株, 肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1706 碳青霉烯酶阴性对照质控菌株, 药敏质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 仪器与试剂 VITEK 2 全自动细菌鉴定仪 ( 法国生物梅里埃公司产品 ); 血琼脂平皿 ( 郑州安图生物工程股份有限公司 ); 美罗培南 10 μg 药敏片 ( 康泰生物制品有限公司提供 );Muller- Hinton 药敏培养平皿 ( 广州市迪景微生物科技有限公司 );GeneAmpPCRsystem 2400 热循环仪 ( 美国 Applied Biosystems Inc.);DNA Marker DL2000( 大连 TaKaRa 公司 ); 琼脂糖 ( 美国 Hydra Gene 公司 );Goldviw( 北京赛百盛生物技术公司 ) 1.2 方法 菌株鉴定和药敏试验经 VITEK 2-Compact 全自动细菌鉴定仪进行鉴定和药敏试验, 按照 2015 年的美国临床和实验室标准化协会 (CLSI) 的标准来判定鲍曼不动杆菌的耐药情况 菌株复苏从 -20 保存的菌株库找到相应菌株, 确认无误后, 用 LB 液体培养液进行振荡复苏, 然后接种到血琼脂培养基上进行培养 PCR 扩增 DNA 模板的制备 : 采用煮沸法, 挑取在血培养上孵育 18~24 h 的数个菌落加入到有灭菌蒸馏水 150 μl 的 EP 管中, 煮沸 10 min 后立即冷却于 4, r/min 离心 5 min, 取上清液作为 PCR 模板 OXA-23-F 5'GATCGGATTGGAG AACCAGA OXA-23-R 5'ATTTCTGACCGCATTT CCAT 目的片段 501 bp PCR 反应条件为预变性 95 2 min, 循环参数 : 变性 s, 退火 s, 延伸 72 1 min, 共循环 30 次, 延伸 min 取 6 μl PCR 产物用含 Goldview 染料 的 1.5 % 琼脂糖凝胶上电泳 然后在紫外成像仪上成像并记录结果 碳青霉烯酶失活法 (carbapenem inactivation method,cim) [4] 经 LB 培养基复苏过的鲍曼不动杆菌在血培养基上经过 35 过夜培养后, 用 10 μl 接种环挑取满环加入到 400 μl 高压灭菌的蒸馏水中 振荡混匀后, 加入 10 μg 美罗培南药敏片 35 温育 4 h 后, 在 MH 药敏平皿上均匀涂布 0.5 麦氏浊度的大肠埃希菌 ATCC 25922, 放置 10 min 后, 将温育好的美罗培南药敏片取出, 贴壁挤去多余的液体, 贴到 MH 平皿上 35 温育过夜观察结果 如果药敏片周围无抑菌环, 则为阳性 ( 产碳青霉烯酶 ), 如果药敏片周围形成抑菌环, 则为阴性 ( 不产碳青霉烯酶 ) 2 结果 2.1 细菌耐药情况 121 株鲍曼不动杆菌中 68 株对亚胺培南和美罗培南均耐药,52 株对亚胺培南和美罗培南均敏感 仅 1 株对亚胺培南耐药 对美罗培南敏感 2.2 PCR 检测基因结果 121 株鲍曼不动杆菌中 PCR 检测 OXA-23 基因阳性 69 株,IMP NDM VIM KPC 基因检测均阴性 2.3 耐药表型与 OXA-23 的关系 121 株鲍曼不动杆菌中,68 株对亚胺培南和美罗培南均耐药, 其中 65 株菌 PCR 显示携带 OXA-23 基因 ;52 株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感, 其中 3 株菌携带 OXA-23 基因 ; 1 株对亚胺培南耐药 对美罗培南敏感,OXA-23 为阳性 见表 1 表 1 OXA-23 的结果和耐药性分析 Table 1 Resistant pattern and corresponding result of OXA-23 gene detection Number of strains Imipenem MIC /(mg/l) Meropenem CIM OXA CIM,carbapenem inactivation method.

58 CIM 检测结果与耐药表型分析 68 株亚胺培南和美罗培南耐药鲍曼不动杆菌中,66 株菌 CIM 试验呈阳性 52 株亚胺培南和美罗培南敏感的菌株中,CIM 全部呈阴性 1 株亚胺培南耐药但美罗培南敏感菌株,CIM 试验呈阴性 见表 CIM 和 OXA-23 的结果比对以 OXA-23 为标准,CIM 阳性检测能力为 65/69, 阳性预测值为 94.2 %, 阴性检测能力为 51/52, 阴性预测值为 98.1 % 3 讨论由鲍曼不动杆菌导致的医疗相关感染 (HAI), 经常发生在病情非常严重的患者, 鲍曼不动杆菌所致 HAI 可以将患者病死率从 4 % 增加到 40 % [5], 特别是幸存的鲍曼不动杆菌获得了对多种药物耐药的能力 在我国台湾, 耐药率从 2003 年的 14 % 上升到了 2008 年的 46 % [6] 中国细菌耐药监测网 (CHINET) 报道 2014 年不动杆菌属 ( 鲍曼不动杆菌占 93.0 %) 对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为 62.4 % 和 66.7 % [7], 在我省据河北省细菌耐药监测网 2013 年数据统计表明耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为 70.9 % 和 78.2 % [8] 高耐药率的鲍曼不动杆菌已经蔓延全球, 特别是亚太地区和拉丁美洲, 治疗由鲍曼不动杆菌引起感染的抗菌药物选择越来越困难 碳青霉烯类抗生素, 经常被最后用来治疗多重耐药的革兰阴性杆菌, 然而, 随着过度使用碳青霉烯类抗生素, 细菌对这类药物产生耐药, 主要耐药机制是膜孔蛋白的缺失或下降导致膜通透性的降低 ; 青霉素结合蛋白的改变 ; 产碳青霉烯酶 尤以后者为主要的耐药机制 [3] 由染色体介导低水平表达的 OXA-51 是其固有耐药基因, 一般不会导致对碳青霉烯类抗生素耐药, 但是如果在 OXA-51 基因上游插入 ISAbal 或者是 ISAba9 序列, 会出现过度表达, 从而对碳青霉稀类药物耐药 [9] 在获得的碳青霉烯酶中,OXA 群基因在全球最为普遍, 在鲍曼不动杆菌中, 有 5 大群 OXA 类碳青霉烯酶, 包括 OXA 和 -235 群 这些基因本身对碳青霉烯类耐药影响比较小, 但是当 IS Abal. IS Aba2. IS Aba3. IS A18 等在这些 ( 除 bla OXA24 ) 基因的上游时使这些酶的表达量增加, 导致对碳青霉烯类耐药 其中 OXA-23 群是鲍曼 不动杆菌最为普遍的耐药基因 [10] 本研究中, 有 68 株对亚胺培南和美罗培南均耐药, 其中 65 株 OXA-23 基因阳性, 说明我们 2 所医院的鲍曼不动杆菌的主要碳青霉烯酶的基因型为 OXA-23 PCR 是碳青霉烯酶基因检测的 金标准, 可以精确鉴定碳青霉烯酶的种类 目前直接进行碳青霉烯酶基因检测的技术有普通 PCR 实时荧光定量 PCR 多重 PCR 环介导等温扩增(LAMP) 基因芯片等 PCR 缺点是成本较高, 需要高的专业技能, 只能检测已经确定的基因 CIM 试验是 由 van der Zwaluw 等 [4] 首先使用的一种新型的碳青 霉烯酶表型检测方法 可以用来检测肠杆菌科细菌 不发酵糖革兰阴性杆菌 ( 铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌 ) 是否产碳青霉烯酶 其原理是美罗培南由于碳青霉烯酶的水解作用而灭活, 从而无法抑制大肠埃希菌 ATCC 的生长 该方法成本低, 实用性强, 操作简单, 不需要专业的设备和技能, 而且不受细菌培养时间 药敏片孵育时间 药敏片生产厂商以及细菌是否产黏液的影响, 结果易于解释 但是结果中抑菌环直径的大小是否与结果有关, 有待探讨 Tijet 等 [11] 应用此技术检测后发现抑菌环直径 20 mm 和 6 mm, 对结果解释无影响 本研究抑菌环直径大小在 24~14 mm, 尽管本研究未发现有不一致的结果, 但是抑菌环直径仍然是一个需要探讨的问题 本研究中, 共检测 121 株鲍曼不动杆菌, 其中有 68 株对亚胺培南和美罗培南均耐药,65 株 CIM 和 OXA-23 均为阳性 ;2 株 CIM 和 OXA-23 均为阴性, 有可能是由于其他耐药机制如产 AmpC 酶或者超广谱 β 内酰胺酶 (ESBL) 外膜通透性下降等原因造成的 ;1 株 CIM 阳性,OXA-23 阴性, 尽管本研究同时检测了 IMP NDM VIM KPC 基因, 但是未见阳性, 推测有可能是产其他类的碳青霉烯酶 有 52 株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感, 其中 49 株 CIM 和 OXA-23 为阴性 1 株鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药 对美罗培南敏感,CIM 阴性,OXA-23 阳性 ;3 株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南均敏感,CIM 阴性, OXA-23 阳性, 考虑到有可能是 CIM 试验使用的菌的浓度或者药敏纸片的选择问题, 重复试验后 CIM 仍然是阴性, 加大菌液的浓度, 把美罗培南纸片更换为亚胺培南纸片后试验结果仍然是阴性, 考虑可能是由于 OXA-23 酶活性比较弱 本研究结果表明 CIM 的灵敏度和特异度分别

59 55 达到了 94.2 % 和 98.1 %, 从方法评价应该是非常 好的方法 本方法比 PCR 方法操作简单 消耗低 干扰因素少 结果易于解释等优点可以作为普通 实验室筛查鲍曼不动杆菌是否产碳青霉烯酶的表 型方法 在抗感染形势日趋严重的今天, 快速而 有效地诊断能够为临床及时应用及调整抗生素提 供快速有效的依据 参考文献 [1] MUNOZ-PRICE LS,WEINSTEIN RA. Acinetobacter infection[j]. N Engl J Med,2008,358(12): [2] MCCONNELL MJ,ACTIS L,PACHON J. Acinetobacter [3] [4] [5] baumannii:human infection,factors contributing to pathogenesi and animal models [J]. FEMS Microbiol Rev,2013,37(2): RUMBO C,GATO E,LOPEZ M,et al. Contribution of efflux pumps,porins,and β-lactamases to multidrug resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[j]. Antimicrob Agents Chemother,2013,57(11): VAN DER ZWALUW K,DE HAAN A,PLUISTER GN,et al. The carbapenem inactivation method (CIM),a simple and low-cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in gram-negative rods[j]. PLoS One, 2015,10(3):e LEMOS EV,DE LA HOZ RESTREPO F,ALVIS N,et al. Acinetobacter baumannii-related mortality in intensive care units [6] [7] [8] [9] [10] [11] in Colombia[J]. Rev Panam Salud Publica,2011,30(4): SU CH,WANG JT,HSIUNG CA,et al. Increase of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infection in acute care hospitals in Taiwan :association with hospital antimicrobial usage[j]. PLoS ONE,2012,7(5):e 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等 年 CHINET 中国细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,2015,15(5): 时东彦, 赵建宏, 李志荣, 等 年河北省细菌耐药监测网三级甲等医院细菌耐药性监测 [J]. 临床荟萃,2015,30(9): FIGUEIREDO S,POIREL L,PAPA A,et al. Overexpression of the naturally occurring blaoxa-51 gene in Acinetobacter baumannii mediated by novel insertion sequence ISAba9[J]. Antimicrob Agents Chemother,2009,53(9): HAULAGAIN BP,JANG SJ,AHN GY,et a1.molecular epidemiology of an outbreak of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii carrying the ISAbal-bla(OXA-51-like)genes in a Korean hospital[j].jpn J Infect Dis,2012,65(2): TIJET N,PATEL SN,MELANO RG. Detection of carbapenemase activity in Enterobacteriaceae :comparison of the carbapenem inactivation method versus the Carba NP test[j]. J Antimicrob Chemother,2015,70(10): 收稿日期 : 修回日期 : 信息交流 哥伦比亚寨卡病毒感染者可能高达 70 万 Zika virus may infect up to people in Colombia: government 2016 年 1 月 20 日哥伦比亚卫生部长发布公告 : 由蚊虫携带并广泛传播的寨卡病毒, 在哥伦比亚已有 例感染者, 预计可能增加到 例 根据泛美卫生组织的监测资料, 哥伦比亚的寨卡病毒感染率仅次于巴西 与去年基孔肯雅病的暴发流行类似, 最终感染人数可能在 ~ 例 孕妇感染寨卡病毒可引起新生儿小头畸形, 但目前哥伦比亚已确诊的 560 位孕妇患者中, 暂未有分娩出小头畸形新生儿的报道 编辑评论 : 感染寨卡病毒孕妇分娩的新生儿 未发现有小头畸形很不寻常, 在巴西感染寨卡病 毒的孕妇分娩出小头畸形新生儿的发生率尚不清 楚, 但在哥伦比亚 560 例感染寨卡病毒孕妇的新 生儿中未发现新生儿小头畸形的情况难以解释 News. Zika virus may infect up to people in Colombia:government. Clin Infect Dis, 2016:62(15 April). 丁百兴摘译王明贵审校 收稿日期 :

60 56 论著 碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌中 bla NDM 基因型检测及流行病学分析 王峰 1, 孙景勇 2, 张芳芳 2, 袁轶群 1 摘要 : 目的检测上海交通大学附属瑞金医院临床分离碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌产 NDM 型碳青霉烯酶的情况, 研究其流行病学特征 方法收集该医院 2013 年 11 月 年 1 月临床分离的 18 株对亚胺培南或美罗培南药敏纸片抑菌圈直径 19 mm 的大肠埃希菌 采用聚合酶链反应 (PCR) 检测 bla NDM 型碳青霉烯酶基因并对阳性产物进行测序以确定基因型别 ; 通过质粒转移接合试验了解耐药基因是否可以通过质粒进行水平传播 ; 应用多位点序列分型 (MLST) 和脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 对产 NDM 酶的大肠埃希菌进行同源性分析 结果 18 株耐碳青霉烯类大肠埃希菌中 6 株扩增到 bla NDM 基因, 其中 4 株为 bla NDM-1,2 株为 bla NDM-5 6 株产 NDM 酶的大肠埃希菌中 3 株成功进行转移接合试验,MLST 发现 6 株产酶菌株共分为 5 个 ST 型 (ST5018,ST354,ST405,ST2967,ST156), 与 PFGE 结果中 5 种不同的 DNA 谱型 (A~E) 相对应, 其中 2 株菌株同为 ST5018 型且为 PFGE-DNA 谱型中 A 型的不同亚型 (A1,A2) 结论本研究检出产 NDM 酶碳青霉烯类耐药大肠埃希菌 bla NDM 阳性病例多为散发, 但由质粒介导的水平传播在 bla NDM 的播散中可能起重要作用 上海地区首次检出 NDM-5 型碳青霉烯酶, 应引起重视 关键词 : NDM 型碳青霉烯酶 ; 大肠埃希菌 ; 转移接合实验 ; 多位点序列分型 ; 脉冲场凝胶电泳中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : ( 2017 ) DOI: /j Detection and epidemiology of NDM-type carbapenemase in Esherichia coli WANG Feng, SUN Jingyong, ZHANG Fangfang, YUAN Yiqun. (Department of Laboratory Medicine, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai , China) Abstract: Objecive To investigate the prevalence of NDM-type carbapenemases in the carbapenem-resistant Escherichia coli strains collected from Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. The epidemiological characteristics of NDM-type carbapenemase-producing isolates were analyzed. Methods Eighteen strains were collected from November 2013 to January 2015 in the clinical microbiology laboratory of Ruijin Hospital. All of them were resistant to imipenem or meropenem (inhibition zone diameter 19 mm). The bla NDM gene was detected by PCR. The amplified products were subjected to sequencing analysis. Conjugation experiment was carried out to verify the transferability of plasmids. Multilocus sequence typing (MLST) and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) were performed to analyze the molecular epidemiology. Results The bla NDM gene was identified in 6 strains, 4 of which had bla NDM-1 -type and 2 had bla NDM-5 -type carbapenemase gene. Three strains were positive in the conjugation experiment. MLST analysis showed that 6 NDM carbapenemase-producing isolates belonged to five sequence types, corresponding to five PFGE-DNA patterns (A-E). Two of these isolates shared the identical sequence type (ST5018) and nearly the same PFGE-DNA patterns (A1, A2). Conclusions NDM-type carbapenemase-producing E. coli is identified in this study. Most bla NDM -positive cases were sporadic. Plasmid might play an 作者单位 : 1. 复旦大学附属金山医院检验科细菌组, 上海 ; 2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院 作者简介 : 王峰 (1970 ), 男, 大专, 主管技师, 主要从事临床细菌鉴定及耐药性研究 通信作者 : 袁轶群, @189.cn important role in the spread of bla NDM in E. coli. The bla NDM-5 type carbapenemase gene was first identified in Shanghai, to which more attention should be paid. Key words: NDM-type carbapenemase; Escherichia coli; conjugation experiment; multilocus sequence typing; pulsed field gel electrophoresis

61 57 大肠埃希菌是人体正常定植菌, 也是常见的 条件致病菌之一, 可引起呼吸道 尿路感染及血 流感染等, 在医院和社区获得性感染中均占有重 要地位 近年来随着碳青霉烯类抗生素的广泛使 用, 对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌 (CRE) 不断出现 [1] 2007 年,CHINET 监测显示大肠埃希 菌对亚胺培南和美罗培南 2 种碳青霉烯类抗生素 的耐药率分别为 0 和 0.1 % [1],2014 年则分别达到 了 0.9 % 和 1.0 % [2] 产碳青霉烯酶是 CRE 耐药的主要机制之一 NDM-1 作为一种常见的碳青霉烯酶除了对氨曲南 无作用外, 几乎能够抑制所有 β 内酰胺类抗生素 的活性, 使临床治疗面临窘境 针对产 NDM 酶的 菌株进行研究, 对控制耐药基因在人群中的播散 意义重大 为此, 我们收集了上海交通大学医学 院附属瑞金医院临床分离 18 株对碳青霉烯类耐药 的大肠埃希菌, 对这些细菌所携带的耐药基因类 型及其可能的传播途径进行分析研究, 为临床采 取合理的防控措施提供参考 1 材料与方法 1.1 材料 菌株来源收集我院 2013 年 11 月 年 1 月临床分离到对亚胺培南或美罗培南耐药 ( 抑 菌圈 19 mm) 的大肠埃希菌, 剔除同一患者的重复分离标本后共计 18 株 仪器与试剂 E 试验药敏试验条购自法国 Biomerieux 公司,PCR 仪 (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad 公司 ), 脉冲场凝胶电泳仪 (CHEF-DR Ⅲ, Bio-Rad 公司 ), 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 1.2 方法 药敏试验采用 E 试验法测定待检菌株对各种抗生素的敏感性, 操作步骤见产品说明书, 药敏判断按 CLSI 2015 年推荐标准 耐药基因检测和序列分析采用 PCR 方法扩增耐药基因 bla NDM-1, 煮沸法提取细菌 DNA 模板, 所用引物见表 1 [3] 反应条件为 :94 变性 10 min ;94 30 s,58 40 s,72 50 s, 共 36 个循环 ; 最后,72 延伸 5 min PCR 扩增阳性产物送生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序, 测序结果经 BLAST(http ://blast.ncbi.nlm. nih.gov/blast.cgi) 确定耐药基因分型 转移接合试验携带 bla NDM 基因的菌株为供体菌, 耐叠氮钠的大肠埃希菌 J53 为受体菌 分别挑取单个菌落配制成 0.5 麦氏浊度的生理盐水菌悬液, 各吸取 500 μl 加入 4 ml 的 MH 肉汤培养基中混匀, 静止孵育 16~18 h 后取 0.2 ml 表 1 检测 bla NDM 基因及多位点序列分型所用到的 PCR 引物 Table 1 Primers used for screening of bla NDM and multilocus sequence typing Primer Sequence, 5 3 Product size /bp Annealing temperature / NDM-F GGTTTGGCGATCTGGTTTTC NDM-R CGGAATGGCTCATCACGATC adk-f ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG adk-r CCGTCAACTTTCGCGTATTT fumc-f TCACAGGTCGCCAGCGCTTC fumc-r GTACGCAGCGAAAAAGATTC gyrb-f TCGGCGACACGGATGACGGC gyrb-r ATCAGGCCTTCACGCGCATC icd-f ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA icd-r GGACGCAGCAGGATCTGTT mdh-f AGCGCGTTCTGTTCAAATGC mdh-r CAGGTTCAGAACTCTCTCTGT pura-f CGCGCTGATGAAAGAGATGA pura-r CATACGGTAAGCCACGCAGA reca-f ACCTTTGTAGCTGTACCACG reca-r AGCGTGAAGGTAAAACCTGTG

62 58 混合菌液涂布于含美罗培南 (0.5 mg/l) 和叠氮钠 (125 mg/l) 的麦康凯平皿上, 温箱孵育 16~18 h, 挑取在筛选平皿上生长的疑为转移接合子的菌落转种至血平皿, 后续进行菌种鉴定 药敏试验 PCR 法检测耐药基因及对扩增产物进行测序以确定为转移接合子 多位点序列分型 (MLST) 采用 PCR 法对大肠埃希菌的 7 个管家基因 (adk,fumc,gyrb, icd,mdh,pura,and reca) 进行扩增并测序, 所用引物见表 1, 实验方法参见 MLST 网站 http :// mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/ecoli 测序结果在该网站比对, 得出菌株的序列分型 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 对所有产 NDM 酶的大肠埃希菌 (6 株 ) 进行 PFGE 分析 将包埋有细菌的胶块经裂解 用限制性内切酶 XbaI 处理, 然后按照 14 最小分子量 30 kb 最大分子量 600 kb 6 V/cm 120 线性变化 2.16~54.17 s 的条件在 PFGE 仪上电泳 18 h 以沙门菌 H9812 作 为分子量标准 PFGE 结果按 Tenover 标准判读 2 结果 [4] 2.1 碳青霉烯酶基因检测 科室分布及药敏结果 18 株碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌中有 6 株扩增得到 bla NDM 基因, 阳性率 31.6 %(6/18) 经测序确认, 其中 4 株为 NDM-1 型,2 株为 NDM-5 型 6 株产 NDM 型碳青霉烯酶的大肠埃希菌分别分离自急诊 ICU( 标本号 1265 和 1216) 创伤外科 (2031) 外科 ICU(3016) 移植病房 (B280) 及某地段医院 (B792) 标本来源及药敏结果见表 2 表 2 6 株产 NDM 酶大肠埃希菌的多位点序列分型及药敏试验结果 Table 2 Multilocus sequence typing and antimicrobial susceptibility of 6 bla NDM -carrying E. coli isolates Isolate Carbapenemase Sample type Sequence type MIC /(mg/l) ATM AMK CIP CAZ CRO MEM IMP PTC 2031 NDM-5 Drainage ST >32 >256 >256 >32 >32 >256 Tc-2031 NDM >256 >256 >32 >32 > NDM-1 Sputum ST405 >256 >256 >32 >256 >256 >32 >32 >256 Tc-3016 NDM > >256 > >256 B792 NDM-1 Urine ST5018 >256 >256 >32 >256 >256 >32 >32 >256 Tc-B792 NDM >256 > >32 > NDM-1 Stool ST >256 > > NDM-5 Stool ST156 >256 3 >32 >256 >256 >32 >32 >256 B280 NDM-1 Urine ST5018 >256 4 >32 >256 >256 >32 >32 >256 ATM,Aztreonam ;AMK amikacin ;CIP,ciprofloxacin ;CAZ,ceftazidime ;CRO,ceftriaxone ;MEM,meropenem ;IPM,imipenem ;PTC, piperacillin-tazobactam. Tc,transconjugant strain. 2.2 接合试验结果 6 株产 NDM 型碳青霉烯酶大肠埃希菌中 3 株接合成功 经验证, 转移接合子均为大肠埃希菌, 对碳青霉烯类耐药, 而对环丙沙星保持敏感 ( 供体菌耐药 ) 经 PCR 扩增及产物测序, 证实含有与供体菌相同的碳青霉烯酶基因 2.3 MLST 试验结果根据 MLST 发现 6 株产 NDM 酶大肠埃希菌共分为 5 个 ST 型 ( 表 2), 分别为 ST354 ST405 ST5018 ST2967 和 ST156 其中, 菌株 B792 和 B280 同属 ST5018 型 2.4 PFGE 结果根据 Tenover 标准 [4], 对 6 株产 NDM 酶大肠埃希菌的 PFGE 结果进行比对后, 将其分为 5 型 (A~E), 见图 1 其中 B792 和 B280 分属为同一谱型的不同亚型 (A1,A2) 另外 4 株条带差异较大, 分为 B~E 型 3 讨论产生碳青霉烯酶是 CRE 耐药的重要机制之一 [3] NDM 属于 B 类碳青霉烯酶, 其活性受 EDTA 抑制但不被克拉维酸抑制, 常见的酶有

63 59 有效的防控措施 避免耐药基因在临床菌株中的 快速播散 MLST 的结果表明 6 株大肠埃希菌分属于 5 种不同的 ST 分型 与之相对应 PFGE 的结果同 样呈现出 5 种不同的谱型 A E 携带 blandm-1 基因的样本 B792 和 B280 虽分离自不同科室 但 同属于 ST5018 型且为同一谱型的不同亚型 A1 A2 提示存在 ST5018 型克隆株流行传播的可能 其余菌株同源性差异较大 应为散发病例 本研 究首次在上海地区检出 2 株产 NDM-5 的大肠埃希 菌 虽未发现流行病学上的联系 但鉴于 NDM-5 可导致细菌对碳青霉烯类和广谱 β 内酰胺类抗生 素的高水平耐药 有关部门应引起足够的重视 做好监控和预防工作 图 1 6 株产 NDM 酶大肠埃希菌的脉冲场凝胶电泳分析 Figure 1 PFGE patterns of 6 blandm-positive E. coli strains 综上所述 产 NDM 型碳青霉烯酶的大肠埃希 菌在上海瑞金医院出现 并易于通过质粒转接接 合在细菌间水平传播 多数病例属于散发但是主 IMP VIM 和 NDM 此类酶水解除氨曲南外的所 有 β 内酰胺类抗生素 2009 年 Yong 等 [5] 从 1 例 要来自危重病科室 加强相应的院感控制工作十 曾在印度有过住院史的患者尿液标本中首次分离 应引起有关部门的重视 到了 1 株产 NDM-1 酶的肺炎克雷伯菌 随后 此 酶在印度 澳大利亚 英国 美国 比利时 中国 台湾和大陆地区也陆续出现报道 [6] 携带 blandm-1 分必要 上海地区首次检出 NDM-5 型碳青霉烯酶 参考文献 [1] 基因的菌株往往同时携带有编码其他 β 内酰胺酶 介导氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物耐药的相 关的酶基因 [7] 导致只有极少数抗生素 如多黏 菌素 替加环素和磷霉素等对此类细菌体外敏感 [2] 只有 2 个氨基酸的差别 Val88Leu Met154Leu [8] Dis [4] by pulsed-field gel electrophoresis criteria for bacterial strain typing [J]. J Clin Microbiol [5] Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene bla unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 了转移接合试验 表明耐药基因易于通过质粒介 14 from India[J]. Antimicrob Agents Chemother [6] 功进行了转移接合试验 Belgium[J]. Antimicrob Agents Chemother [7] 提示产 NDM-1 大肠埃 质粒在不同细菌间的水平传播有关 应采取及时 PATEL G BONOMO RA. "Stormy waters ahead" global emergence of carbapenemases[j]. Front Microbiol [11] 希菌在瑞金医院的检出可能与携带有耐药基因的 BOGAERTS P BOUCHAHROUF W DE CASTRO RR et al. Emergence of NDM-1-producing Enterobacteriaceae in 的 CRE 菌株共 114 株 其中大肠埃希菌 20 株 共有 4 株样本扩增出 blandm-1 基因 值得注意的是 这 4 株产 NDM-1 的细菌均非大肠埃希菌 但都成 YONG D TOLEMAN MA GISKE CG et al. NDM-1 and a novel erythromycin esterase gene carried on a 产 NDM-1 2 株产 NDM-5 共有 3 株菌成功进行 显示 上海瑞金医院自 2011 年 5 月 2013 年 6 月 T E N O V E R F C A R B E I T R D G O E R I N G RV e t a l. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced 本研究分离到的 6 株产 NDM 酶的菌株中 4 株 导的水平传播在不同细菌间扩散 在之前的研究 NORDMANN P NAAS T POIREL L. Global spread of Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. Emerg Infect 目前有关 NDM-5 的报道还不多见 但是已有的报 道显示较之 NDM-1 NDM-5 对碳青霉烯类和广 谱 β 内酰胺类抗生素具有更高的耐药水平 [9-10] 胡付品 朱德妹 汪复 等 年 CHINET 中国细菌耐药 性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志 [3] 该类病原菌也因此被称为 超级细菌 NDM-5 是 NDM 型碳青霉烯酶的另一种亚型 与 NDM-1 卓超 苏丹虹 朱德妹 等 年 CHINET 大肠埃希菌和 克雷伯菌属耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志 [8] HORNSEY M PHEE L WAREHAM DW. A novel variant