(DB 31/ ) 火锅底料中罂粟碱类物质的残留量测 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :CU1005 事件背景 2016 年 1 月晚, 据新华网报道, 近期国家食品药品监督管理总局在组织开展打击食品 违法添加执法行动中, 发现 35 家餐饮服务单位经营的食品中含有罂粟碱 吗

Transcription

1 目录 (DB 31/ ) 火锅底料中罂粟碱类物质的残留量测... 2 奶粉中香兰素的测定... 7 不同基质中 16 种邻苯二甲酸酯类检测系统解决方案 植物油中 16 种邻苯二甲酸酯类化合物的测定 (SPE-GC/MS 法 )* 白酒中 16 种邻苯二甲酸酯类物质检测整体解决方案 (GC/MS 法 HPLC 法 )* 婴幼儿奶粉中双氰胺的检测 HPLC-UV 法和 LC-MS/MS 法 鸡蛋中三聚氰胺的检测 (HPLC 法 ) 食品中苏丹红染料的检测 (HPLC 法 ) 升级版方法 食品中甲醛的测定 HPLC 法 食品中苏丹红染料的检测 Cleanert Sudan 专用柱, 升级方法 花生油中 16 种邻苯二甲酸酯的分析方法 辣椒油中罗丹明 B 的分析方法 鸭血中苏丹红的分析方法 婴幼儿奶粉中双氰胺的分析方法 乳制品中 L- 羟脯氨酸的测定方法学验证 2,4- 二硝基氟苯法 辣椒油中罗丹明 B 的检测方法高效液相色谱法 (GB/T ) 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法... 86

2 (DB 31/ ) 火锅底料中罂粟碱类物质的残留量测 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :CU1005 事件背景 2016 年 1 月晚, 据新华网报道, 近期国家食品药品监督管理总局在组织开展打击食品 违法添加执法行动中, 发现 35 家餐饮服务单位经营的食品中含有罂粟碱 吗啡 可待因 那可丁 蒂巴因等罂粟壳成分, 存在涉嫌违法添加行为 罂粟壳俗称大烟, 罂粟科植物罂粟的干燥果壳, 含有吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因等 20 多种活性生物碱 这些生物碱具有一定的药用价值, 但其副作用亦不可低估 罂粟壳的生物碱能使人体产生快感, 处于一种特殊的愉悦状态, 并逐渐产生依赖性进而成瘾 不法分子正是利用这一点招揽回头客, 在食品中非法掺入罂粟壳或其粉碎物 浸提物, 诱发 食客上瘾, 具有潜在的吸食毒品的倾向, 社会危害很大 博纳艾杰尔早在 2014 年已经将成熟的 食品中罂粟壳生物碱成分残留量的测定 (LC- MS/MS 法 ) 方法编纂入 食品安全解决方案, 以供探讨 考虑到食品中香料成分的多样性, 而且这些香料也有可能给罂粟壳残留成分的检测带来干扰 文中采用 QuChERS-HPLC 法建 立一种快速 灵敏 特异的检测方法定量测定罂粟壳的生物碱成分 1. 样品提取 称取 2 g 试样 ( 精确至 0.01 g) 于 50 ml 聚四氟乙烯具塞离心管中, 加入 5 ml 水, 混匀, 加入 15 ml 乙腈提取, 再加入 MS-MG5052 提取管中提取, 振荡 1 min 后放入离心机中, 离 心 1 min(5000 r/min), 取出后待净化 2. 净化 2.1 乙二胺 -N- 丙基硅烷 (PSA) 净化法 用 1 ml 微量移液器将上述的上清液 1 ml 移入 MS-PA0252 净化管中, 涡旋混合器涡旋 1min, 以 5000 r/min 离心 1 min, 移取上清液于进样小瓶中 2.2 C18 小柱净化法 吸取上述的上清液通过 C18 小柱, 收集适量洗脱液至进样器小瓶中 在实际操作时, 根 据样品中色素的含量选择不同的净化方式, 每一净化方法对应各自的基质空白和加样样品 3. 检测条件 3.1 液相色谱条件 色谱柱 :Venusil HILIC 色谱柱 2.1 mm 100 mm,3 µm 流动相 : A:0.1% 甲酸乙腈 ; B:100 mmol/l 甲酸铵水溶液 - 乙腈 ( 体积比为 1:1, 以甲酸调节 ph 为 3.0) 流动相按表 1 进行梯度洗脱 ; 流速 :0.3 ml/min; 进样体积 :1 μl

3 表 1 流动相的梯度洗脱程序 (%) 时间 (min) 流动相 A 流动相 B 0.00~ ~ ~ 质谱条件 经过对毛细管出口去簇电压 (DP) 碰撞池能量 (CE) 等质谱参数的优化, 最终确定吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因质谱条件, 见表 2 表 2 吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因检测的质谱参数 定量离子 定性离子 生物碱 去簇电 压 (V) 母离子相对 分子质量 相对分子 质量 碰撞能 量 (V) 相对分 子质量 碰撞能 量 (V) 那可丁 罂粟碱 蒂巴因 可待因 吗啡 结果 : 图 1 从上至下分别为 : 重庆鸡公褒酱样品中吗啡 罂粟碱 蒂巴因 可待因 那可丁的 LC-MS-MS-MRM 色谱图

4 4.1 线性范围 回归方程和检出限 表 3 5 种罂粟壳生物碱成分 LC-MS/MS 法的线性范围 回归方程和检出限 生物碱 线性范围 (ng/ml) 回归方程 相关系数 检出限 (ng/ml) 吗啡 1~20 y= x 磷酸可待因 1~20 y= x

5 盐酸罂粟碱 1~20 y= x 那可丁 1~20 y= x 蒂巴因 1~20 y= x 由表 3 可见, 在 1~20 ng/ml 范围内, 吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因在线性关系良好,r>0.999, 检出限分别为 1.3 ng/ml 1.3 ng/ml 0.7 ng/ml 0.7 ng/ml 1.3 ng/ml 4.2 加标回收试验向沙茶酱 ( 未检出吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因 ) 中分别加入低 (20 μg/kg) 中 (50 μg/kg) 高(100 μg/kg) 水平的吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因标准品进行加标回收试验, 结果见表 4 表 4 火锅食品中的罂粟壳生物碱成分残留 LC-MS/MS 法的加标回收试验 (n=6) 低水平加中水平加高水平加标 生物碱 平均回收 率 (%) RSD(%) 平均回收率 (%) RSD(%) 平均回收 率 (%) RSD(%) 吗啡 可待因 罂粟碱 那可丁 蒂巴因 表 4 可见, 该方法的平均回收率为 73.1%~95.7%,RSD 为 0.5%~2.3% 5. 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST10130* 吗啡 Morphine ST10087 可待因 Codeine ST10304* 罂粟碱 papaverine ST10431 那可丁 Narcotine ST40061 蒂巴因 Thebaine

6 6. 订货信息 订货号 产品名称 规格包装 MS-MG5052 样品提取管 (50mL) 50 支 /pk MS-PA0252 样品净化管 (2mL) 50 支 /pk VH Venusil HILIC 色谱柱 2.1 mm 100 mm,3 µm AS 针式过滤器 (Nylon) 0.22 μm, 直径 13 mm,200/pk ZSQ-5ML 一次性无针头注射器 5 ml, 100/pk ml 样品瓶 短螺纹透明带书写 mm, 100/pk ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔 垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk AH015-4 乙腈 4 4 L/ 箱

7 奶粉中香兰素的测定 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10021 参考方法 博纳艾杰尔内部方法 香兰素亦称香草素 香草醛等, 学名为 3- 甲氧基 -4- 羟基苯甲醛, 根据欧盟专家委员会 2000 年 2 月 24 日报道, 大剂量可导致头痛, 恶心, 呕吐, 呼吸困难, 甚至损伤肝肾功能 限量标准 中华人民共和国国家标准 食品添加剂使用标准 (GB ) 规定, 较大婴儿和幼 儿配方食品中香兰素最大使用量为 5mg / 100mL, 其中 100 ml 以即食食品计, 生产企业应 按照冲调比例折算成配方食品中的使用量 ; 婴幼儿谷类辅助食品中可以使用香兰素, 最大使 用量为 7 mg / 100g, 其中 100 g 以即食食品计 ; 凡使用范围涵盖 0 至 6 个月婴幼儿配方食品 不得添加任何食用香料 国家标准中只规定了限值, 未有检测方法 本实验使用天津博纳艾 杰尔科技有限公司的 Cleanert PAX 固相萃取小柱和 Venusil XBP C18(L) 液相色谱柱, 建立了一种奶粉中香兰素的检测方法, 经实验验证, 该方法简单 快速 准确度高 实验材料 水 (ph=4.5): 取 100 ml 水, 用乙酸调节 ph 至 4.5; 2% 乙酸铅溶液 : 称取乙酸铅 2 g, 加水稀释并定容至 100 ml; 5% 氨水溶液 : 取氨水溶液 5 ml, 加水稀释并定容至 100 ml; 5% 酸化甲醇 : 取甲酸 5 ml, 加甲醇 95 ml 混匀 ; 香兰素储备液 (1mg / ml): 准确称取香兰素标准 10 mg, 加水稀释并定容至 10 ml; 固相萃取柱 :Cleanert PAX ( 规格为 60mg / 3mL), 使用前分别用 3 ml 甲醇和 3 ml 水活 化 ; 液相色谱柱 :Venusil XBP C18(L)5 μm,150 Å, mm; 针式过滤器 : 亲水型 PTFE (0.45 μm,13 mm) LC-10F 高效液相色谱系统 ; Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪 ; 高速离心机 ( 转子 50 ml 6); 氮吹仪 ; 12 位固相萃取装置 实验步骤 准确称取奶粉试样 1 g( 精确至 0.01 g) 于 50 ml 离心管中, 加入 ph=4.5 的水溶液 5 ml, 混匀超声提取 5 min, 加 2% 乙酸铅溶液 2 ml, 混匀后静置 2 min,8000 r/min 离心 10min;

8 取上清液用 5% 氨水溶液调节 ph 至中性 ; 将上清液全部加样至活化好的 Cleanert PAX 小柱, 然后分别用 3 ml 5% 氨水溶液和 3 ml 甲醇淋洗小柱, 弃去淋洗液 ; 用 3 ml 5% 酸化甲醇洗脱 ( 以上固相萃取操作通过 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪完成 ), 收集洗脱液于 30 下氮气吹干, 用 1mL 流动相重新溶解, 过滤, 待测 色谱条件 色谱柱 :Venusil XBP C18(L),5 μm,150 Å, mm; 流动相 :A (0.02 mol/l 的磷酸二氢钾溶液, 磷酸调节 ph=4.0):b ( 乙腈 ) = 90:10; 流速 :1.0 ml/min; 进样量 :20 μl; 波长 :276 nm; 柱温 :30 实验结果及谱图 量取一定量香兰素标准储备液, 分别用水稀释至 1 μg/ml 5 μg/ml 10 μg/ml 25 μg/ml 和 50 μg/ml, 按照 4 检测条件依次进样, 以浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合标准曲线方程, 结果见表 1; 表 2,3 为回收率结果实验 表 1 香兰素标准曲线和检出限 标准曲线方程相关系数检出限 (S/N>3) Y=86.443X μg/g 表 2. 5 μg/g 添加回收实验结果 回收率 平行 1 平行 2 平行 3 平均回收率 RSD 89.03% 94.30% 90.67% 91.33% 2.70% 表 μg/g 添加回收实验结果 回收率 平行 1 平行 2 平行 3 平均回收率 RSD 85.08% 87.85% 83.59% 85.51% 2.16%

9 图 1 奶粉空白谱图 图 2. 5 μg/g 添加谱图 图 3. 1 μg/g 标准溶液谱图

10 相关标准品 订货号中文名称英文名称 CAS# 1ST3337 香兰素 ( 香草醛 ) Vanillin 订货信息 订货号名称规格 FL-LC010 分析型高效液相色谱仪 10 ml/min, 等度系统, CC-100-T 分析型色谱柱温箱 nm 双波长检测器 SPE-40 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪 4 通道 24 位连续处理 AH230-4 甲醇色谱纯,4 4 L/ 箱 AH015-4 乙腈色谱纯,4 4 L/ 箱 AX0603 Cleanert PAX 固相色谱柱 60 mg / 3 ml,50 支 / 盒 VX L Venusil XBP C18(L) 液相色谱柱 5 μm,150 Å, mm VX L 保护柱芯 mm,4/pk CH-100 保护柱套适用于 mm 的保护柱芯 As 针式过滤器 PTFE( 亲水 ),0.45 μm,13 mm,200/pk LZSQ-2ML 一次性注射器 2 ml 无针头, 两件式,100 支 /pk AM3100 溶剂过滤器 1 L ml 样品瓶短螺纹, 透明, 带书写处,100/pk ml 样品瓶盖预组装 :9 mm 中心孔, 螺纹盖 ; 红色 样品瓶 PTFE 隔垫,100/pk ml 样品瓶盖透明, 螺纹口,100/pk AM 微孔滤膜 (MCM) 预组装 :15 mm 黑色实心盖 ; 红色丁 AM 微孔滤膜 (Nylon) 隔垫,100/pk TGL-10B 离心机 50 mm,0.45 μm,100 片 /pk NV15-G 氮吹仪 50 mm,0.45 μm,100 片 /pk VM12 真空固相萃取缸最大转速 r/min A81213 流速调节阀 15 位 A80100 穿板导流针 12 位 A01003 无油隔膜真空泵 12 个 / 包

11 不同基质中 16 种邻苯二甲酸酯类检测系统解决方案 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :MF10012 一 样品前处理方法 1. 水性样品 ( 水 饮料 果汁等 ) 固相萃取柱 :Cleanert DEHP 玻璃柱,500 mg / 6 ml,(p/n:dehp5006) 1.1 样品处理 此类样品包括瓶装纯净水 矿泉水, 茶 果汁和功能饮料等 ; 液体样品可直接上样 ; 某 些可水溶解的固体样品可以先制成水溶液, 然后全部作为待处理液, 如无脂糖果 1.2 固相萃取法 净化活化 :5 ml 乙酸乙酯 5 ml 甲醇 5 ml 水 上样 :10 ml 水性样品 淋洗 :5 ml 5% 甲醇水, 真空抽干 20 min 洗脱 : 加入 2 ml 甲醇浸泡柱床约 1 min, 再用 10 ml 乙酸乙酯进行洗脱 检测 : 将洗脱液用氮气吹干后, 以 1 ml 甲醇定容, 然后用液相色谱法检测 备注 : 此法多适用于配套液相色谱检测, 当样品中邻苯二甲酸酯类的含量较低时, 需要采用 固相萃取富集才能检测的情况 一般来说, 对于此类样品, 可以采用正己烷液液萃取的办法, 用 GC/MS ( 灵敏度较高 ) 直接检测 注 : 所使用乙酸乙酯必须是农残级 2. 白酒 固相萃取材料 :Cleanert DEHP 玻璃柱,500mg / 6mL (P/N:DEHP5006) 2.1 样品制备 将白酒用去离子水稀释, 使其中的乙醇的含量为 5%, 作为上样液 ; 取 1 ml 甲醇加入 19 ml 去离子水, 混匀, 得到 5% 甲醇 - 水溶液, 作为淋洗液 2.2 净化 用玻璃移液管分别取 5 ml 乙酸乙酯 5 ml 甲醇,5mL 水, 在重力状态下依次过柱 ; 用玻璃移液管取 100 ml 上样液加到小柱上 ; 用玻璃移液管取 5 ml 5% 甲醇 - 水溶液淋洗固 相萃取柱 ; 淋洗结束之后, 开启真空泵抽 20 min, 抽干之后, 加入 2 ml 甲醇浸泡柱床约 1 min; 用 10 ml 乙酸乙酯洗脱固相萃取柱, 收集洗脱液 将洗脱液于 35 氮吹至干, 用 1 ml 甲醇定容, 将溶液转移至样品瓶中, 进行 GC/MS 或 HPLC 检测 注 : 所使用乙酸乙酯必须是农残级 3. 乳品及乳制品饮料等含蛋白基质样品 固相萃取材料 :Cleanert MAS-PAE,40 ml 玻璃散装填料 (P/N:MS-PAE40) 纯牛奶样品 : 样品净化 : 向玻璃离心管中加入 2 ml 样品, 然后加入 4 ml 乙腈 : 甲基叔丁基谜 (9:1,V/V), 将离心管涡旋 2 min, 最后加入 Cleanert MAS-PAE 填料, 再将离心管涡旋振荡 2 min 后,

12 以 7000 rpm/min 的转速离心 5 min, 取上清液, 以邻苯二甲酸酯检测专用针式过滤器过滤后, 待检 酸奶样品 : 样品净化 : 向玻璃离心管中加入 1 ml 酸奶和 1 ml 去离子水, 混匀, 然后加入 4 ml 乙腈 : 甲基叔丁基谜 (9:1,V/V), 将离心管涡旋 2 min, 最后加入 Cleanert MAS-PAE 填料, 再将 离心管涡旋振荡 2 min 后, 以 7000 rpm/min 的转速离心 5 min, 取上清液, 以邻苯二甲酸酯 检测专用针式过滤器过滤后, 待检 4. 低脂固态样品 如奶粉 饼干 果冻 糖果等, 使用固相萃取材料 :Cleanert MAS-PAE,40 ml 玻璃 散装填料 (P/N:MSPAE40) 取 1 g 已制成粉末状的样品,2 ml 水, 加入到 Cleanert MAS- PAE 离心管中, 然后加入 4 ml 乙腈 : 甲基叔丁基谜 (9:1,V/V), 将离心管涡旋 2 min, 最后 加入 Cleanert MASPAE 料, 再将离心管涡旋振荡 2min 后, 以 7000 r/m 的转速离心 5 min, 移取全部上清液至带刻度离心管中, 用乙腈 : 甲基叔丁基谜 (9:1,V/V) 将溶液定容为 5 ml, 以 PAEs 专用过滤头过滤后, 待检测 5. 酱油 固相萃取材料 :Cleanert MAS-PAE-C,40 ml 玻璃散装填料 (P/N:MS-PAE40-C) 样品净化 : 向玻璃离心管中加入 2 ml 样品, 然后加入 4 ml 乙腈 : 甲基叔丁基谜 (9:1,V/V), 将离 心管涡旋 2 min, 最后加入 Cleanert MAS-PAE-C 填料, 再将离心管涡旋振荡 2min 后, 以 4000 rpm 的转速离心 5 min, 取上清液, 以邻苯二甲酸酯检测专用针式过滤器过滤后, 待检 6. 油性样品 方法一 : 内部方法 固相萃取柱 :Cleanert PAE-G 玻璃柱,3 g/6 ml (P/N:PAE30006-G) (1) 样品制备 用万分之一天平称取 0.1 g 油, 置于玻璃离心管中, 然后加入 3 ml 乙腈, 涡旋 2 min, 超声 2 min, 以 4000 rpm 离心 2 min, 将上清液转移至另一玻璃管中, 在 40 下以氮气吹 干, 加入 2 ml 正己烷, 轻轻振荡摇匀, 作为待净化液 (2) 固相萃取方法 活化 : 5 ml 正己烷 上样 : 将待净化液全部加到固相萃取柱中 淋洗 : 用 10 ml 1% 乙酸乙酯的正己烷 洗脱 : 用 5 ml 50% 乙酸乙酯的正己烷 收集洗脱液, 在 40 下以氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈, 涡旋 1 min, 超声 1 min, 以 4000 rpm 离心 2 min, 取上清液进 GC/MS 检测 注 : 所使用乙酸乙酯必须是农残级 方法二 SN/T 固相萃取柱 :Cleanert PSA 玻璃柱,1g / 6mL(P/N:PA00006-G) (1) 样品制备

13 称取 1.0 g 样品于玻璃离心管中, 加入 2 ml 正己烷和 10 ml 乙腈, 涡旋 2 min, 以 4000 r/m 离心 2 min, 转移下层清液转移至另一样品瓶中, 以 10 ml 乙腈重复提取样品一次, 合并提取液,40 氮气吹至近干, 加入 2 ml 正己烷复溶作为待净化液 (2) 净化活化 : 将 Cleanert PSA 玻璃固相萃取柱用 5 ml 丙酮 5 ml 正己烷活化上样 : 将待净化液全部加到固相萃取柱中 ; 洗脱 : 用 5 ml 正己烷, 然后用 5 ml 4% 丙酮 正己烷溶剂洗脱, 合并洗脱液收集洗脱液, 在 40 下以氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈溶解, 进 HPLC 检测 7. 复杂基质样品 ( 如方便面填料包 ) 固相萃取柱 :Cleanert PAE-C 玻璃柱,1g / 6 ml(p/n:pae30006-c) 7.1 样品制备用万分之一天平取 0.5 g 调料, 置于玻璃样品瓶中, 加入 3 ml 乙腈 / 甲基叔丁基醚 (9:1, v/v), 涡旋 2 min, 超声 2 min, 以 4000 r/m 离心 2 min, 将上清液转移至另一干净样品瓶中, 往装调料的样品瓶中再加入 3 ml 乙腈 / 甲基叔丁基醚 (9:1,v/v), 涡旋 2 min, 超声 2 min, 以 4000 r/m 离心 2 min, 将上清液合并, 于 40 氮气吹干, 加入 1 ml 正己烷, 摇匀, 作为待净化液 7.2 样品净化活化 :5 ml 正己烷上样 : 全部待净化液淋洗 : 10 ml 1% 乙酸乙酯 / 正己烷 (v/v) 洗脱 :5 ml 乙酸乙酯 : 正己烷 (50:50,v/v) 将洗脱液于 40 下氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min, 超声 1 min,4000 r/m 离心 3 min, 转移上清液至进样样品瓶中, 待检测 注 : 所使用乙酸乙酯必须是农残级 8. 保健品 ( 粉末状样品 ) 固相萃取材料 :Cleanert MAS-PAE,40 ml ; 玻璃散装填料 (P/N:MS-PAE40); 用万分之一天平取样品 0.5 g, 置于 12 ml 玻璃样品瓶中, 加入 4 ml 乙腈 / 甲基叔丁基醚 (9:1,v/v), 涡旋 2 min, 加入 Cleanert MAS-PAE 填料, 涡旋 2 min, 超声 2 min, 以 7000 r/m 离心 5 min, 用 PAEs 专用滤头过滤上清液, 待检测 9. 保健品 ( 胶囊等样品 ) 固相萃取材料 :Cleanert MAS-PAE-C,40 ml; 玻璃散装填料 (P/N:MS-PAE40-C); 以内装液体的胶囊为例, 用干净针将胶囊挑破, 将胶囊中的液体挤出, 用万分之一天平称取样品 0.1 g, 置于 12 ml 玻璃样品瓶中, 加入 4 ml 乙腈 / 甲基叔丁基醚 (9:1,v/v), 涡旋 2 min, 加入 Cleanert MAS-PAE-C 填料, 涡旋 2 min, 超声 2 min, 以 7000 r/m 离心 5 min, 用 PAEs 专用滤头过滤上清液, 待检测

14 二 检测方法 1. 高效液相色谱法色谱条件色谱柱 :Venusil XBP C18-L, mm,5 μm,150å (P/N:VX L); 流动相 :A 相 - 水,B 相 - 甲醇 : 乙腈 = 50:50 (v/v) 流速 :1.0 ml/min; 波长 :242 nm 进样量 :5 μl ( 样品浓度 100 ppm),50 μl ( 样品浓度 10 ppm); 溶剂 : 正己烷 / 流动相 A + 流动相 B (40+60); 柱温 :30 梯度洗脱 : 见表 1 表 1. 液相色谱梯度洗脱条件 时间 /min A/% B/%

15 图 种邻苯二甲酸酯类标准品 HPLC 色谱图 ( 样品浓度为 25 ppm) ( 邻苯二甲酸二甲酯 DMP, 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 DMEP, 邻苯二甲酸二乙氧基乙基酯 DEEP, 邻苯二甲酸二乙酯 DEP, 邻苯二甲酸二苯酯, 邻苯二甲酸丁苄酯 BBP, 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP, 邻苯二甲酸二正丁酯 DBP, 邻苯二甲酸二丁氧基乙酯 DBEP, 邻苯二甲酸二戊酯 DPP, 邻苯二甲酸二环己酯 DCHP, 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 BMPP, 邻苯二甲酸二己酯 DHXP, 邻苯二甲酸二 (2- 乙基己基 ) 酯 DEHP, 邻苯二甲酸二辛酯 DNOP, 邻苯二甲酸二壬酯 DNP) 2. 气相色谱质谱法 2.1 气相色谱条件色谱柱 :DA-5MS,30 m 0.25 mm 0.25 μm; 进样口 :250, 不分流进样 ; 进样量 :1 μl; 程序升温 :50 (1 min) 20 /min 220 (1 min) 5 /min 280 (4 min); 流速 :1 ml/min 2.2 质谱条件接口温度 :280 ; 电离方式 :EI; 电离能量 :70 ev; 溶剂延迟 :7 min; 监测方式 :SIM 模式, 监测离子见表 2 表 种邻苯二甲酸酯类化合物定量离子及定性离子 编 号 保留时 间 /min 中文名称 英文缩 写 SIM 离子 辅助定 性离子 邻苯二甲酸二甲酯 DMP 邻苯二甲酸二乙酯 DEP 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP

16 邻苯二甲酸二丁酯 DBP 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 DMEP 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 BMPP 邻苯二甲酸二 (2- 乙氧基 ) 乙酯 DEEP 邻苯二甲酸二戊酯 DPP 邻苯二甲酸二己酯 DHXP 邻苯二甲酸丁基苄基酯 BBP 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 DBEP 邻苯二甲酸二环己酯 DCHP 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 DEHP 邻苯二甲酸二苯酯 邻苯二甲酸二正辛酯 DNOP 邻苯二甲酸二壬酯 DNP 图 种邻苯二甲酸酯类标准品 HPLC 色谱图 ( 样品浓度为 25 ppm) ( 邻苯二甲酸二甲酯 DMP, 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 DMEP, 邻苯二甲酸二乙氧基乙基酯 DEEP, 邻苯二甲酸二乙酯 DEP, 邻苯二甲酸二苯酯, 邻苯二甲酸丁苄酯 BBP, 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP, 邻 苯二甲酸二正丁酯 DBP, 邻苯二甲酸二丁氧基乙酯 DBEP, 邻苯二甲酸二戊酯 DPP, 邻苯二甲酸二环己

17 酯 DCHP, 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 BMPP, 邻苯二甲酸二己酯 DHXP, 邻苯二甲酸二 (2- 乙基己 基 ) 酯 DEHP, 邻苯二甲酸二辛酯 DNOP, 邻苯二甲酸二壬酯 DNP) 三 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST1116 邻苯二甲酸二甲酯 Dimethyl phthalate ST1118 邻苯二甲酸二乙酯 (DEP) Diethyl phthalate ST1119 邻苯二甲酸二异丁酯 (DIBP) Diisobutyl phthalate ST1114 邻苯二甲酸二丁酯 Di-n-butyl phthalate ST1122 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 Bis(2-methoxyethyl) phthalate ST1124 邻苯二甲酸双 (4- 甲基 -2- 戊 ) 酯 Bis(4-methyl-2-pentyl) Phthalate ST1123 邻苯二甲酸双 (2- 乙氧基乙 ) 酯 Bis(2-ethoxyethyl) phthalate ST1117 邻苯二甲酸二戊酯 (DPP) Di-n-pentyl phthalate ST1120 邻苯二甲酸二正己酯 (DNHP) Di-n-hexyl phthalate ST1111 邻苯二甲酸丁基苄基酯 Benzyl n-butyl phthalate ST1113 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 Bis(2-butoxyethyl) phthalate ST1115 邻苯二甲酸二环己酯 Dicyclohexyl phthalate ST1125 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 Bis(2-ethylhexyl) phthalate ST1112 邻苯二甲酸二苯酯 Diphenyl phthalate ST1121 邻苯二甲酸二正辛酯 Di-n-octyl phthalate ST1126 邻苯二甲酸二壬酯 Di-n-nonyl phthalate 四 订货信息 产品名称订货号说明规格 包装 ( 支 / 盒 ) 价 格 ( 元 ) DEHP5006 用于水 饮料等样品 500 mg/6 ml Cleanert PAE 增塑剂 MS-PAE40 乳品及乳制品饮料等 40 ml 玻璃样品瓶 系列专用柱 MS-PAE40-C 酱油等复杂水性样品 40 ml 玻璃样品瓶 PAE30006-G 油性样品 3 g/6 ml

18 PAE30006-C PA0006-G 复杂油性样品如方便面调料包 火锅底料等适用于 SN/T g/6 ml g/6 ml 邻苯二甲酸 酯检测专用 针式过滤器 适用于增塑剂类定制 询价 乙酸乙酯 农残级 4 L/ 瓶 4 4 L/ 箱 1600

19 植物油中 16 种邻苯二甲酸酯类化合物的测定 (SPE-GC/MS 法 )* 案例来源 : 博纳艾杰尔 1. 样品提取 用万分之一天平取 0.1 g 食用植物油, 置于玻璃样品瓶中, 加入 3 ml 乙腈, 涡旋 2 min, 超声 2 min, 以 4000 r/m 离心 2 min, 将上清液转移至另一干净样品瓶中, 于 40 氮气吹干, 加入 1 ml 正己烷, 摇匀, 作为待净化液 2. 固相萃取净化 固相萃取操作在玻璃固相萃取装置上进行, 在重力状态下操作, 过程如下 : 活化 : 用 5 ml 正己烷活化 Cleanert PAE 柱 ; 上样 : 将待净化液全部上样 ; 淋洗 :10 ml 乙酸乙酯 ( 进口农残级 )/ 正己烷 (1:99,v/v); 洗脱 :5 ml 乙酸乙酯 ( 进口农残级 )/ 正己烷 (1:1,v/v); 将洗脱液于 40 下氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈, 涡旋混合 1 min, 超声 1 min,4000 r/m 离心 2 min, 取上清液进 GC/MS 测定 图 种邻苯二甲酸酯类化合物选择离子色谱图 (500ppb) 出峰顺序依次为 : 邻苯二甲酸二甲酯 (DMP) 邻苯二甲酸二乙酯 (DEP) 邻苯二甲酸二 异丁酯 (DIBP) 邻苯二甲酸二丁酯 (DBP) 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 (DMEP) 邻苯二甲 酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 (BMPP) 邻苯二甲酸二 (2- 乙氧基 ) 乙酯 (DEEP) 邻苯二甲酸二戊酯

20 (DPP) 邻苯二甲酸二己酯(DHXP) 邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP) 邻苯二甲酸二(2- 丁氧基 ) 乙酯 (DBEP) 邻苯二甲酸二环己酯(DCHP) 邻苯二甲酸二(2- 乙基 ) 己酯 (DEHP) 邻苯二甲酸二苯酯 邻苯二甲酸二正辛酯 (DNOP) 邻苯二甲酸二壬酯(DNP) 3 加标回收率 精密度及色谱图 从市场上购置食用油 A, 取 5 份样品, 向其中加入一定量的标准品, 按照上述样品处理方法平行处理 5 份样品, 同时处理两份空白油样, 回收率及方法精密度见表 1, 所得色谱图见图 2-5 图 2 溶剂空白色谱图 ( 按照上述样品净化方法操作, 收集洗脱液浓缩定容后进样 ) 图 3 食用油 A 空白色谱图

21 图 4 食用油 A 中加标色谱图 ( 最后定容浓度为 100ppb) 图 5 食用油 A 中加标色谱图 ( 最后定容浓度为 500ppb) 表 1 食用油 A 中 16 种邻苯二甲酸酯类化合物的添加回收率及精密度 峰 号 化合物 简称 保 时间 留 加标浓度 100ppb 加标浓度 500ppb 平均回 RSD(n= 平均回 RSD(n 收率 5) 收率 =5) 1 邻苯二甲酸二甲酯 DMP % 15.19% % 3.72% 2 邻苯二甲酸二乙酯 DEP % 15.09% % 2.99%

22 邻苯二甲酸二异丁酯邻苯二甲酸二丁酯邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯邻苯二甲酸二 (2- 乙氧基 ) 乙酯邻苯二甲酸二戊酯邻苯二甲酸二己酯邻苯二甲酸丁基苄基酯邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯邻苯二甲酸二环己酯邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯邻苯二甲酸二苯酯邻苯二甲酸二正辛酯邻苯二甲酸二壬酯 DIBP % 8.11% 70.87% 6.94% DBP % 15.75% 91.53% 5.75% DMEP % 10.09% 98.52% 5.55% BMPP % 8.50% 82.96% 3.85% DEEP % 7.08% 95.11% 3.73% DPP % 6.62% 88.51% 4.17% DHXP % 5.48% 89.17% 4.95% BBP % 5.69% 97.01% 5.20% DBEP % 5.72% 96.64% 5.34% DCHP % 6.96% 88.87% 5.52% DEHP % 5.31% 80.02% 8.67% % 9.31% 66.12% 3.96% DNOP % 7.48% 82.41% 5.88% DNP % 13.90% 74.98% 5.95% 说明 : 由于邻苯二甲酸二异丁酯 邻苯二甲酸二丁酯 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯是常见的 增塑剂, 在溶剂 油脂中会有些残留, 容易在检测时造成它们的回收率和 RSD 不理想 建 议计算时扣除空白 表 1 的数据是扣除了空白油样的测量值得到的结果

23 4. 实际样品测试结果 另从市场上购买了某品牌的食用油 B, 按照前述方法进行测试, 结果如下 图 6. 某品牌食用油 B 测试邻苯二甲酸酯色谱图 表 2. 食用油 A B 中邻苯二甲酸酯含量 含量 (ppb) 峰号化合物简称 A B 1 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP 邻苯二甲酸二丁酯 DBP 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 DEHP 结论 利用 Cleanert PAE 固相萃取柱和 GC/MS, 可以建立对油脂中 16 种邻苯二甲酸酯的检测 方法, 方法具有较好的回收率和重现性 需要注意的是, 在实验操作过程中, 不可以使用塑 料制品来接触样品或者溶剂, 同时一定要事先考察溶剂空白 6. 相关标准品 订货号中文名称英文名称 CAS# 1ST1116 邻苯二甲酸二甲酯 Dimethyl phthalate ST1118 邻苯二甲酸二乙酯 (DEP) Diethyl phthalate ST1119 邻苯二甲酸二异丁酯 (DIBP) Diisobutyl phthalate

24 1ST1114 邻苯二甲酸二丁酯 Di-n-butyl phthalate ST1122 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 Bis(2-methoxyethyl) phthalate ST1124 邻苯二甲酸双 (4- 甲基 -2- 戊 ) 酯 Bis(4-methyl-2-pentyl) Phthalate ST1123 邻苯二甲酸双 (2- 乙氧基乙 ) 酯 Bis(2-ethoxyethyl) phthalate ST1117 邻苯二甲酸二戊酯 (DPP) Di-n-pentyl phthalate ST1120 邻苯二甲酸二正己酯 (DNHP) Di-n-hexyl phthalate ST1111 邻苯二甲酸丁基苄基酯 Benzyl n-butyl phthalate ST1113 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 Bis(2-butoxyethyl) phthalate ST1115 邻苯二甲酸二环己酯 Dicyclohexyl phthalate ST1125 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 Bis(2-ethylhexyl) phthalate ST1112 邻苯二甲酸二苯酯 Diphenyl phthalate ST1121 邻苯二甲酸二正辛酯 Di-n-octyl phthalate ST1126 邻苯二甲酸二壬酯 Di-n-nonyl phthalate 订货信息 订货号 产品名称 规格包装 邻苯二甲酸酯 16 种混标 1000 μg/ml( 正己烷 ),1 ml/pk PAE30006-G Cleanert PAE 净化柱 ( 高脂样品 ) 3 g/6 ml, 30/PK DA-5MS 气相色谱柱 30 m 0.25 mm 0.25 μm ml 样品瓶 ml 样品瓶盖 短螺纹透明带书写 mm, 100/pk 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk AH015-4 乙腈 4 4 L/ 箱 AH100-4 乙酸乙酯 4 4 L/ 箱 AH216-4 正己烷 4 4 L/ 箱

25 白酒中 16 种邻苯二甲酸酯类物质检测整体解决方案 (GC/MS 法 HPLC 法 )* 案例来源 : 博纳艾杰尔 1 样品制备 a) 将白酒用去离子水稀释, 使其中的乙醇的含量为 5% 例如: 某种白酒含酒精 52%, 那么取 9.6 ml 白酒, 用去离子水稀释定容至 100mL, 即可得 5% 的酒精含量的样品液 b) 取 1 ml 甲醇加入 19 ml 去离子水, 混匀, 得到 5% 甲醇水溶液, 为淋洗液 2 固相萃取柱净化 SPE 柱 :Cleanert DEHP 玻璃固相萃取柱活化 : 用玻璃移液管分别取 5 ml 乙酸乙酯 5 ml 甲醇,5 ml 水, 在重力状态下依次过柱 ; 上样 : 用玻璃移液管取 100 ml 样品液加到柱上 ; 淋洗 : 用玻璃移液管取 5 ml 5% 甲醇 / 水溶液淋洗固相萃取柱 淋洗结束之后, 开启真空泵, 抽 20 min, 抽干之后, 加入 2 ml 甲醇浸泡柱床约 1 min; 洗脱 : 用 10 ml 乙酸乙酯洗脱固相萃取柱, 收集洗脱液 将洗脱液分别于 35 氮吹至干, 用 1 ml 甲醇定容, 将溶液转移至进样样品瓶, 进行 GC/MS 或 HPLC 检测, 检测方法请参见上篇 注意事项 : 实验过程中, 试剂及容器必须为玻璃, 尽量避免接触塑料制品 甲醇必须是进口色谱纯, 乙酸乙酯必须是进口农残级 3 实验结果及结果分析 取 2 份 10 ml 含 5% 酒精的白酒样品溶液, 各加入 1 ppm 邻苯二甲酸酯类混标 100 μl, 按照上述方法进行操作和 GC/MS 检测, 得到的色谱图见图 1, 回收率数据见表 实验谱图

26 图 1 加标样品气相色谱图 ( 定容浓度为 100 ppb) 3.2 实验数据 取 2 份 10 ml 含 5% 酒精的白酒样品溶液, 各加入 1 ppm 邻苯二甲酸酯类混标 100 μl, 按照上述方法进行操作和 GC/MS 检测, 得到的色谱图见图 1, 回收率数据见表 1 化合物保留时间 /min 样品 1 样品 2 邻苯二甲酸二甲酯 % % 邻苯二甲酸二乙酯 % % 邻苯二甲酸二异丁酯 % % 邻苯二甲酸二丁酯 % % 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 % 99.47% 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 % 83.94% 邻苯二甲酸二 (2- 乙氧基 ) 乙酯 % % 邻苯二甲酸二戊酯 % 66.29% 邻苯二甲酸二己酯 % 62.29% 邻苯二甲酸丁基苄基酯 % 95.98% 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 % %

27 邻苯二甲酸二环己酯 % 86.31% 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 % 89.61% 邻苯二甲酸二苯酯 % % 邻苯二甲酸二正辛酯 % 99.88% 邻苯二甲酸二壬酯 % 97.86% 注意 : 邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二乙酯 邻苯二甲酸二异丁酯 邻苯二甲酸二丁酯是使用非常普遍的增塑剂, 广泛的存在于环境中, 因而测试时十分容易造成背景过高的干扰问题 尤其需要注意的是氮吹时, 使用的氮吹仪, 应该是专用的仪器, 而且必须定期用进口色谱纯的乙酸乙酯清洗氮吹的针头 图 2 16 种邻苯二甲酸酯标准品 HPLC 色谱图 ( 样品浓度 :25 ppm) 邻苯二甲酸二甲酯 DMP, 邻苯二甲酸二乙酯 DEP, 邻苯二甲酸二正丁酯 DBP, 邻苯二甲酸 二辛酯 DNOP, 邻苯二甲酸二苯酯, 邻苯二甲酸丁苄酯 BBP, 邻苯二甲酸二 (2- 乙基己基 ) 酯 DEHP, 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 DMEP, 邻苯二甲酸二丁氧基乙酯 DBEP, 邻苯 二甲酸二戊酯 DPP, 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 BMPP, 邻苯二甲酸二乙氧基乙基酯 DEEP, 邻苯二甲酸二环己酯 DCHP, 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP, 邻苯二甲酸二己酯 DNP, 邻苯二甲酸二壬酯 DINP 4 相关标准品 订货号中文名称英文名称 CAS# 1ST1116 邻苯二甲酸二甲酯 Dimethyl phthalate ST1118 邻苯二甲酸二乙酯 (DEP) Diethyl phthalate

28 1ST1119 邻苯二甲酸二异丁酯 (DIBP) Diisobutyl phthalate ST1114 邻苯二甲酸二丁酯 Di-n-butyl phthalate ST1122 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 Bis(2-methoxyethyl) phthalate ST1124 邻苯二甲酸双 (4- 甲基 -2- 戊 ) 酯 Bis(4-methyl-2-pentyl) Phthalate ST1123 邻苯二甲酸双 (2- 乙氧基乙 ) 酯 Bis(2-ethoxyethyl) phthalate ST1117 邻苯二甲酸二戊酯 (DPP) Di-n-pentyl phthalate ST1120 邻苯二甲酸二正己酯 (DNHP) Di-n-hexyl phthalate ST1111 邻苯二甲酸丁基苄基酯 Benzyl n-butyl phthalate ST1113 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 Bis(2-butoxyethyl) phthalate ST1115 邻苯二甲酸二环己酯 Dicyclohexyl phthalate ST1125 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 Bis(2-ethylhexyl) phthalate ST1112 邻苯二甲酸二苯酯 Diphenyl phthalate ST1121 邻苯二甲酸二正辛酯 Di-n-octyl phthalate ST1126 邻苯二甲酸二壬酯 Di-n-nonyl phthalate 订货信息 订货号产品名称规格包装 FL-LC010GS LC-10F 高效液相色谱仪 10 ml/min, 梯度系统, nm 双波长检 测器 邻苯二甲酸酯 16 种混标 1000 μg/ml(1 ml 正己烷 ),1 ml/pk DEHP5006 Cleanert DEHP 玻璃固相 萃取柱 ( 水性样品 ) 500 g/6 ml, 30 支 /pk DA-5MS 气相色谱柱 30 m 0.25 mm 0.25 μm ml 样品瓶短螺纹透明带书写 mm, 100/pk ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔 垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk AH230-4 甲醇 4 4 L/ 瓶 AH100-4 乙酸乙酯 4 4 L/ 箱

29 婴幼儿奶粉中双氰胺的检测 HPLC-UV 法和 LC-MS/MS 法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF 样品 新西兰婴儿配方奶粉 (0~6 个月 ) 2 样品提取及净化 称取 1 g 试样于 50 ml 具塞离心管中, 加 2 ml 水, 涡旋 30 s, 加 2 ml 乙腈涡旋 30 s 再往现有的提取液中加 2 ml 乙腈, 重复上述提取步骤 再将该提取步骤重复 2 次, 得到共计约 10 ml 的提取液 以 4000 r/min 离心 5 min, 将全部上清液加入新一代 Cleanert MAS- QuChERS 管中 (500 mg/15 ml), 将 MAS 管上下晃动 30 s, 然后涡旋 30 s 后,8000 r/min 离心 5 min, 取全部上清液 ( 约 10 ml) 于玻璃试管中,50 下氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈 - 水混合溶液 (97:3) 复溶, 过 0.22 μm 滤器, 待测 注 : a. 做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂, 防止加标瞬间发生蛋白沉淀 ; b. 乙腈提取分 4 次, 为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快, 影响提取效果 ; c. 净化液氮气吹干后, 如发现有少量油脂, 可采用 1 ml 乙腈 : 水 (97:3) 混合溶液复溶, 之后加入 1 ml 正己烷 ( 色谱纯 ) 液液萃取, 取下层溶液过 0.22 μm 针式过滤器, 进样检测

30 3 检测方法 3.1 高效液相色谱法色谱柱 :Venusil HILIC(5 μm,100å, mm); 流动相 : 10 mmol/l 乙酸铵 (ph 为 4.0): 乙腈 =3:97; 波长 :220 nm; 进样量 :10 μl; 柱温 :30 ; 流速 :0.8 ml/min 注 : 本实验选用的奶粉经过净化后, 按 10 mmol/l 乙酸铵 (ph 为 4.0): 乙腈 =15:85 液相条件, 有一个杂质与双氰胺完全重合, 经实验条件优化后, 确定流动相条件为 10 mmol/l 乙酸铵 (ph 为 4.0): 乙腈 =3:97, 双氰胺保留时间为 9.3 min, 可以和杂质完全分离 3.2 液相色谱串联质谱法色谱柱 :Venusil HILIC(5 μm,100å, mm); 流动相 :A:0.5 mmol/l 乙酸铵 (ph 为 4.0) B: 乙腈 ; 进样量 :10 μl; 柱温 :30 ; 流速 :0.3 ml/min 表 2 流动相梯度程序 时间 (min) A% B% * 备注 : 本文曾尝试过多种 C18 色谱柱, 对双氰胺没有保留, 需要使用离子对试剂, 但是无 法用于 LC-MS/MS; 也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱, 但是得到双氰胺的峰面积偏差较 大, 分析原因是其具有阳离子交换基团, 对双氰胺有不稳定的死吸附 最后确定使用键合丙

31 基酰胺的 Venusil HILIC 柱, 以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留 3.3 质谱条件质谱仪 :API 4000+; 离子源 : 电喷雾离子源 ; 扫描方式 : 正离子扫描 ; 检测方式 : 多反应监测 ;CAD:8.00; CUR:20.00;GS1:60.00;GS2:50.00;IS: ;TEM: 表 3 双氰胺质谱信息 药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP 双氰胺 85.1/ / 结果与讨论 4.1 高效液相色谱法 图 3 双氰胺 10μg/mL 标准溶液的液相色谱图 实际样品基质加标的线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 ml 容量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 作为标准贮备液 ; 分别称取 1 g 奶粉试样, 添加一定量标准溶液, 配制成含双氰胺为 0.5 μg/g,1 μg/g, 2 μg/g,5.0 μg/ml 和 10 μg/g 的添加样品, 按照上述提取 净化方法操作, 所得净化液按照上述色谱条件, 依次进样检测 以双氰胺含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见表 4

32 表 4 双氰胺线性方程和定量限 (HPLC 法 ) 名称保留时间线性方程相关系数最低定量限 (S/N=10) 双氰胺 5.57min Y=108.16X μg/g 准确度和精密度 选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样, 进行添加回收实验, 结果见表 5 表 5 0.5μg/g 添加回收实验结果 (HPLC 法 ) 平行 1 平行 2 平行 3 平均值 RSD 82.30% 85.50% 89.10% 85.63% 3.97% 图 4 奶粉 0.5μg/g 添加谱图 图 5 奶粉空白谱图

33 4.2 LC-MS/MS 法 图 6 双氰胺 10ng/mL 标准溶液质谱图 实际样品基质加标的线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 ml 容量瓶中, 加水溶液并稀释至刻度, 作为标准贮备液 ; 分别称取 1 g 奶粉试样, 添加一定量标准溶液, 配制成含双氰胺为 5 ng/ml,10 ng/ml,50 ng/ml,100 ng/ml 和 200 ng/ml 的添加样品, 按照上述提取 净化方法操作, 所得净化液按照上述液质条件, 依次进样检测 以双氰胺含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见表 6 表 6 双氰胺线性方程和定量限 (LC-MS/MS 法 ) 名称保留时间线性方程相关系数最低定量限 (S/N=10) 双氰胺 3.15min Y=3859.1X ng/g 准确度和精密度选取市售某婴幼儿奶粉试样, 进行添加回收实验, 结果见表 7 采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响 空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液, 双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化, 故判断该方法无基质效应的影响 表 7 10 ng/g 添加回收实验结果 平行 1 平行 2 平行 3 平均值 RSD 82.50% 83.50% 89.30% 85.20% 4.31%

34 图 7 婴幼儿奶粉空白质谱图 图 8 婴幼儿奶粉 10 ng/g 添加水平的质谱图 5 相关标准品 订货信息中文名称英文名称 CAS# 1ST6601 ( 双氰胺 ) 二聚氰胺 Dicyanodiamide

35 6 订货信息 订货产品名称规格包装 MS-SQA02 新一代 MAS-QuChERS- 双氰胺 净化管 ( 填料量加大, 更适合婴 幼儿奶粉等复杂样品 ) 500 mg/15 ml,50 支 / 包 MS-SQA01 MAS-QuChERS- 双氰胺净化管 100 mg/2 ml,50 支 / 包 VH Venusil HILIC mm,5 μm,100 Å VH 液相色谱柱 mm,5 μm,100 Å AS 针式过滤器 (Nylon) 0.22 μm, 直径 13 mm, 200/pk ZSQ-5ML 一次性注射器, 无针头 5 ml,100/pk DCD-0001 双氰胺对照品 500 mg / 瓶, 含量 99.0% DCD g/ 瓶, 含量 99.0% LXG0050 离心管 50 ml, 带螺纹盖,25 个 / 包 ml 样品瓶短螺纹透明带书写 mm,100/pk ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk AH015-4 乙腈 4 4 L/ 箱

36 鸡蛋中三聚氰胺的检测 (HPLC 法 ) 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF 三聚氰胺标准溶液配制 称取三聚氰胺标样 10.0 mg, 加流动相溶解定容至 100 ml, 即得浓度为 100 mg/l 的三聚氰胺标样溶液 将浓度为 100 mg/l 的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为 1 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 15 mg/l 20 mg/l 的标准品溶液, 用 0.45 μm 滤膜过滤后进液相色谱检测 2 样品提取 将鸡蛋打开搅匀, 分别称取 1.00 g 鸡蛋样本置于 10 ml 具塞离心管中, 分别加入 m g / L 三聚氰胺标样溶液 10 μl 20 μl 100 μl, 分别得到添加浓度为 1.0 mg/kg 2.0 mg/kg 10.0 mg/kg 的样本 往装有上述样本的具塞离心管中分别加入 10 ml 1% 三氯乙酸溶液,2 ml 5% 醋酸铅溶液, 摇匀, 超声 20 分钟,8000 rpm 离心 10 分钟, 全部上清液转入固相萃取仪上样管中 Cleanert PCX 混合型阳离子交换固相萃取柱, 标记序号依次放入 QdauraTM 卓睿全自动固相萃取仪中, 上样管中放置对应样品, 设定操作程序如下 :3 ml 甲醇,3 ml 水依次活化, 加样,3 ml 水,3 ml 甲醇淋洗, 抽干, 最后用 5 ml5% 的氨化甲醇洗脱 (V/V), 接收洗脱液 ( 以上操作流速均为 1 ml/min), 取出收集管于 50 氮气吹干, 用 1 ml 流动相定容,0.45 μm 滤器过滤后进液相色谱检测 3. 色谱条件 色谱柱 :Venusil ASB C8, mm,5 μm; 流动相 : 乙腈 :10 mm/l 柠檬酸 +10 mm/l 庚烷磺酸钠, 缓冲液 =7:93(pH 为 3.0) 波长 :240 nm; 流速 :1 ml/min; 进样 :20 μl 4 实验结果 4.1 峰型与分离度分别移取浓度为 1.0 mg/l 5.0 mg/l 的三聚氰胺标准溶液, 分别连续进样 6 次, 结果如表 1 所示 由表 1 结果可见, 本方法具有很好的精密度和重现性

37 图 1 鸡蛋空白样品和鸡蛋添加 10 ppm 的样品图谱

38 表 1 保留时间与峰面积的稳定性数据 浓度 mg/ ml 指标 1# 2# 3# 4# 5# 6# 平均值 RSD% 1 保留时 间 (min) 峰面积 保留时 间 (min) 峰面积 标准校正曲线 根据表 2 数据计算线性方程为 :y = 87.43x ,R²= 0.999, 相关曲线见图 2 结果 显示, 该方法在 1~20mg/kg 范围内线性关系良好 表 2 标准校正曲线实验数据 浓度 mg/kg 峰面积第 1 次进样 峰面积第 2 次进样 峰面积均值

39 图 2 浓度与峰面积的回归曲线 结果显示, 该方法在 1~20 mg/kg 范围内线性关系良好 4.3 添加回收率 由表 3 可见, 本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好 表 3 添加浓度与回收率数据 添加浓度 (mg/kg) 峰面积 计算含量 回收率 (%) 结论 通过上述实验可见, 运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺, 基质净化效果好, 杂质干扰小, 色谱 峰型良好对称度高, 操作简单方便, 和准确度高等优点, 非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的检测

40 6 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST6602 三聚氰胺 Melamine 附 : 订货信息 订货号 产品名称 规格包装 SJ-SJQA-100 三聚氰胺标准品 ( 99.0%) 100 g/pk ION-Q7-25 庚烷磺酸钠 ( 色谱级 ) 25g FL-LC010GS CC-100 LC-10F 高效液相色谱仪 CC-100 分析型色谱柱温箱 10 ml/min, 梯度系统, nm 双波长检测器温控范围 :5~70 ; 可安装 1-2 支 300 mm 色谱柱 SPE-40 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪 4 通道 24 位 CX0603 Cleanert PCX 60 mg/3 ml, 50/pk VS Venusil ASB C8 液相色谱柱 mm, 5 μm AS 针式过滤器 (Nylon) 0.45 μm, 直径 13 mm,200/pk ZSQ-5ML 一次性无针头注射器 5 ml, 100/pk ml 样品瓶 短螺纹透明带书写 mm, 100/pk ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk AH230-4 甲醇 4 4 L/ 瓶

41 食品中苏丹红染料的检测 (HPLC 法 ) 升级版方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用简介 本实验利用装填具有芳香性功能基团的聚合物材料的 Cleanert Sudan 固相萃取柱萃取辣 椒油 辣椒粉等食品中 4 种苏丹红, 然后再用二氯甲烷洗脱, 开发了一套食品中 4 种苏丹红 检测的新方法, 与国标方法相比, 可获得更稳定的回收率, 溶剂用量更少更环保, 方法也更 简便 前言 GB/T 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法 中采用正己烷作为 萃取溶剂, 用氧化铝固相萃取柱净化样品 该方法样品处理过程复杂, 且氧化铝的活性不易 控制, 回收率难以得到保证 本实验利用装填具有芳香性功能基团的聚合物材料的 Cleanert Sudan 固相萃取柱萃取辣 椒油 辣椒粉等食品中 4 种苏丹红, 然后再用二氯甲烷洗脱, 开发了一套食品中 4 种苏丹红 检测的新方法, 与国标方法相比, 可获得更稳定的回收率, 溶剂用量更少更环保, 方法也更 简便 1 样品提取及净化 1.1 辣椒粉等粉状样品 称取 0.5 g( 准确至 g) 样品于三角瓶中, 加入 5 ml 正己烷, 超声 10 min, 过滤, 将 滤液于 5000 r/min 下离心 5 min 后取上清液 3 ml, 待净化 加标样品的处理 : 向 0.5 g( 准确至 g) 辣椒粉中加入 2 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混标以 及 4 ml 正己烷, 然后按照上述方法进行预处理 1.2 辣椒油等油状样品 称取 0.5 g( 准确至 g) 样品于小烧杯中, 加入 3 ml 正己烷溶解, 涡旋 1 分钟混匀, 待净化 加标样品的处理 : 向 0.5 g( 准确至 g) 辣椒油样品中加入 1 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混 标, 然后按照上述方法进行处理 1.3 火腿肠类样品 将火腿肠切成小丁, 称取 3.0 g( 准确至 g), 放入 10 ml 离心管中, 加入 5mL 正己 烷, 超声 10 min,5000 r/min 离心 5 min 后取上清液 3 ml, 待净化 加标样品的处理 : 将火腿肠切成小丁, 称取 3.0 g( 准确至 g), 放入 10 ml 离心管 中, 加入 2 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混标以及 4 ml 正己烷, 然后按照上述方法进行处理 1.4 火锅底料等酱类样品 称取火锅底料 1.0 g( 准确至 g), 加入 1 ml 水, 再加 5 ml 正己烷, 涡旋 3 分钟,

42 超声 10 分钟, 接着以转速 6000 r/min 离心 5 分钟, 取上层有机相 3mL, 加入无水硫酸钠 0.5 g, 涡旋 0.5 分钟, 静置取上清液作为上样液 加标样品的处理 : 向 1.0 g( 准确至 g) 火锅底料中加入 1mL 水, 再加 2 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混标及 4 ml 正己烷, 然后按照上述方法进行处理 2 净化方法 净化样品所用固相萃取柱为 Cleanert Sudan 苏丹红专用柱 (500 mg/6 ml) 1. 活化 : 在 Cleanert Sudan 苏丹红专用柱中依次加入 5 ml 二氯甲烷,5 ml 正己烷 2. 萃取 : 将 3.1 中的待净化液加入 Cleanert Sudan 柱中, 再用 1mL 正己烷洗涤样品瓶, 一并加入 SPE 柱中, 流出液弃去 3. 淋洗 : 待上样液完全流出后, 用 3 ml 3% 异丙醇 - 正己烷溶液淋洗, 淋洗液弃去, 开启真空泵, 将小柱抽干 4. 洗脱 :3 ml 二氯甲烷洗脱, 收集洗脱液 5. 吹干与定容 : 将洗脱液于 50 下氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈溶解, 使用 0.45 μm PTFE 有机滤膜过滤后, 进行 HPLC 分析 3 色谱条件 色谱柱 :Venusil MP C18,5 μm 100Å, mm 流动相 : 乙腈 : 水 =97:3(v/v) 流速 :1.0 ml/min 进样量 :20 μl 柱温 :35 检测波长 :520 nm 4 实验结果 液相色谱条件下, 将浓度为 4 μg/ml 的标准溶液进行 HPLC 分析, 得到 4 种苏丹红标准溶液色谱图如图 1 所示 图 1 4 种苏丹红标准溶液液相色谱图 苏丹红 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 保留时间分别为 :4.498 min min min min

43 经由上述样品处理方法处理的辣椒粉 辣椒油 火腿肠 火锅底料及其加标样品, 经 HPLC 分析, 得到色谱图见图 2~ 图 9 图 2 辣椒粉样品的液相色谱图 图 3 辣椒油样品的液相色谱图 图 4 火腿肠样品的液相色谱图

44 图 5 火锅底料样品的液相色谱图 样品名 组分 表 2 4 种样品中苏丹红的平均加标回收率及 RSD 值 : 低浓度 (0.4mg/L) 高浓度 (4mg/L) 平均回收率 /% RSD(n=5)/% 平均回收率 /% RSD(n=5)/% 辣椒粉 苏丹红 Ⅰ 96.00% % 5.02 苏丹红 Ⅱ 95.19% % 1.42 苏丹红 Ⅲ 98.82% % 1.62 苏丹红 Ⅳ 97.16% % 3.73 辣椒油 苏丹红 Ⅰ 93.42% % 4.35 苏丹红 Ⅱ 91.67% % 8.46 苏丹红 Ⅲ % % 4.43 苏丹红 Ⅳ % % 3.83 火腿肠 苏丹红 Ⅰ 90.63% % 3.89 苏丹红 Ⅱ 87.60% % 6.1 苏丹红 Ⅲ % % 3.89 苏丹红 Ⅳ 92.68% % 8.19 火锅底 料 苏丹红 Ⅰ 99.67% % 5.53 苏丹红 Ⅱ 87.95% % 4.67 苏丹红 Ⅲ 99.02% % 5.56

45 苏丹红 Ⅳ 91.05% % 结论 Cleanert Sudan 能很好去除油脂中的杂质, 可获得稳定的苏丹红加标回收率, 样品前处理的操作过程简单, 所需耗材少 辣椒粉 辣椒油 火腿肠和火锅底料这四种不同的实验样品中 4 种苏丹红的加标回收率都较理想 6 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST2401 苏丹红 1 号 Sudan ST2402 苏丹红 2 号 Sudan ST2403 苏丹红 3 号 Sudan ST2404 苏丹红 4 号 Sudan 订货信息 订货号 产品名称 规格包装 SD5006 Cleanert Sudan 500 mg/6 ml,30/pk VA Venusil MP C18 5 μm,100å,4.6 mm 150 mm NV-15G 氮吹仪 15 位 和 AV ml 样品瓶 1.5 ml, 100/pk AV 和 AV ml 玻璃瓶 20 ml, 100/pk 和 ml 样品瓶 20 ml, 100/pk AS PTFE 滤头 0.45 μm, 直径 13 mm,200/pk AH216 正己烷 4 4 L/ 瓶 AH300 二氯甲烷 4 4 L/ 瓶 AH015-4 乙腈 4 4 L/ 瓶

46 食品中甲醛的测定 HPLC 法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10053 应用简介 国家纺织产品基本安全技术规范 GB > 中规定纺织品中甲醛含量不得大于 20 mg/kg, 对于食品, 甲醛更是非法添加物质, 啤酒和白菜规定不得人为添加, 啤酒中规定 不大于 2 mg/l 本实验采用水提取法, 最低检测限可到 1.0 mg/l, 经实验证明该方法检测效 率高, 检测限低, 适合做甲醛的检测 前言 社会上先后报道存在用甲醛溶液喷洒白菜保鲜的现象, 甲醛之所以能保鲜是能够延缓白 菜的腐烂和霉变, 其可以使蛋白质变性, 同时也能溶解脂肪, 故有杀菌和保鲜作用 此外, 甲醛还是一种重要的工业有机原料, 广泛用于合成纤维 皮革工业 医药 染料等工业等 但是甲醛是一种破坏生物细胞蛋白质的原生质毒素对人体有很大的危害 吸入甲醛可以 引起食欲减退 厌食 体重减轻 衰弱 失眠症 甲醛对中枢神经系统有麻醉作用, 此外甲 醛还能损伤细胞内的遗传物质是可疑的致癌物质 国家纺织产品基本安全技术规范 GB > 中规定纺织品中甲醛含量不得大于 20 mg/kg, 对于食品, 甲醛更是非法添加物质, 啤酒和白菜规定不得人为添加, 啤酒中规定 不大于 2 mg/l 本实验采用水提取法, 最低检测限可到 1.0 mg/l, 经实验证明该方法检测效 率高, 检测限低, 适合做甲醛的检测 1 实验试剂 a) 样品 : 市售白菜 ; 市售啤酒 b) DNPH 标准溶液 : 称取 6 mg DNPH 固体, 溶于 20 ml 乙腈, 摇匀 ; c) DNPH 衍生剂溶液 : 移取 0.3 ml DNPH 标准溶液, 用乙腈稀释至 30 ml; d) 甲醛溶液 : 分析纯, 含量 37%~40% e) 甲醛储备液 : 准确移取 38 μl 甲醛溶液, 加水稀释至 10 ml; f) 甲醛标准稀释液 : 准确移取甲醛储备液 1 ml, 加水稀释至 20 ml; 2 样品处理 2.1 白菜样品前处理 准确称取 1 g 白菜试样两份, 分别置于 60 ml 样品瓶中, 并分别加入 50 μl 和 100 μl 甲醛溶液, 混匀, 再分别加入 50 ml 水, 摇匀,40 加热提取 30 min 取 1 ml 提取液, 加 入 1 ml DNPH 衍生剂溶液, 混合均匀,60 衍生 30 min, 即为试样溶液 试样溶液通过 0.45 μm Nylon 针式过滤器过滤, 待测 2.2 啤酒样品前处理

47 移取 5 ml 啤酒试样两份, 分别置于 60 ml 样品瓶中, 并分别加入 50 μl 和 100 μl 甲醛溶液, 混匀后取出 1 ml, 加入 1 ml DNPH 衍生剂溶液, 常温衍生 30 min, 即为试样溶液 试样溶液通过 0.45 μm Nylon 针式过滤器过滤, 待测 3 实验试剂 色谱柱 :Venusil XBP C18(L)(5 μm 150Å mm); 流动相 : 乙腈 : 水 =1:1 流速 :1.0 ml/min 进样量 :10 μl 波长 :360 nm 柱温 :30 4 实验结果 4.1 线性关系和检出限量取一定量甲醛标准稀释液, 分别加水稀释至 0.4 μg/ml 0.8 μg/ml 2 μg/ml 4 μg/ml 和 8 μg/ml, 依次进样, 以浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合标准曲线方程并计算的最低检测限, 结果见表 1 表 1 甲醛标准曲线 精密度和检出限 标准曲线方程相关系数保留时间 RSD6 峰面积 RSD6 检出限 (S/N>3) y=53273x % 5.24% 1.2mg/L 4.2 添加回收率 表 2 白菜 啤酒样品的添加回收率 (50 μl,100 μl 添加水平 ) 添加水平 回收率 啤酒 白菜 50μL 94% 102% 100μL 91% 99%

48 图 1 50 μl 添加白菜样品谱图 图 2 50 μl 添加啤酒样品谱图 5 相关标准品 订货号中文名称英文名称 CAS# 1ST 甲醛 Formaldehyde

49 6 订货信息 订货号产品名称规格包装 FL-LC010GS CC-100 VX L LC-10F 高效液相色谱仪 CC-100 分析型色谱柱温箱 Venusil XBP C18(L) 液相色谱柱 10 ml/min, 梯度系统, nm 双波长检测器温控范围 :5-70 ; 可安装 1-2 支 300 mm 色谱柱 mm, 5 μm, 150Å AS 针式过滤器 (Nylon) 0.45 μm, 直径 13 mm, 200/pk AM 微孔过滤膜 (Nylon) 0.45 μm, 直径 50 mm, 100/pk ZSQ-5ML 一次性无针头注射器 5 ml, 100/pk ml 样品瓶 短螺纹透明带书写 mm, 100/pk ml 样品瓶, 样品瓶 盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔 垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk ml 样品瓶 螺纹棕色, 100/ 盒 ml 样品瓶盖 100/ 包 ml 样品瓶 螺纹棕色, 100/ 盒 ml 样品瓶盖 100/ 包 ml 样品瓶 螺纹透明, 100/ 盒 ml 样品瓶盖 100/ 盒 AH230-4 甲醇 4 4 L/ 瓶 AH015-4 乙腈 4 4 L/ 箱

50 食品中苏丹红染料的检测 Cleanert Sudan 专用柱, 升级 方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :RF10006 应用简介 GB/T 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法 中采用正己烷作为 萃取溶剂, 用氧化铝固相萃取柱净化样品 该方法样品处理过程复杂, 且氧化铝的活性不易 控制, 回收率难以得到保证 本实验利用装填具有芳香性功能基团的聚合物材料的 Cleanert Sudan 固相萃取柱萃取辣椒油 辣椒粉等食品中 4 种苏丹红, 用二氯甲烷洗脱, 开发了一套 食品中 4 种苏丹红检测的新方法, 与国标方法相比, 可获得更稳定的回收率, 溶剂用量更少 更环保, 方法也更简便 1 样品提取及净化 1.1 辣椒粉等粉状样品 称取 0.5 g ( 准确至 g) 样品于三角瓶中, 加入 5 ml 正己烷, 超声 10 min, 过滤, 将 滤液于 5000 r/min 下离心 5 min 后取上清液 3 ml, 待净化 加标样品的处理 : 向 0.5 g ( 准确 至 g) 辣椒粉中加入 2 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混标以及 4 ml 正己烷, 然后按照上述方 法进行预处理 1.2 辣椒油等油状样品 称取 0.5 g ( 准确至 g) 样品于小烧杯中, 加入 3 ml 正己烷溶解, 涡旋 1 分钟混匀, 待净化 加标样品的处理 : 向 0.5 g ( 准确至 g) 辣椒油样品中加入 1 ml 的 4 μg/ml 苏丹红 混标, 然后按照上述方法进行处理 1.3 火腿肠类样品 将火腿肠切成小丁, 称取 3.0 g ( 准确至 g), 放入 10 ml 离心管中, 加入 5 ml 正 己烷, 超声 10 min,5000 r/min 离心 5 min 后取上清液 3 ml, 待净化 加标样品的处理 : 将火腿肠切成小丁, 称取 3.0 g ( 准确至 g), 放入 10 ml 离心管 中, 加入 2 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混标以及 4 ml 正己烷, 然后按照上述方法进行处理 1.4 火锅底料等酱类样品 称取火锅底料 1.0 g ( 准确至 g), 加入 1 ml 水, 再加 5 ml 正己烷, 涡旋 3 min, 超声 10 min, 接着以转速 6000 r/min 离心 5 min, 取上层有机相 3 ml, 加入无水硫酸钠 0.5 g, 涡旋 0.5 min, 静置取上清液作为上样液 加标样品的处理 : 向 1.0 g ( 准确至 g) 火 锅底料中加入 1 ml 水, 再加 2 ml 的 4 μg/ml 苏丹红混标及 4 ml 正己烷, 然后按照上述方 法进行处理 2. 净化方法

51 净化样品所用固相萃取柱为 Cleanert Sudan 苏丹红专用柱 (500 mg/6 ml) 1. 活化 : 在 Cleanert Sudan 苏丹红专用柱中依次加入 5 ml 二氯甲烷,5 ml 正己烷 2. 萃取 : 将上述中的待净化液加入 Cleanert Sudan 柱中, 再用 1 ml 正己烷洗涤样品瓶, 一并加入 SPE 柱中, 流出液弃去 3. 淋洗 : 待上样液完全流出后, 用 3 ml 3% 异丙醇 - 正己烷溶液淋洗, 淋洗液弃去, 开启真空泵, 将小柱抽干 4. 洗脱 :3 ml 二氯甲烷洗脱, 收集洗脱液 5. 吹干与定容 : 将洗脱液于 50 下氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈溶解, 使用 0.45 μm PTFE 有机滤膜过滤后, 进行 HPLC 分析 3. 色谱条件 色谱柱 :Venusil MP C18 5 μm,100 Å, mm 流动相 : 乙腈 : 水 =97:3(v/v), 流速 :1.0 ml/min 进样量 :20 μl, 柱温 :35, 检测波长 :520 nm 4. 实验结果 液相色谱条件下, 将浓度为 4 μg/ml 的标准溶液进行 HPLC 分析, 得到 4 种苏丹红标准溶液色谱图如图 1 所示 图 1 4 种苏丹红标准溶液液相色谱图 苏丹红 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 保留时间分别为 :4.498 min min min min 经由上述样品处理方法处理的辣椒粉 辣椒油 火腿肠 火锅底料及其加标样品, 经 HPLC 分析, 得到色谱图见图 2~ 图 9

52 (a) 加标前 (b) 加标后 图 2 辣椒粉样品的液相色谱图 (a) 加标前

53 (b) 加标后 图 3 辣椒油样品的液相色谱图 结论 Cleanert Sudan 能很好去除油脂中的杂质, 针对辣椒粉 辣椒油 火腿肠和火锅底料等四种不同的样品,4 种苏丹红的加标回收率都较理想 样品前处理的操作过程简单, 所需耗材少, 更经济 环保 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST2401 苏丹红 1 号 Sudan ST2402 苏丹红 2 号 Sudan ST2403 苏丹红 3 号 Sudan ST2404 苏丹红 4 号 Sudan

54 订货信息

55 花生油中 16 种邻苯二甲酸酯的分析方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10069 前言 邻苯二甲酸酯类是指邻苯二甲酸 (Phthalate acid) 的酯化衍生物, 是塑胶工业中最为常 见的塑化剂 在日常及工业上被广泛添加于高分子塑胶产品的生产, 如聚氯乙烯 (PVC) 聚丙烯 (PP) 泡棉, 亦可添加于胶合剂 涂料 油墨中 此外应用于地毯衬垫 驱虫剂 头发喷雾剂 指甲油与火箭燃料等, 对人类健康有严重危害 人们对儿童用品中的邻苯二甲 酸酯最为重视 欧盟于 1999 年就正式作出决定, 在欧盟成员国内, 对 3 岁以下儿童使用的 与口接触的玩具 ( 如婴儿奶嘴 ) 以及其他儿童用品中邻苯二甲酸酯的含量进行严格限制 2005 年 12 月 27 日, 欧盟发布新的指令 2005/84/EC 要求 : 所有玩具及育儿物品中,DEHP DBP 及 BBP 的含量不得超过 0.1%, 所有可以放入儿童嘴中的玩具及育儿物品,DINP DIDP 及 DNOP 的含量不得超过 0.1% 实验材料 主要仪器设备 Agilent 气相色谱串连质谱仪 试剂材料 乙腈 二氯甲烷均为色谱纯 ; 正己烷为农残级 ;30% 二氯甲烷 / 正己烷溶液 : 量取 30 ml 二 氯甲烷, 用正己烷稀释至 100 ml 16 种邻苯二甲酸酯标准品 ( 纯度 99%): 正己烷溶解 ; Cleanert PSA 玻璃柱 :1 g/6 ml 样品制备样品提取 方法一 : 称取花生油样品 1 g 于 40 ml 玻璃样品瓶中, 加入 2 ml 正己烷,10 ml 乙腈, 涡 旋 2 min,4000 r/min 离心 2 min, 取上层清液转移至另一干净样品瓶中 剩余液体加入 10 ml 乙腈重复提取一次, 合并两次上清液, 于 40 氮吹至干, 加入 2 ml 正己烷溶解, 作为 待净化液 方法二 : 称取花生油样品 1 g 于 40 ml 玻璃样品瓶中, 加入 2 ml 正己烷,10 ml 乙腈, 涡 旋 2 min,4000 r/min 离心 2 min, 取上层清液转移至另一干净样品瓶中 剩余液体加入 10 ml 乙腈重复提取一次, 合并两次上清液, 于 40 氮吹至剩余 5 ml 左右, 作为待净化液 样品净化 方法一 : 将 Cleanert PSA 玻璃柱依次用 5 ml 二氯甲烷,5 ml 正己烷活化平衡, 将上述提取 方法一中的待净化液全部上样于小柱上并收集流出液, 然后用 5 ml 正己烷清洗装上样液的 样品瓶, 将洗涤液全部上于小柱上, 收集流出液, 最后用 5 ml 30% 二氯甲烷 / 正己烷溶液洗 脱小柱, 合并三次流出液, 于 40 下氮吹至近干, 正己烷定容至 1 ml, 待检测

56 方法二 : 将 Cleanert PSA 玻璃柱依次用 5 ml 二氯甲烷,5 ml 乙腈活化平衡, 将上述提取方法二中的待净化液全部上样于小柱上并收集流出液, 然后用 5 ml 乙腈清洗装上样液的样品瓶, 将洗涤液全部上于小柱上, 收集流出液, 合并两次流出液, 于 40 下氮吹至近干, 正己烷定容至 1mL, 待检测 注 : 上述操作步骤均可在 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪上完成 实验条件 色谱柱 :DA-5MS 色谱柱,30 m 0.25 mm 0.25 μm; 进样口温度 :250 ; 载气 : 氦气, 纯度 %; 流速 :1 ml/min; 电离方式 :EI 源 ; 离子源温度 :230 ; 溶剂延迟 :7 min; 进样方式 : 不分流进样 ; 样量 :1 μl; 程序升温 :50 保持 1 min, 以 20 /min 升至 220 保持 1 min, 再以 5 /min 升至 280 保持 4 min 表 1 16 种邻苯二甲酸酯类化合物定量离子及辅助定量离子 序号 中文名称 英文缩写 定量离子 辅助定量离子 1 邻苯二甲酸二甲酯 DMP 邻苯二甲酸二乙酯 DEP 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP 邻苯二甲酸二丁酯 DBP 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 DMEP 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 -2- 戊基 ) 酯 BMPP 邻苯二甲酸二 (2- 乙氧基 ) 乙酯 DEEP 邻苯二甲酸二戊酯 DPP 邻苯二甲酸二己酯 DHXP 邻苯二甲酸丁基苄基酯 BBP 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 DBEP 邻苯二甲酸二环己酯 DCHP 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 DEHP 邻苯二甲酸二苯酯 邻苯二甲酸二正辛酯 DNOP 邻苯二甲酸二壬酯 DNP

57 结果与讨论 实验结果由表 2 可知, 采用 SN/T 方法处理花生油中的邻苯二甲酸酯, 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯和邻苯二甲酸二苯酯的回收率不能满足要求, 而优化的两种前处理方法, 所有目标物的回收率均能够满足要求, 在 70% ~ 120% 之间, 方法二的回收率要比方法一的回收率稍好 峰 号 化合物 表 2 16 种邻苯二甲酸酯前处理方法加标实验结果 (n=3, 添加水平 2 mg/kg) 简称 保 时间 SN/T 留 方法一 平均回收率 /% RSD/% 平均回收率 /% RSD/% 方法二 平均回收率 /% RSD/% 1 邻苯二甲酸二甲酯 DMP 邻苯二甲酸二乙酯 DEP 邻苯二甲酸二异丁酯 DIBP 邻苯二甲酸二丁酯 DBP 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧 DMEP 基 ) 乙酯 邻苯二甲酸二 (4- 甲基 BMPP 戊基 ) 酯 邻苯二甲酸二 (2- 乙氧 DEEP 基 ) 乙酯 8 邻苯二甲酸二戊酯 DPP 邻苯二甲酸二己酯 DHXP 邻苯二甲酸丁基苄基 BBP 酯 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧 DBEP 基 ) 乙酯 12 邻苯二甲酸二环己酯 DCHP 邻苯二甲酸二 (2- 乙 DEHP 基 ) 己酯 14 邻苯二甲酸二苯酯 未检出未检出 邻苯二甲酸二正辛酯 DNOP 邻苯二甲酸二壬酯 DNP

58 图 1. 2 μg/ml 16 种邻苯二甲酸酯标准溶液色谱图 图 2. 花生油基质空白色谱图

59 图 3. 花生油基质 SN/T 方法处理 2 mg/kg 加标色谱图 图 4. 花生油基质方法一处理 2 mg/kg 加标色谱图

60 图 5. 花生油基质方法二处理 2 mg/kg 加标色谱图 结论本实验依据 SN/T , 优化出两种处理 16 种邻苯二甲酸酯的 SPE 方法, 并结合 GC/MS 对加标量为 2 mg/kg 的样品进行了测定 结果在 70% ~ 120% 之间, 且稳定性良好 方法二的回收率要优于方法一的回收率, 但是除油效果是方法一最佳 说明两种方法均可用于测定植物油中 16 种邻苯二甲酸酯的残留 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST1116 邻苯二甲酸二甲酯 Dimethyl phthalate ST1118 邻苯二甲酸二乙酯 (DEP) Diethyl phthalate ST1119 邻苯二甲酸二异丁酯 (DIBP) Diisobutyl phthalate ST1114 邻苯二甲酸二丁酯 Di-n-butyl phthalate ST1122 邻苯二甲酸二 (2- 甲氧基 ) 乙酯 Bis(2-methoxyethyl) phthalate ST1124 邻苯二甲酸双 (4- 甲基 -2- 戊 ) 酯 Bis(4-methyl-2-pentyl) Phthalate ST1123 邻苯二甲酸双 (2- 乙氧基乙 ) 酯 Bis(2-ethoxyethyl) phthalate ST1117 邻苯二甲酸二戊酯 (DPP) Di-n-pentyl phthalate ST1120 邻苯二甲酸二正己酯 (DNHP) Di-n-hexyl phthalate ST1111 邻苯二甲酸丁基苄基酯 Benzyl n-butyl phthalate ST1113 邻苯二甲酸二 (2- 丁氧基 ) 乙酯 Bis(2-butoxyethyl) phthalate ST1115 邻苯二甲酸二环己酯 Dicyclohexyl phthalate ST1125 邻苯二甲酸二 (2- 乙基 ) 己酯 Bis(2-ethylhexyl) phthalate ST1112 邻苯二甲酸二苯酯 Diphenyl phthalate

61 1ST1121 邻苯二甲酸二正辛酯 Di-n-octyl phthalate ST1126 邻苯二甲酸二壬酯 Di-n-nonyl phthalate 订货信息 订货号 名称 规格 PA0006-G Cleanert PSA 玻璃柱 1 g/6 ml,30/pk DA-5MS 30 m 0.25 mm 0.25 µm SPE-40 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪 24 位, 无本底 NV15-M 氮吹仪 15 位 ml 样品瓶 短螺纹透明带书写处 mm,100/pk ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫 45 Shore A; 1.0 mm,100/pk

62 辣椒油中罗丹明 B 的分析方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10029 应用简介 本实验采用固相萃取结合高效液相色谱的方法, 建立了辣椒油中罗丹明 B 的检测方法 样品经 20% 丙酮的正己烷溶液 (V/V) 提取,Cleanert Alumina-N 固相萃取柱净化,Venusil MP C18 色谱柱 ( mm,5 µm,100 Å) 分离, 水和甲醇为流动相进行洗脱, 外标法 进行定量 结果表明, 罗丹明 B 添加量为 0.05 mg/kg 时, 回收率在 90% ~ 100% 之间, 能够 满足检测要求 前言 罗丹明 B(Rhodamine B) 又称玫瑰红 B, 或碱性玫瑰精, 俗称花粉红, 是一种具有鲜桃红 色的人工合成的染料 经老鼠试验发现, 罗丹明 B 会引致皮下组织生肉瘤, 被怀疑是致癌物 质 罗丹明 B 在溶液中有强烈的荧光, 用作实验室中细胞荧光染色剂 有色玻璃 特色烟花 爆竹等行业 曾经用作食品添加剂, 但后来实验证明罗丹明 B 会致癌, 现在已不允许用作食 品染色 因此通过有效的实验技术手段, 对辣椒油中的有关罗丹明 B 残留进行监控, 以确保消 费者对辣椒油消费的安全具有重要意义 本实验通过优化前处理方法建立了罗丹明 B 在辣椒油中的高效液相色谱的检测方法 实验部分 仪器 试剂与材料主要仪器设备 高效液相色谱仪 ( 紫外检测器 ); 博纳艾杰尔 12 位负压 SPE 装置 试剂材料 丙酮 甲醇 正己烷为色谱纯 ; 实验用水为超纯水 ; 罗丹明 B 标准品 ( 纯度 99%); 一次性无菌注射器 ;Nylon 针式过滤器 (0.45 µm, 直径 13 mm); Cleanert Alumina-N 固相萃取柱 :2000 mg/6 ml 样品制备样品提取 称取 1 g 辣椒油于 40 ml 玻璃瓶中, 加入 10 ml 20% 丙酮的正己烷溶液 (V/V), 振荡摇 匀后待净化 样品净化 先将小柱用 6 ml 正己烷活化平衡, 然后将待净化液过柱, 弃去全部流出液, 然后用 10 ml 20% 丙酮的正己烷溶液 (V/V) 进行淋洗, 最后用 10 ml 2% 氨化甲醇 (V/V) 洗脱 收

63 集洗脱液于 40 氮气吹干, 用 1 ml 甲醇溶解残留物, 过 0.45 µm Nylon 针式过滤器后待测 以上净化步骤可用卓睿全自动固相萃取仪完成 实验条件 液相条件色谱柱 :Venusil MP C18,5 µm,100 Å, mm 流动相 : 甲醇..水 = (V/V) 柱温 :30 进样量 :20 µl 检测波长 :550 nm 结果与讨论 实验结果由表 1 可知, 采用固相萃取结合液相色谱法检测罗丹明 B, 辣椒油基质加标回收率在 90% 以上, 能够满足标准要求 表 1. 辣椒油中罗丹明 B 加标回收实验结果 物质名称保留时间添加水平 /mg/kg 平均回收率 /% RSD/% 罗丹明 B 图 µg/ml 罗丹明 B 标准溶液液相色谱图

64 图 2. 辣椒油基质空白液相色谱图 图 mg/kg 辣椒油基质加标液相色谱图 结论 本实验建立了辣椒油中罗丹明 B 残留量的检测方法, 并结合高效液相色谱对辣椒油中 罗丹明 B 的含量进行了测定 对于加标量为 0.05 mg/kg 的辣椒油样品, 回收率在 90% ~ 100% 之间, 符合实验要求 相关标准品 订货号中文名称英文名称 CAS# 1ST2432 罗丹明 B Rhodamine B chloride

65 附 : 相关产品 订货号 产品名称 规格描述 包装数量 VA Venusil MP C18 5 µm,100 Å, mm 1 支 AL20006N Cleanert Alumina-N 2000 mg/6 ml 30 支 / 包 SPE-40 Qdaura 卓睿全自动固相萃取系统 4 通道 1 台 NV15-M 15 位氮吹仪 15 位 1 台 SH-100 保护柱套 适用于 mm 和 mm 1 支 VA S 直联式保护柱芯 5 µm,100 Å; mm 4 支 / 包 ml 样品瓶 短螺纹透明带书写处 mm 100/pk ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫 45 Shore A; 1.0 mm 100/pk AS Nylon 针式过滤器 单膜,13 mm,0.45 µm 200 个 / 包 LZSQ-2ML 一次性注射器 2 ml 无针头 100 支 / 包

66 鸭血中苏丹红的分析方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10120 应用简介 本实验建立了鸭血中苏丹红的前处理方法, 采用 Cleanert Sudan 小柱结合液相色谱的 检测方法, 对鸭血中的苏丹红进行了测定 样品经正己烷提取,Cleanert Sudan 小柱净化, 二氯甲烷洗脱, 以 97% 的乙腈水溶液为流动相,Venusil MP C18(5 µm,100 Å, mm) 色谱柱进行检测, 外标法定量 结果表明, 当苏丹红加标量为 12 mg/kg 时, 回收率在 85% ~ 95% 之间, 能够满足检测要求 前言 苏丹红是一种化学染色剂, 并非食品添加剂 它的化学成份中含有一种叫萘的化合物, 该物质具有偶氮结构, 由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性, 对人体的肝肾器官具 有明显的毒性作用 苏丹红属于化工染色剂, 主要是用于石油 机油和其他的一些工业溶剂 中, 目的是使其增色, 也用于鞋 地板等的增光, 又名 苏丹 苏丹红共分为苏丹红 I 苏 丹红 Ⅱ 苏丹红 Ⅲ 和苏丹红 Ⅳ, 为亲脂性偶氮染料, 由于用苏丹红染色后的食品颜色非常鲜 艳且不易褪色, 能引起人们强烈的食欲, 一些不法食品企业把苏丹红添加到食品中 常见的 添加苏丹红的食品有辣椒粉 辣椒油 红豆腐, 红心禽蛋等 1995 年欧盟 (EU) 等国家已禁止 其作为色素在食品中进行添加, 对此我国也明文禁止 本文建立了鸭血中苏丹红残留量的前 处理方法, 回收率能够满足检测要求, 且方法简单 稳定 实验部分 仪器 试剂与材料 主要仪器设备 Agilent 1100 液相色谱仪 ; 卓睿全自动固相萃取仪 试剂材料 正己烷 二氯甲烷 异丙醇 乙腈均为色谱纯 ; 实验用水为超纯水 ; 四种苏丹红混合标准溶液 : 正己烷溶解 ; Cleanert Sudan 固相萃取小柱 :500 mg/6 ml 样品制备 样品提取 称取均质好的鸭血样品 1 g, 置于 50 ml 离心管中, 加入 1 ml 水, 再加入 5 ml 正己 烷, 涡旋 3 min, 超声提取 10 min, 以 8000 r/min 离心 10 min, 取上层有机相 3 ml, 加入无 水硫酸钠 0.5 g, 涡旋 0.5 min, 静置, 取上层清液作为待净化液 样品净化

67 将 Cleanert Sudan 小柱依次用 5 ml 二氯甲烷,5 ml 正己烷活化平衡, 将上述待净化 液全部上样于小柱上, 再用 1 ml 正己烷洗涤装待净化液的容器, 全部上样于小柱上, 弃去 流出液, 用 3 ml 3% 异丙醇 / 正己烷 (V/V) 溶液洗涤小柱, 弃去流出液, 将小柱抽干, 再用 3 ml 二氯甲烷洗脱小柱, 收集流出液, 于 40 下氮吹至干, 用乙腈定容至 1 ml, 过 PTFE 针式过滤器, 待检测 以上净化步骤可用卓睿全自动固相萃取仪完成 实验条件色谱条件 色谱柱 :Venusil MP C18,5 µm,100 Å, mm; 流动相 :97% 乙腈水 (V/V); 柱温 :35 ; 进样量 :20 µl; 流速 :1 ml/min; 波长 :520 nm 结果与讨论 实验结果 由表 1 可知, 采用 SPE 结合液相色谱的方法检测鸭血中 4 种苏丹红, 加标回收率在 85% ~ 95% 之间, 能够满足检测要求 由图 1 ~ 图 3 可知, 用 Venusil MP C18 色谱柱检测 4 种苏 丹红, 分离度和峰形良好, 且保留时间稳定 表 1. 鸭血中苏丹红加标回收实验结果 ( 添加水平 12 mg/kg) 物质名称 保留时间 /min 平均回收率 /% 变异系数 /% 苏丹红 I 苏丹红 II 苏丹红 III 苏丹红 IV

68 实验谱图

69 结论 本实验建立了鸭血中苏丹红的前处理方法, 并结合液相色谱对加标量为 12 mg/kg 的样品进行了检测 实验结果表明, 对于加标量为 12 mg/kg 的样品, 四种苏丹红的回收率均在 85% ~ 95% 之间, 且变异系数小于 10%, 能够满足检测要求 说明 Cleanert Sudan 小柱可以用于鸭血中苏丹红的检测, 且稳定性良好 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST2401 苏丹红 1 号 Sudan ST2402 苏丹红 2 号 Sudan ST2403 苏丹红 3 号 Sudan ST2404 苏丹红 4 号 Sudan 附 : 相关产品 订货号 产品名称 规格描述 包装数量 SD5006 Cleanert Sudan 500 mg/6 ml 30 支 / 包 VA Venusil MP C18 5 µm,100 Å, mm 1 支 SH-100 保护柱套 适用于 mm 和 mm 1 支 VA S 直联式保护柱芯 5 µm,150 Å; mm 4 支 / 包 SPE-40 卓睿全自动固相萃取仪 4 通道,24 位 1 台 ml 样品瓶 短螺纹透明带书写处 mm 100/pk NV15-M 氮吹仪 15 位 1 台 ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫 45 Shore A; 1.0 mm 100/pk AS PTFE 针式过滤器 单膜,13 mm,0.45 µm 200 个 / 包 LZSQ-2ML 一次性注射器 2 ml 无针头 100 支 / 包

70 婴幼儿奶粉中双氰胺的分析方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10045 前言 北京时间 1 月 25 日凌晨消息, 新西兰牛奶中发现了有害物质 双氰胺 双氰胺又名二氰二胺, 缩写 DICY 或 DCD 虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量, 但高剂量的双氰胺对人体是有毒的 针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点, 本方法加大了净化材料的用量, 以获得了更好的净化效果 采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的 Cleanert MAS-QuChERS- 双氰胺净化管 (500 mg/15 ml, 货号 :MS-SQA02) 和 Venusil HILIC 液相色谱柱, 建立了奶粉中双氰胺的 MAS- QuEChERS 快速前处理方法和 LC-UV 以及 LC-MS/MS 检测方法 1 实验部分 1.1 仪器 试剂与材料高效液相色谱仪, 涡旋振荡器, 超声波清洗机, 氮吹仪 双氰胺标准品 (CAS: ;FW=84.08), 新一代 Cleanert MAS-QuChERS- 双氰胺净化管,Venusil HILIC 液相色谱柱, 微孔滤膜, 乙酸铵 乙酸 乙腈为色谱纯, 实验用水为超纯水 样品 : 新西兰婴儿配方奶粉 (0~6 个月 ) 表 1 双氰胺的信息 名称结构式分子量 CAS 双氰胺 实验步骤 称取 1 g 试样于 50 ml 具塞离心管中, 加 2 ml 水, 涡旋 30 s, 加 2 ml 乙腈涡旋 30 s 再往现有的提取液中加 2 ml 乙腈, 重复上述提取步骤 再将该提取步骤重复 2 次, 得到共 计约 10 ml 的提取液 以 4000 r/min 离心 5 min, 将全部上清液加入新一代 Cleanert MAS- QuChERS 管中 (500 mg/15 ml), 将 MAS 管上下晃动 30 s, 然后涡旋 30 s 后,8000 r/min 离心 5 min, 取全部上清液 ( 约 10 ml) 于玻璃试管中,50 下氮气吹干, 加入 1 ml 乙腈 - 水混合溶液 (97:3) 复溶, 过 0.22 μm 微孔滤膜, 待测 注 :1. 做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂, 防止加标瞬间发生蛋白沉淀 ;

71 2. 乙腈提取分 4 次, 为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快, 影响提取效果 ; 3. 净化液氮气吹干后, 如发现有少量油脂, 可采用 1 ml 乙腈 : 水 (97:3) 混合溶液复溶, 之后加入 1 ml 正己烷 ( 色谱纯 ) 液液萃取, 取下层溶液过 0.22 μm 微孔滤膜, 进样检测 1.3 实验条件 高效液相色谱法 (HPLC 法 ): 色谱柱 :Venusil HILIC(5 μm,100 Å, mm); 流动相 : 10 mmol/l 乙酸铵 (ph=4.0): 乙腈 =15: 85; 波长 :220 nm; 进样量 :10 μl; 柱温 :30 ; 流速 :0.8 ml/min LC-MS/MS 法 : (1) 色谱条件 : 色谱柱 :Venusil HILIC( 5 μm,100 Å, mm); 流动相 :A:0.5 mmol/l 乙酸铵 (ph=4.0) B: 乙腈 ; 进样量 :10 μl; 柱温 :30 ; 流速 :0.3 ml/min 表 2 流动相梯度程序 时间,min A% B% * 备注 : 本文曾尝试过多种 C18 色谱柱, 对双氰胺没有保留, 需要使用离子对试剂, 但是无 法用于 LC-MS/MS; 也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱, 但是得到双氰胺的峰面积偏差较

72 大, 分析原因是其具有阳离子交换基团, 对双氰胺有不稳定的死吸附 最后确定使用键合丙基酰胺的 Venusil HILIC 柱, 以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留 (2) 质谱条件 : 质谱仪 :AB SCIEX API 4000+; 离子源 : 电喷雾离子源 ; 扫描方式 : 正离子扫描 ; 检测方式 : 多反应监测 ;CAD:8.00;CUR:20.00;GS1:60.00;GS2:50.00;IS: ; TEM: 表 3 双氰胺质谱信息 药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP 双氰胺 85.1/ / 注 : 带 的监测离子对为定量离子对 2 结果与讨论 2.1 高效液相色谱法 双氰胺的液相色谱图 实际样品基质加标的线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 作为标准贮备液 ; 分别称取 1g 奶粉试样, 添加一定量标准溶液, 配制成含双氰胺为 0.5μg/g,1μg/g, 2μg/g,5.0μg/mL 和 10μg/g 的添加样品, 按照上述提取 净化方法操作, 所得净化液按照上述色谱条件, 依次进样检测 以双氰胺含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见表 4:

73 表 4 双氰胺线性方程和定量限 (HPLC 法 ) 名称保留时间线性方程相关系数最低定量限 (S/N=10) 双氰胺 5.57min Y=108.16X µg/g 准确度和精密度 选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样, 进行添加回收实验, 结果见表 5 表 μg/g 添加回收实验结果 (HPLC 法 ) 平行 1 平行 2 平行 3 平均值 RSD 82.3% 85.5% 89.1% 85.63% 3.97%

74 2.2 LC-MS/MS 法 双氰胺的 LC-MS/MS 图 图 4 双氰胺 10 ng/ml 标准溶液质谱图 实际样品基质加标的线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 ml 容量瓶中, 加水溶液并稀释至刻度, 作为标准贮备液 ; 分别称取 1 g 奶粉试样, 添加一定量标准溶液, 配制成含双氰胺为 5 ng/ml,10 ng/ml,50 ng/ml,100 ng/ml 和 200 ng/ml 的添加样品, 按照上述提取 净化方法操作, 所得净化液按照上述液质条件, 依次进样检测 以双氰胺含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见表 6: 表 6 双氰胺线性方程和定量限 (LC-MS/MS 法 ) 名称保留时间线性方程相关系数最低定量限 (S/N=10) 双氰胺 3.15min Y=3859.1X ng/g 准确度和精密度选取市售某婴幼儿奶粉试样, 进行添加回收实验, 结果见表 7 采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响 空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液, 双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化, 故判断该方法无基质效应的影响 表 7 10 ng/g 添加回收实验结果 平行 1 平行 2 平行 3 平均值 RSD 82.5% 83.5% 89.3% 85.2% 4.31%

75 图 7 婴幼儿奶粉空白质谱图 3. 相关标准品 订货信息中文名称英文名称 CAS# 1ST6601 ( 双氰胺 ) 二聚氰胺 Dicyanodiamide 订货指南 货号产品名称规格型号 MS-SQA02 新一代 MAS-QuChERS- 双氰胺净化管 ( 填料量加大, 更适合婴幼儿奶粉等复杂样品 ) 500 mg/15 ml,50 支 / 包 MS-SQA01 MAS-QuChERS- 双氰胺净化管 100 mg/2 ml,50 支 / 包 VH VH Venusil HILIC 液相色谱柱 mm,5 μm,100 Å mm,5 μm,100 Å AS 针式过滤器 0.22 μm, 直径 13 mm, 200/Pk DCD-0001 双氰胺对照品 500 mg / 瓶, 含量 99.0%

76 DCD g / 瓶, 含量 99.0% LXG0050 离心管 50 ml, 带螺纹盖,25 个 / 包 ZSQ-5ML 一次性注射器 5 ml,100/pk NV15-M 15 位氮吹仪 15 位

77 乳制品中 L- 羟脯氨酸的测定方法学验证 2,4- 二硝基氟苯法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10093 应用简介 本实验采用高效液相色谱 (HPLC) 法结合紫外检测器, 使用 Venusil AA 氨基酸专用分 析柱, 以 1% 的 2,4- 二硝基氟苯乙腈溶液为柱前衍生剂, 运用外标法, 对部分市售乳制品中 的 L- 羟脯氨酸进行测试 实验结果表明, 在波长 360 nm,0.02mol/l 磷酸盐缓冲液与乙腈 甲醇为流动相, 于 1.0 ml/min 流速梯度洗脱下,L- 羟脯氨酸线性范围为 mg/l, 相关系数大于 0.999, 平均回收率在 % 之间, 平行样品的相对标准偏差小于 6.0%, 方 法检出限为 0.8 mg/kg 本方法的灵敏度 准确度和精密度较好, 适用于乳制品中 L- 羟脯氨 酸的检测 前言 皮革奶, 是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品, 加入到乳制品中的目的是提高产品蛋白 含量 皮革水解蛋白本身对人体无害, 但由于皮革水解蛋白中混进了大量皮革糅制 染色过 程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质, 长期服用会导致重金属中毒 L- 羟脯氨酸 是胶原蛋白 ( 皮革水解蛋白 ) 特征性成份之一, 而乳制品中的乳蛋白中不存在, 故将 L- 羟脯氨 酸的检测作为判定乳及乳制品中是否含有水解蛋白的依据 本实验采用 2,4- 二硝基氟苯作为衍生剂, 使用 Venusil AA 氨基酸分析专用柱对 5 种市 售乳制品中的 L- 羟脯氨酸进行测试 实验部分 仪器 试剂与材料 主要仪器设备 Agilent 1100 高效液相色谱仪 Agela Technology 15 位干式电模块氮吹仪 ; 试剂材料 色谱柱 :Venusil AA;5 μm; mm; L- 羟脯氨酸标准品 : 白色晶体, 纯度 98%; 2,4- 二硝基氟苯 : 购自 Sigma 公司 ; 屈臣氏蒸馏水 ; 甲醇 乙腈为色谱纯 ; 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 四水合硼酸钠 苯酚 浓盐酸均为分析纯 ; 水解液 :6.0 mol/l 盐酸溶液 ( 含 1% 苯酚 ); 稀盐酸 :0.1 mol/l 盐酸 ; 0.02mol/L 磷酸盐缓冲液 : 称取 2.72g 磷酸二氢钾与 4.56g 磷酸氢二钾, 加 1000mL 水溶解, 即得 ; 硼酸盐水溶液 : 准确称取 1.91 g 四水合硼酸钠, 加 50 ml 水溶解, 混匀 ; 2,4- 二硝基氟苯溶液 :1% 的 2,4- 二硝基氟苯乙腈溶液 ;

78 标准储备液 : 准确称取 10 mg 标准品于 10 ml 容量瓶中, 用 0.1 mol/l 盐酸溶解并定容至刻度, 即得 ; 标准工作液 : 用 0.1mol/L 盐酸稀释标准储备液至 100 μg/ml; 测试对象 : 市售牛奶 乳品饮料 奶粉 原味酸奶及大果粒酸奶 样品处理样品水解准确称取样品 1.0 g( 奶粉样品称取 0.2 g) 样品, 置于 12 ml 棕色蛋白水解瓶中, 加入 8 ml 水解液, 振摇使样品均匀分散于溶液中, 然后将水解管置 110 ± 1 烘箱中水解 24 小时, 取出冷却, 打开水解管, 将水解液全部转移至 20 ml 试管中, 用 0.1 mol/l 盐酸定容到刻度, 混匀, 过滤, 取续滤液, 作为衍生用样品溶液 样品衍生准确量取衍生用样品溶液 1.0 ml, 置一玻璃管中, 至氮吹仪中以 50 氮吹至干, 残渣加 1.0 ml 稀盐酸复溶, 混匀, 量取 0.5 ml 置于 5.0 ml 棕色瓶中, 加入 0.5mL 硼酸钠溶液,2,4 二硝基氟苯乙腈溶液 0.5 ml, 摇匀, 于 60 烘箱中加热 1 h, 将试管于冷水浴中冷却, 用 0.02 mol/l 的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠混合溶液定容至 2.0 ml L- 羟脯氨酸标准曲线的绘制用 L- 羟脯氨酸标准工作液分别制成 μg/ml 的系列浓度标准溶液, 采用上述衍生方法, 使用外标法定量, 绘制标准曲线 色谱条件色谱柱 :Venusil AA;5 μm; mm; 流速 :1.0 ml/min; 柱温 :30 ; 波长 :360 nm; 进样量 :20 μl; 流动相 A:0.02 mol/l 磷酸盐缓冲液 ; 流动相 B: 乙腈..甲醇 =1.. 1(v/v); 梯度 : 表 1. 梯度洗脱程序 时间 /min A/% B/%

79 结果与讨论 方法学考察标准曲线及检出限按照上述色谱条件, 分别对 L- 羟脯氨酸系列标准溶液进样测试,L- 羟脯氨酸在浓度 mg/L 范围内有较好的线性关系, 回归方程为 y=35.962x ; 相关系数为 , 检出限 (S/N=3) 为 0.8 mg/kg 方法的精密度与回收率精密度实验在上述色谱条件下, 使用 0.25 μg/ml 标准溶液连续进样 6 次对仪器精密度进行测试, 实验结果表明方法重复性好, 结果见下表 2 表 2. 重复性试验数据 保留时间 /min 峰面积 平均值 SD RSD/% 市售乳制品检测及加标回收实验按上述的处理方法, 对 5 种市售乳制品 ( 牛奶 乳品饮料 奶粉 原味酸奶及大果粒酸奶 ) 分别进行加标实验, 并计算回收率, 加标浓度及回收率结果见表 3,L- 羟脯氨酸的加标平均回收率在 % 之间, 相对标准偏差小于 6%, 方法的回收率较好 表 3. 市售乳制品中 L- 羟脯氨酸的相关回收率 市售乳制品加标浓度 (mg/kg) 平均回收率 /% RSD/% 奶粉 牛奶 乳品饮料 酸奶 大果粒酸奶

80 图 2. 标准溶液 1.25 μg/ml 高效液相色谱图 ( 纵坐标局部放大图 )

81

82

83 结论根据实验结果, 采用 Venusil AA 氨基酸分析专用柱, 以 2,4- 二硝基氟苯为衍生试剂测试乳制品中的 L- 羟脯氨酸, 方法灵敏度高 重现性好, 可用于判定乳制品中是否添加皮革水解蛋白 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST1427 L- 羟基脯氨酸 trans-4-hydroxy-l-proline 附 : 相关产品 订货号 产品名称 规格描述 包装数量 AA Venusil AA 氨基酸分析专用柱 mm,5 μm ml 螺纹棕色样品瓶 66*18.5 mm 100/PK AV ml 棕色样品瓶 短螺纹棕色 ; 带书写处 mm 100/PK ml 样品瓶盖 9 mm 中心孔蓝盖, 红色橡胶 / 米色 PTFE 隔垫 45 Shore A;1.0 mm 100/PK AS T 微孔滤膜 单膜,13 mm,0.45 μm 100 个 / 包 LZSQ-2ML 一次性注射器 2 ml 无针头 100 支 / 包 AH230-4 甲醇 4 L/ 瓶, 色谱纯 4 4 L/ 箱 AH015-4 乙腈 4 L/ 瓶, 色谱纯 4 4 L/ 箱

84 辣椒油中罗丹明 B 的检测方法高效液相色谱法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF 样品制备 1.1 辣椒油空白样称取不含罗丹明的辣椒油 1 g, 加入 10mL 含 20% 丙酮的正己烷, 振荡 2 分钟, 混合均匀后, 用移液管将上清液取出 1.2 添加样向 1 g 辣椒油中添加 1 ml 5 ppm 罗丹明标准品 ( 溶于正己烷 ), 其他步骤和空白样相同 2 SPE 净化 SPE 柱 :Cleanert Alumina-N(2 g/6 ml), P/N:AL20006-N 活化 :6 ml 正己烷上样 : 全部上清液淋洗 :10 ml 20% 丙酮正己烷洗脱 : 用 10 ml2% 氨水甲醇 (0.2 ml 浓氨水 +9.8 ml 甲醇 ) 过柱, 收集浓缩与定容 : 将收集液用氮气吹干, 用 1 ml 甲醇定容, 上样 3 液相色谱条件 色谱柱 :Venusil MP C18(4.6*150 mm,5 μm),p/n: VA 流动相 : 75% 甲醇水溶液进样量 :5 ul; 流速 :1 ml/min; 波长 :550 nm 4 实验结果 图 1 罗丹明标准品色谱图

85 表 1 罗丹明标样和加标样的回收率 标品 1 标品 2 油样 1 油样 2 峰面积 回收率 (%) 相关标准品 订货号中文名称英文名称 CAS# 1ST2432 罗丹明 B Rhodamine B chloride

86 (GB/T ) 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 案例来源 : 博纳艾杰尔 ; 应用编号 :AF10019 执行标准 GB/T 原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法 液相色谱检测方法 液相色谱检测方法 1. 样品前处理 称取 2 g 试样于 50 ml 具塞离心管中, 加入 15 ml 三氯乙酸溶液 5 ml 乙腈溶液和 5% 醋酸铅溶液 ( 质量比 ) 2mL, 超声提取 10 min, 再震荡提取 10 min 后, 以 5000 r/min 离心 10 min 上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后, 用三氯乙酸溶液定容到 25 ml, 移取 5 ml 滤液, 加入 5 ml 水混合均匀后, 全部上样 净化处理 Cleanert PCX 60mg/3mL 活化 :5 ml 甲醇 5 ml 水依次活化固相萃取小柱 ; 上样 : 将全部待净化液以 1 ml/min 的流速通过固相萃取小柱 ; 淋洗 : 依次用 3 ml 水和 3 ml 甲醇淋洗固相萃取小柱, 淋洗完毕后, 抽至近干 ; 洗脱 : 用 6 ml 5% 氨化甲醇 (v/v) (5% 氨化甲醇 :5 ml 氨水 + 95 ml 甲醇 ) 溶液以 1 ml/min 洗脱固相萃取小柱并收集, 洗脱液于 50 下氮气吹干, 残渣用 1 ml 流动相定容, 涡旋混合 1min,0.45 μm 尼龙针式过滤器过滤 ( 以上净化操作通过 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪完成 ) 2. 色谱条件 色谱柱 :Venusil XBP C8(L);250 mm 4.6 mm,5 μm; 流动相 : 缓冲盐溶液 : 乙腈 = 85:15; 紫外检测器波长 :240 nm; 流速 :1.0 ml/min; 进样量 :10 μl; 缓冲盐配制 : 准确称柠檬酸 2.10 g 和辛烷磺酸钠 2.16 g, 加入约 980 ml 水溶解, 调节 ph 到 3.0 后, 定容至 1 L;

87 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 (LC-MS/MS) 1. 样品前处理 称取 1 g 试样于 50 ml 具塞离心管中, 加入 8 ml 三氯乙酸溶液 2 ml 乙腈溶液和 5% 醋酸铅溶液 ( 质量比 ) 2 ml, 超声提取 10 min, 再震荡提取 10 min 后, 以 5000 r/min 离心 10 min 上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后, 做待净化液 净化处理 Cleanert PCX 60 mg/3 ml 活化 :5 ml 甲醇 5 ml 水依次活化固相萃取小柱 ; 上样 : 将全部待净化液以 1 ml/min 的流速通过固相萃取小柱 ; 淋洗 : 依次用 3 ml 水和 3 ml 甲醇淋洗固相萃取小柱, 淋洗完毕后, 抽至近干 ; 洗脱 : 用 6 ml 5% 氨化甲醇 (v/v) (5% 氨化甲醇 :5 ml 氨水 + 95 ml 甲醇 ) 溶液以 1 ml/min

88 洗脱固相萃取小柱并收集, 洗脱液于 50 下氮气吹干, 残渣用 1 ml 流动相定容, 涡旋混合 1min,0.45 μm 尼龙针式过滤器过滤 ( 以上净化操作通过 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪完成 ) 2. 色谱条件 色谱柱 : Venusil AS-T C mm,5 μm 流动相 :10 mm 乙酸铵 ( 用乙酸调 ph 3.0): 乙腈 = 50:50 流速 :0.2 ml/min 进样量 :10 μl 质谱条件 : 正离子模式, 离子喷雾电压 :4 KV; 雾化器 : 氮气,40 psi; 干燥气 : 氮气 ; 流速 :10 ml/min; 温度 :35 ; 裂解电压 :100 V; 用 Venusil HILIC 还可以将三聚氰胺及其手性异构体和其类似物 : 三聚氰酸二酰胺 三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸分开, 实验条件如下 : 色谱柱 : Venusil HILIC mm, 5 μm 流动相 :10 mm 甲酸铵缓冲盐溶液 (ph 3.5): 乙腈 = 12:88 流速 :1 ml/min 进样量 : 20 μl 质谱条件 :

89 (A) 三聚氰酸 (B)13C3- 三聚氰酸 (C) 三聚氰胺 (D)15N3- 三聚氰胺 (E) 三聚氰酸一酞胺 (F) 三聚氰酸二酞胺 气相色谱 - 质谱联用法 (GC-MS 和 GC-MS/MS) 1. 样品前处理 称取 5 g 试样于 50 ml 具塞比色管中, 加入 25 ml 三氯乙酸溶液, 涡旋震荡 30 s, 再加 入 15 ml 三氯乙酸溶液, 超声提取 15 min,, 加入 2 ml 乙酸铅溶液, 用三氯乙酸溶液定容到 刻度 充分混合后转移上层溶液约 30 ml 到 50 ml 离心管中, 以 5000 r/min 离心 10 min 上清液待净化 净化处理 Cleanert PCX 60mg/3mL 活化 :5 ml 甲醇 5 ml 水依次活化固相萃取小柱 ; 上样 : 取 5 ml 待净化液以 1 ml/min 的流速通过固相萃取小柱 ; 淋洗 : 依次用 3 ml 水和 3 ml 甲醇淋洗固相萃取小柱, 淋洗完毕后, 抽至近干 ; 洗脱 : 用 6 ml 5% 氨化甲醇 (v/v) (5% 氨化甲醇 :5 ml 氨水 + 95 ml 甲醇 ) 溶液以 1 ml/min, 洗脱液于 50 下氮气吹干, 残渣用 1 ml 流动相定容, 涡旋混合 1 min,0.45 μm 过滤 ( 以上净化操作通过 Qdaura 卓睿全自动固相萃取仪完成 ) 2. 色谱条件 色谱柱 :DA-50+ 5% 苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管

90 色谱柱, mm,0.25 μm; 流速 :10 ml/min; 升温程序 :70 保持 1 min, 以 10 /min 的速率升温至 200, 保持 10 min; 传输线温度 :280 ; 进样口温度 :250 ; 进样方式 : 不分流进样 ; 进样量 :1 μl; 电离方式 : 电子轰击电离 (EI) 电离能量 :70 ev; 离子源温度 :230 扫描模式 : 选择离子扫描, 定性离子 m/z , 定量离子 m/z 327; 3. 注意事项 处理不同的样品, 离心的效果是不同的, 有时离心后上清液仍然浑浊, 若直接上样会导致固相萃取柱堵塞, 这时可以适当的提高离心的转速或离心的时间, 如果还不能解决该问题, 可以用滤纸先过滤一下上清液再用固相萃取柱处理样品 样品处理过程中注意交叉污染, 影响检测结果 在做三聚氰胺的重复性实验中, 注意取样和最终的定量 定容的准确性 相关标准品 订货号 中文名称 英文名称 CAS# 1ST6602 三聚氰胺 Melamine 订货信息