第 2 期程欲, 等 : 尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化 253 -D- 半乳糖苷 (IPTG) 酵母提取物及胰蛋白栋为 Sigma 公司产品 ;DEAE650M His 纯化介质填料 (His 镍柱 ) 购自 QIAGEN 公司. 1.3 表达载体的构建根据 acutobin 基因

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旧漂葛
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1 第 41 卷第 2 期 2013 年 4 月 JournalofFuzhouUniversity(NaturalScienceEdition) Vol.41No.2 Apr.2013 DOI: /isn 文章编号 : (2013) 尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化程欲, 缪少锋, 李仁宽, 陈菁, 刘树滔, 饶平凡 ( 福州大学生物工程研究所, 福建福州 ) 摘要 : 将尖吻蝮蛇类凝血酶基因克隆到载体 pet32a(+) 上, 在大肠杆菌 Roseta2(DE3) 中表达 N 端融合了硫氧还原蛋白的类凝血酶. 通过 SDS-PAGE 检测融合蛋白条带, 纤维蛋白原凝结实验检测酶学活性. 确定表达菌株后, 对其诱导条件进行优化, 在 30 诱导 3h, 诱导剂 IPTG 浓度为 0.5mmol L -1 条件下类凝血酶表达水平最高. 关键词 : 类凝血酶 ;acutobin; 原核表达 ; 尖吻蝮蛇中图分类号 :Q78 文献标识码 :A Prokaryoticexpresionandoptimizationofathrombin-like enzymefrom deinagkistrodonacutusine.coli CHENGYu,MIAOShao-feng,LIRen-kuan,CHENJing,LIUShu-tao,RAOPing-fan (InstituteofBiotechnology,FuzhouUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China) Abstract:Inthisarticle,thegeneofsnakevenom thrombin-likeenzymefrom deinagkistrodon acutus,acutobin,wasclonedintoexpresionvectorpet32a(+).theenzymefusedwiththioredoxin asitsn-terminalpartwasexpresedine.coliroseta2(de3)underthecontrolof30 with0.5 mmol L -1 IPTGfor3hours.SDS-PAGEwasusedtoconfirmthepurityoftargetprotein.Ahigher bioactivityofpurifiedproductswasshownbyfibrinogen-clotinganalysis. Keywords:thrombin-likeenzyme;acutobin;prokaryoticexpresion;deinagkistrodonacutus 类凝血酶 (thrombin-likeenzyme) 是一种丝氨酸蛋白酶, 属于胰蛋白酶家族. 来源于蛇毒的类凝血酶, 主要存在于蝮亚科和蝰亚科蛇毒中, 具有去纤抗凝改善微循环等作用 [1]. 蛇毒类凝血酶不激活体内凝血因子 [2-3], 从纤维蛋白原 N 端释放纤维蛋白肽, 生成侧链不交联的纤维蛋白产物, 而后被网状内皮系统或正常纤溶系统清除 [4], 具有巨大的应用价值. 然而, 目前已商品化的类凝血酶制剂主要来源于天然蛇毒, 对纯化要求较高, 若杂质痕量残留可能引发强烈地副作用, 甚至死亡. 其次, 相关的动物保护法规也极大限制了试剂的产量. 供求关系的不平衡促使人们转变思路, 寻求采用现代生产技术打破来源和规模化生产工艺的瓶颈. 因此, 利用基因工程手段表达生产蛇毒类凝血酶成为近期研究的重点 [5]. 本研究选取机理研究较为透彻的大肠杆菌 Roseta2(DE3) 菌株, 在 N 端融合硫氧还原蛋白维持细胞内二硫键 [6], 并添加组氨酸标签利于后续分离纯化的方式构建表达尖吻蝮蛇类凝血酶 acutobin 基因的重组菌株, 为进一步研究该酶理化性质及其规模化生产奠定基础. 1 材料与方法 1.1 菌株和质粒大肠杆菌 Roseta2(DE3) 及表达载体 pet32a(+) 购自 Novagen 公司, 编码 acutobin 基因由福州大学生物工程研究所保存. 1.2 仪器与试剂 TaqDNA 聚合酶 T4DNA 连接酶限制性内切酶 SacⅠ 和 NotⅠ 均购自 TaKaRa 公司 ; 异丙基硫代 -β 收稿日期 : 通讯作者 : 刘树滔 (1970-), 教授, stliu@fzu.edu.cn

2 第 2 期程欲, 等 : 尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化 253 -D- 半乳糖苷 (IPTG) 酵母提取物及胰蛋白栋为 Sigma 公司产品 ;DEAE650M His 纯化介质填料 (His 镍柱 ) 购自 QIAGEN 公司. 1.3 表达载体的构建根据 acutobin 基因序列设计上下游引物. 上游引物 :5 -GAGCTCGTCATTGGAGGTGTTGAATGTGAC -3 ( 下划线为 SacⅠ 酶切位点 ); 下游引物 :5 -GCGGCCGCTCATTATGGGGGGCAG-3'( 下划线为 NotⅠ 酶切位点, 斜体为终止密码 ).PCR 扩增产物回收后, 将目的片段连接于亚克隆载体 PCR2.1, 构建目的基因的亚克隆 cp-p2.1. 而后再进行双酶切验证. 所得目的片段与相同限制性内切酶处理 pet-32a(+) 载体 (5900bp) 连接, 转化至表达菌株 Roseta2(DE3). 1.4 基因表达 pet32a-acutobin 工程菌接种于 LB 培养基 (LB 培养基添加有氨苄青霉素 ) 中,37 过夜活化, 再按 1 50~1 100 比例接种于新鲜 LB 培养基,37 摇培至 OD 600 达到 0.6~1.0 时加入乳糖类似物 IPTG 至终浓度和 3mmol L -1, 继续于诱导培养和 4h 取被诱导的菌液, 离心后加入缓冲液, 溶解煮沸 10min,12.5%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE). 1.5 质粒稳定性制作添加 Amp 抗性的 LB 平板, 编号为 1, 无添加物平板编号为 2. 将细胞浓度稀释到后涂布平板,37 培养 24h 后进行计数和统计, 每号平板设 3 组平行, 对计数结果进行平均. 1.6 重组质粒诱导表达条件的优化重组菌生长曲线. 挑取单菌落接种于 5mL 的 LB 培养基 ( 含 100μg ml -1 氨苄青霉素 ),37 摇培 6 ~8h, 再以比例接种于 50mL 新鲜 LB 培养基 37 摇培,1mL h -1 取样测定 OD 600, 且对应其生长时间, 作出该重组菌的生长曲线. 诱导温度. 根据生长曲线及宿主菌 Roseta2(DE3) 所能适应的温度范围, 在菌株的对数中期加入 1mmol L -1 的诱导剂 IPTG, 分别在培养 4h, 而后取 1mL 菌液在 10000r min -1 离心 10 min, 弃尽上清用 50μL 缓冲液溶解再加入等量上样处理液共沸 10min, 取 20μL 样品进行 SDS-PAGE 并利用结果进行分析. 诱导时间.37 培养重组菌株至对数中期, 加入 1mmol L -1 的诱导剂 IPTG, 在 30 分别诱导培养和 4h 后取 1mL h -1 进行同上处理, 根据 SDS-PAGE 结果确定最佳诱导时间. 诱导剂浓度优化. 在上述最佳表达条件基础上, 改变 IPTG 浓度, 按和 3mmol L -1 梯度进行实验, 菌体处理同上, 根据实验结果确定 IPTG 最佳浓度. 1.7 SDS-PAGE 分析采用不连续凝胶电泳检测, 分离胶 12.5%. 蛋白条带用考马斯亮蓝染色 [7]. 1.8 酶活性检测反应物 100μL, 加入到 500μL 含浓度为 9mg ml -1 牛纤维蛋白原的 Tris-HCl(20mmol L -1,pH 7.0) 中 37 孵育 1h, 观察凝结现象, 并以纯水及牛凝血酶代替目标蛋白作为阴阳对照组 [8-9]. 2 结果 2.1 表达载体的构建与鉴定选择 pet-32a(+) 为表达载体, 构建尖吻蝮蛇类凝血酶 acutobin 基因 (741bp) 大肠杆菌表达质粒, 如图 1 所示. 再用预先设计的引物,PCR 验证重组质粒, 如图 2 所示. 表达质粒转化到 Roseta2(DE3) 菌株, 制作生长曲线, 如图 3 所示. 目的基因送样测序 ( 生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ), 所得结果与设计序列比对一致. 2.2 质粒稳定性分析对含有 Amp 的抗性平板菌落进行计数, 以空白平板上菌落数为基准进行百分率统计, 结果如表 1. 菌体培养过程中, 质粒可能出现丢失或突变而不能表达目的蛋白.pET-32a(+)- acutobin 含有 Amp 抗性, 若重组质粒转入 Roseta2(DE3) 菌体并表达, 则重组菌能够在抗性平板生长, 不受抑制. 实验结果表

254 第 41 卷明, 抗性平板菌落数与非抗性平板一致 ( 数值在误差范围内 ), 表明所构建的质粒不随菌株的传代而丢失突变, 具有良好的稳定性. 图 1 重组表达载体图 Fig.1 Mapoftherecombinant expresionvector 图 2 重组质粒的 PCR 验证 Fig.

1 Analysisofsporecountsinplatingforplasmidstability 平行组平板编号添加物 1 2 3 1 Amp 124 105 103 2 无 126 102 107 2.3 表达条件的优化经验证能够稳定表达蛇毒类凝血酶的重组菌株, 在 30 诱导 4h 后取破碎上清进行 SDS-PAGE 蛋白表达量及酶活力检测.

3 254 第 41 卷明, 抗性平板菌落数与非抗性平板一致 ( 数值在误差范围内 ), 表明所构建的质粒不随菌株的传代而丢失突变, 具有良好的稳定性. 图 1 重组表达载体图 Fig.1 Mapoftherecombinant expresionvector 图 2 重组质粒的 PCR 验证 Fig.2 PCRidentificationoftherecombinant plasmid 图 3 菌体生长曲线 Fig.3 Growthcurveofthebacteria 表 1 质粒稳定性平板菌落计数结果 Tab.1 Analysisofsporecountsinplatingforplasmidstability 平行组平板编号添加物 Amp 无表达条件的优化经验证能够稳定表达蛇毒类凝血酶的重组菌株, 在 30 诱导 4h 后取破碎上清进行 SDS-PAGE 蛋白表达量及酶活力检测. 根据 acutobin 基因序列利用 ExPASy- ComputepI/Mw 测算目标蛋白理论分子量为 44.3kDa. 如图 4 所示, 蛋白电泳及酶活力与预测结果相符, 为后续进一步优化表达条件奠定基础诱导温度对表达的影响温度不仅影响菌体生长, 而且对目标蛋白的表达也有重要影响. 相关体系研究结果表明, 在一定范围内低温有助于可溶性蛋白表达, 高温易形成包涵体影响蛋白活性 [10]. 不同温度下诱导重组菌, 控制其他培养条件相同, 对比诱导前后蛋白表达情况, 如图 5 所示, 其中 (a)~(c) 分别为培养条件下诱导. 根据 Quantity-One 图 4 Acutobin 的诱导表达 ( 单位 :kda) Fig.4 Acutobinexpresionafterinduction(unit:kDa) 软件测算, 目标蛋白及杂蛋白表达量不存在明显差异. 综合考虑菌株生长情况酶活力指标及规模化生产成本, 选取 30 诱导为佳诱导时间对表达的影响基于不同诱导温度对目的蛋白表达影响较小, 检测分析不同诱导时间对总蛋白和目的蛋白表达量的作用, 如图 6 所示, 其中 (a)~(c) 分别为培养条件下诱导, 加入诱导剂后每间隔 1h 取样检测. 结果经 Quantity-One 软件测算表明, 加入诱导剂后目的蛋白表达量明显增加, 在 25 和 37 条件下 2 h,30 条件下 3h, 蛋白表达水平基本稳定, 即诱导 3h 便可达到预期产量.

第 2 期程欲, 等 : 尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化 255 (a)25 (b)30 (c)37 图 5 诱导温度对表达的影响 ( 单位 :kda) Fig.

6 Theinfluenceofinductiontimeonproteinexpresionlevel(unit:kDa) 2.3.

如图经 Quantity-One 软件测算可知, 当 IPTG 浓度为 0.5mmol L -1 时, 目标蛋白的表达量达到较高水平, 与一般诱导浓度 1.0mmol L -1 相比 [11], 可减少 IPTG 用量. 2.

4 第 2 期程欲, 等 : 尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化 255 (a)25 (b)30 (c)37 图 5 诱导温度对表达的影响 ( 单位 :kda) Fig.5 Theinfluenceofinductiontemperatureonproteinexpresion(unit:kDa) (a)25 (b)30 (c)37 图 6 诱导时间对表达的影响 (( 单位 :kda)) Fig.6 Theinfluenceofinductiontimeonproteinexpresionlevel(unit:kDa) 诱导剂浓度对表达的影响诱导剂浓度对目的蛋白的影响如图 7 所示, 综合以上实验结果, 在 30 诱导条件下分别加入 0.5 ~2.5mmol L -1 诱导剂 IPTG 摇培 3h, 取样检测. 如图经 Quantity-One 软件测算可知, 当 IPTG 浓度为 0.5mmol L -1 时, 目标蛋白的表达量达到较高水平, 与一般诱导浓度 1.0mmol L -1 相比 [11], 可减少 IPTG 用量. 2.4 酶活检测蛇毒类凝血酶对纤维蛋白酶具有特异性, 在体外降解纤维蛋白原, 形成首位相连的聚合物, 使得反应体系出现浑浊沉淀. 将尖吻蝮蛇类凝血酶基因 acutobin 克隆到大肠杆菌内, 融合硫还原蛋白低温诱导 (30 ), 表达出可溶性蛋白, 产物活性检测如图 8 所示, 具有明显酶学活性. 图 7 IPTG 浓度对表达的影响 ( 单位 :kda) Fig.7 Totalproteinexpresionasfunction ofiptgconcentration((unit:kda))

256 第 41 卷 3 讨论图 8 纤维蛋白凝结活性检测 Fig.8 Fibrinogen-clotinganalysisofTex-trx 利用分子生物学研究手段使外源基因克隆并表达, 从而生产出具有应用价值的蛋白质产品 [12]. 随着研究深入, 各种表达系统也逐渐成熟, 且各具优势. 其中原核表达体系 ( 以大肠杆菌为代表 ) 发展时间最长, 各种机理研究最为透彻, 应用也最为广泛.

5 256 第 41 卷 3 讨论图 8 纤维蛋白凝结活性检测 Fig.8 Fibrinogen-clotinganalysisofTex-trx 利用分子生物学研究手段使外源基因克隆并表达, 从而生产出具有应用价值的蛋白质产品 [12]. 随着研究深入, 各种表达系统也逐渐成熟, 且各具优势. 其中原核表达体系 ( 以大肠杆菌为代表 ) 发展时间最长, 各种机理研究最为透彻, 应用也最为广泛. 然而, 此体系对外源基因的表达因无法很好建立键内或键间二硫键, 导致外源蛋白错误折叠. 为克服这一问题, 引入硫氧还原蛋白表达体系, 表达的硫氧还蛋白作为一种高效二硫键还原酶, 通过维持细胞内二硫键维系细胞的氧化还原状态 [6]. 大肠杆菌作为原核体系的典型代表, 与尖吻蝮蛇所属的真核体系在转入后翻译过程存在较大差异. 研究显示, 绝大多数蛇毒类凝血酶均由单条肽链构成, 且具有多个链内二硫键 [13] ; 糖基化程度高. 此修饰差异对表达的类凝血酶活力产生影响. 针对此缺陷, 未来可尝试将 acutobin 转入真核体系表达. 将 acutobin 基因分别克隆于 pet21a(+) pet27b pet32a(+) 载体, 比较类凝血酶在大肠杆菌 Roseta2(DE3) 的表达. 其中 pet21a(+) 和 pet27b 载体转化的重组菌株虽然能够表达出重组蛋白, 但绝大部分以包涵体形式存在, 不仅影响后期分离纯化, 更对酶活力有极大的损害. 相比之下,pET32a(+) 载体转化的重组菌株以可溶性形式存在, 并显示出预期酶活性, 验证了构建初期对硫还原蛋白作用的构想. 参考文献 : [1]MatsuiT,FujimuraY,TitaniK.Snakevenomsproteasesafectinghemotasisandthrombosis[J].BiochimBiophysActa,2000, 1477: [2] 应雪红, 王永安, 王汉斌. 毒蛇咬伤的诊断和治疗进展 [J]. 中国医刊,2007,42(7): [3] 李平, 黄爱玲, 粱子敬. 竹叶青蛇伤致血液系统功能障碍的特点与救治对策 [J]. 现代临床医学工程学杂志,2006,12 (2): [4]MarklandFS.Snakevenomsandthehemostaticsystem[J].Toxicon,1998,36: [5] 林奕心, 余晓东, 和七一, 等. 蛇毒类凝血酶研究进展 [J]. 重庆师范大学学报,2009,26(2): [6]SanoH,SataT,NanriH,etal.Thioredoxinisasociatedwithendotoxintoleranceinmice[J].CritCareMed,2002,30(1): [7] 张龙翔, 张庭芳, 李令媛. 生化实验方法与技术 [M].2 版. 北京 : 高等教育出版社,1977. [8] 袁盛凌, 王秡, 陶好霞, 等. 蛇毒类凝血酶 calobin 在毕赤酵母中的表达 [J]. 生物工程学报,2009,25(4): [9] 李民, 杨青, 包永明, 等. 蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 [J]. 无锡轻工大学学报,2003,22(2): [10] 李东江, 郑颖, 叶锋平, 等. 蛇毒类凝血酶基因大肠杆菌和酵母细胞表达条件的优化 [J]. 西南国防医药,2010,20 (6): [11]JengWen-yih,ChenChiu-yueh,ChangHsien-chang,etal.Expresionandcharacterizationofrecombinanthumancyto chromecine.coli[j].jbioenergbiomembr,2002,34(6): [12] 杨岐生. 分子生物学 [M]. 杭州 : 浙江大学出版社,2004. [13]SuzukiandT,TakahashiH.Purificationoftwothrombin-likeenzymesfromthevenomofAgkistrodoncaliginosus[J].Toxi con,1984,22(1): ( 责任编辑 : 杨青 )

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

第 2 期 程欲, 等 : 尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化 253 -D- 半乳糖苷 (IPTG) 酵母提取物及胰蛋白栋为 Sigma 公司产品 ;DEAE650M His 纯化介质填料 (His 镍柱 ) 购自 QIAGEN 公司. 1.3 表达载体的构建 根据 acutobin 基因

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