54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 均为国产分析纯或生化试剂 1.2 试验方法 Monelin 重组工程菌的构建单链 monelin 基因的设计及人工合成 : 根据组成 Monelin 的氨基酸序列 [5,6], 在 A 链和 B

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(3):53~58 乳糖诱导甜蛋白 Monelin 在大肠杆菌中的表达 1 杨书慧 1 赵胜军刘 2 军 2 闫达中易 1 丹 (1 武汉工业学院动物营养与饲料科学湖北省重点实验室武汉 ) (2 武汉工业学院生物与制药工程系武汉 ) 摘要根据已报道的单链 Monelin 甜蛋白的氨基酸序列, 按大肠杆菌基因偏爱密码子, 设计和人工合成了单链 monelin 基因将单链 monelin 基因克隆到大肠杆菌表达载体 pet 28a 中, 构建了重组表达载体 pet28a mon, 转化大肠杆菌 BL21(DE3), 得到表达 Monelin 的大肠杆菌工程菌株借助 SDS PAGE 分析方法, 研究了乳糖代替 IPTG 诱导大肠杆菌表达甜蛋白 Monelin 通过对乳糖作为诱导剂表达条件进行优化,Monelin 的表达量可占细胞总蛋白的 33.09%, 与 IPTG 诱导表达量接近为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产甜蛋白 Monelin 提供了参考依据关键词甜蛋白 Monelin 乳糖诱导表达优化中图分类号 Q786 Monelin 是存在于西非植物 Dioscoreophylum cumminsi 果实中的一种天然甜味蛋白, 其甜度是等质量蔗糖的 3000 倍 [1], 在目前甜味剂中其甜度最高, 且热量低不易被细菌利用 [2] 若将其用作饲料添加剂, 可增加饲料甜味促进家畜的食欲, 尤其对于幼畜的诱食会起到十分有效的作用 ; 用作食品添加剂, 不仅可改善食品与饮料的风味, 而且其安全性远高于其它人工合成类甜味剂 ( 如糖精钠 ); 用于医药工业, 不但可减少药物的苦味, 利于病人吸收, 还不必担心龋齿肥胖等问题的产生, 且可被糖尿病患者使用 [1~4] 因此, 具有较好的应用前景但是, 由于天然甜味蛋白的来源有限, 无法满足市场需求所以, 为能大批量生产, 获得较大经济效益, 有很多学者开始了基因工程表达 Monelin 的研究天然 Monelin 由两条肽链构成, 其中 A 链和 B 链各含有 45 个氨基酸和 50 个氨基酸 [5] 两条链之间没 [6] 有二硫键存在, 热稳定性差 1989 年 Kim 等将编码 A 链和 B 链的核苷酸连在一起, 在大肠杆菌中成功表达出了具有高稳定性高甜度的单链 Monelin 甜蛋白收稿日期 : 修回日期 : 动物营养与饲料科学湖北省重点实验室开放基金 (2006A008), 湖北省自然科学基金 (2005ABA094), 资助项目通讯作者, 电子信箱 :zhaoshengjun1974@163.com [7] 1997 年, 日本学者 Kondo 等利用甘氨酸残基将 monelina,b 两条链连接起来, 并在 Candidautilis 中表达了有活性的单链 Monelin 甜蛋白目前在 pet 系统中, 用于诱导宿主菌高效表达出重组产物的物质通常是异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG), 但 IPTG 有潜在的毒性且价格昂贵, 应用于大规模发酵生产基因工程重组物有一定的局限性本试验根据大肠杆菌基因偏爱密码子, 设计和人工合成了重组单链 monelin 基因, 构建了大肠杆菌工程菌株在构建表达 Monelin 工程菌株基层上, 用乳糖代替 IPTG, 对乳糖诱导目的蛋白表达的各种基本参数进行了研究 1 材料与方法 1.1 试验材料菌株和质粒大肠杆菌 BL21(DE3),DH5α 及载体 pet 28a 本实验室保存 ; 目的基因由本实验室设计, 由上海捷瑞生物工程公司合成 ; 质粒 pet28a mon, 重组工程菌 DE 3 pet28a mon 均由本实验室构建保存试剂蛋白胨 (Tryptone) 和酵母粉 (Yeast Extract) 购自英国 OXOID 公司 ;IPTG 购自 Merck 公司 ; 丙烯酰胺 (Acr) 及甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 购自 Fluka 公司 ; 四甲基乙二胺 (TEMED) 购自 Sigma 公司 ; 其余试剂

2 54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 均为国产分析纯或生化试剂 1.2 试验方法 Monelin 重组工程菌的构建单链 monelin 基因的设计及人工合成 : 根据组成 Monelin 的氨基酸序列 [5,6], 在 A 链和 B 链之间插入甘氨酸, 构成单链 monelin 按照 CodenUsageDatabase 数据库 (NCBI GenBank) 中大肠杆菌密码子的偏爱性, 在不改变其氨基酸序列的前提下设计单链 monelin 编码基因在合成基因的 5 端添加 NcoI 酶切位点, 在基因的 3 端添加 BamHI 酶切位点, 将合成好的全基因通过 NcoI/BamHI 位点克隆到 pet 22b 载体上基因的合成由上海捷瑞生物工程公司完成表达 Monelin 的工程菌株的构建 : 用 NcoI BamHI 从含甜蛋白 monelin 基因的 pet 22b 上切下 monelin 基因, 并将其插入到 pet 28a 的 NcoI BamHI 位点之间, 构建重组载体 pet28a mon, 将重组载体转化大肠杆菌 BL21(DE 3 ), 得到表达 Monelin 的大肠杆菌工程菌株诱导条件的优化 (1) 最适乳糖浓度的确定 : 在重组菌株生长至 OD 600 为 1.0 时, 分别向 8 个摇瓶中添加不同量的乳糖, 使其终浓度分别为 0g/L,4g/L,6 g/l,8g/l,9g/l,10g/l,11g/l,12g/l,37 继续诱导 7h, 取 1.0ml 菌液作全菌 SDS PAGE 电泳 (2) 菌株最佳诱导起始生长量的确定 : 工程菌分别培养至 OD 600 值为 0.2,0.6,1.0,1.4,1.8 时, 向培养液中添加最佳浓度的乳糖进行诱导,37 继续诱导 7h, 取 1.0ml 菌液作全菌 SDS PAGE 电泳 (3) 最佳诱导温度的确定 : 向处于最佳诱导起始生长量的摇瓶中添加最适浓度的乳糖, 分别在 28,32,37 继续诱导 7h, 取 1.0ml 菌液作全菌 SDS PAGE 电泳 (4) 最佳诱导时间的确定 : 向处于最佳诱导起始生长量的摇瓶中添加最适浓度的乳糖, 于诱导后 4h,5h,6h,7h,8h 各取出一瓶, 每瓶取 1.0ml 菌液作全菌 SDS PAGE 电泳 (5) 最适接种量的确定 : 将生长至 OD 600 为 0.8 的工程菌液分别以 0.5%, 1%,2%,3%,4% 的接种量接种到装有 50mlLB( 含 5.0μl/mlkan) 的 250ml 摇瓶中 37 分别培养至最佳诱导起始生长量, 添加最佳乳糖诱导浓度, 于最佳诱导温度最佳诱导时长下诱导表达每瓶取 1.0ml 菌液作全菌 SDS PAGE 电泳乳糖诱导与 IPTG 诱导效果的比较分别在乳糖诱导最佳条件和 IPTG 诱导最佳条件 (IPTG 终浓度 1mmol/L, 为另一实验结果所得 ) 下, 添加相应的诱导剂诱导最佳时长后, 分别取 1.0ml 菌液作全菌 SDS PAGE 电泳表达产物分布的确定在最佳条件下进行诱导, 取 1.5ml 细菌培养液离心得到菌体, 用水洗涤一次后加入 0.5ml 裂解缓冲液 [ 含 1mg/ml 溶菌酶,1mmol/ LEDTA,50mmol/LNaC1,50mmol/LTris(pH8.0)], 室温放置 15min 后,12000g 离心 10min, 取上清沉淀用 0.5ml8mol/L 尿素重悬,50 放置 15min 将上清和沉淀分别作 SDS PAGE 电泳分析表达产物的纯化将培养液以 6000r/min 离心 10min, 收集菌体, 按 10 倍体积的量加入 PBS 缓冲液重悬沉淀,37 水浴 40min; 冰浴下超声破碎菌体 36min ( 工作 5s, 间隙 3s, 功率 400W), 将超声裂解液 4 下 12000r/min 离心 15min, 收集上清 ; 上清 60 水浴放置 10min 后, 用 4mol/L 的盐酸调节 ph 至 4.5,4 放置 1h, 再 4,12000r/min 离心 15min, 收集上清 ; 上清过 SephadexG 50 凝胶柱, 根据 A 280 吸收峰, 收集含 Monelin 的洗脱物, 透析后冷冻干燥菌体生长及目的蛋白表达量的检测取培养菌液测定其 600nm 光吸收值, 作为菌体生物量的指示对诱导后菌体的全菌进行 SDS PAGE 电泳, 用 Syngene 凝胶成像系统自带软件分析重组产物占菌体总蛋白百分含量甜度的测定取一定量的纯化 Monelin 溶于蒸馏水, 并稀释为不同浓度梯度取 lml 不同浓度梯度的 Monelin 溶液与同体积 2%(W/V) 蔗糖溶液品尝比较甜度通过计算获得重组 Monelin 的甜度值 2 结果 2.1 Monelin 重组工程菌的构建单链 monelin 基因的合成按照 CodenUsage Database 数据库 (NCBI GenBank) 中大肠杆菌密码子的偏爱性, 在不改变 Monelin 氨基酸序列的前提下进行基因序列设计单链 monelin 基因的序列及其所编码的氨基酸序列见图表达载体的构建通过合成的基因两端添加的酶切位点, 将合成好的全基因通过 NcoI/BamHI 位点克隆到 pet 22b 载体上按的方法构建重组质粒 pet28a mon, 将其转化大肠杆菌 BL21(DE3), 在含有卡拉霉素的 LB 平板上筛选阳性转化子, 得到表达 Monelin 的大肠杆菌工程菌株经 NcoI,BamHI 酶切鉴定, 插入片段大小正

3 2008,28(3) 杨书慧等 : 乳糖诱导甜蛋白 Monelin 在大肠杆菌中的表达 55 图 1 Monelin 基因序列及氨基酸序列 Fig.1 ThegenesequenceandAmino acidsequenceofmonelin TheAandBchainsofnaturalmonelinare connectedwithaglycineresidue,whichisunderlined 确, 并经测序验证 Monelin 中所用的氨基酸密码子见表 1 表 1 Monelin 合成中氨基酸密码子的使用方法 Table1 Codonusagewithaminoacids insynthesisofmonelin Aminoacid sequence A Nucleotide sequence B Aminoacid sequence A Nucleotide sequence Met 2 ATG 2 Ile 8 ATC 1 Gly 9 GGC 5 ATT 7 GGT 4 Gln 3 CAG 3 Glu 9 GAA 9 Asn 5 AAT 3 Trp 1 TGG 1 AAC 2 Asp 5 GAT 5 Lys 9 AAA 9 Pro 6 CCG 6 Ala 3 GCG 3 Phe 6 TTT 6 Val 4 GTG 4 Thr 4 ACC 4 Tyr 7 TAT 7 Arg 7 CGT 7 Cys 1 TGC 1 Ser 2 TCT 2 Leu 6 CTG 6 Ameansthenumberofaminoacidsinmonelin;Bmeansthenumberof codonusagewithaminoacidsinmonelin 2.2 诱导表达条件的优化最适乳糖浓度的确定在重组菌生长至 OD 600 为 1.0 时加入不同浓度的乳糖,37 继续诱导 7h, 目的蛋白的表达量随着乳糖终浓度的不同而改变, 当乳糖浓度为 11g/L 时为最高, 此后随着乳糖浓度的增高, 目的蛋白的表达量不再增加 ( 图 2) 菌株最佳诱导起始生长量的确定结果如图 3 所示, 在重组菌分别生长至 OD 600 值为 0.2,0.6,1.0, 1.4,1.8 时开始用乳糖进行诱导均可得到目的蛋白的表达, 而在重组菌生长至 OD 600 值为 1.0 时诱导获得的目的蛋白占总蛋白的比值最大, 随后目的蛋白的产量随 OD 600 值的增加而降低这表明 : 菌体处于不同的生长时期, 自身活力有较大差异, 故目的蛋白的表达量也受到影响 ; 本试验在菌体对数生长中期添加乳糖诱导 B 图 2 最适乳糖浓度的确定 Fig.2 Confirmationoftheoptimum lactoseconcentration (a)efectcurveoflactoseconcentrationonmonelinexpresion(b) SDS-PAGE analysisofmonelinexpresion1:control;2~6: Inducedbydiferentconcentrationoflactose(4,6,8,9,10;unit: g/l); 7:Protein marker(c)sds PAGE analysisofmonelin expresion;8~9:inducedbydiferentconcentrationoflactose(11, 12;unit:g/L);10:Control;11:InducedbyIPTG(1mmol/L) 是比较理想的最佳诱导温度的确定在重组菌株生长至 OD 600 值为 1.0 时加入终浓度为 11g/L 的乳糖, 继续诱导 7h, 不同温度下分别诱导, 结果有较大差异,( 图 4) 由图 4 可知 :37 下乳糖诱导时的表达量最高最佳诱导时间的确定在重组菌株生长至 OD 600 值为 1.0 时加入终浓度为 11g/L 的乳糖,37 诱导, 将各时间点取出的样品处理电泳 ( 图 5) 随着诱导时间的加长,monelin 的相对表达量相应提高,5h 之后增长幅度最大,7h 后增长趋于平稳,8h 的相对诱导量最大最适接种量的确定不同接种量对目的蛋白表达量的影响如图 6 所示接种量的大小影响诱导产量和培养周期量小, 延长菌体延迟期, 不利于外源基因的表达 ; 量大, 有利于对基质的利用, 可以缩短生长延迟期, 并使产生菌能迅速占领整个培养环境, 减少污染机会, 但会使菌体生长过快, 代谢产物累积过多, 反而会抑制后期菌体的生长本试验的研究结果是 : 乳糖诱导时,3% 的接种量对目的蛋白的表达最有利

56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No.32008 图 3 菌株最佳诱导起始生长量的确定 Fig.3 Confirmationoftheoptimum initialseedage (a)sds-pageanalysisofmonelinexpresion1:control;2~6: InducedatOD 600 = 0.2145,0.7245,1.

5 EfectofinductiontimeonMonelinexpresion (a)sds PAGEanalysisofMonelinexpresion1:Control;2~6: Inducedfordiferenttime(4h,5h,6h,7h,8h);7:Proteinmarker (b)efectcurveofinductiontimeonmonelinexpresion 图 4

4 56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 图 3 菌株最佳诱导起始生长量的确定 Fig.3 Confirmationoftheoptimum initialseedage (a)sds-pageanalysisofmonelinexpresion1:control;2~6: InducedatOD 600 = ,0.7245,1.01,1.551,1.788;7: Proteinmarker(b)Efectcurveofseedageonmonelinexpresion 图 5 诱导时间对 Monelin 表达的影响 Fig.5 EfectofinductiontimeonMonelinexpresion (a)sds PAGEanalysisofMonelinexpresion1:Control;2~6: Inducedfordiferenttime(4h,5h,6h,7h,8h);7:Proteinmarker (b)efectcurveofinductiontimeonmonelinexpresion 图 4 温度对 Monelin 表达的影响 Fig.4 Efectoftemperatureonmonelinexpresion (a)sds-pageanalysisofmonelinexpresion1:control;2~4: Inducedunderdiferenttemperature(28,32,37 );5:Protein marker(b)efectcurveoftemperatureonmonelinexpresion 2.3 乳糖诱导和 IPTG 诱导效果的比较分别用终浓度为 11g/L 的乳糖和 1mmol/L 的 IPTG, 在各自最佳条件下诱导将二者得到的全菌一图 6 最适接种量的确定 Fig.6Confirmationoftheoptimum inoculum level (a)sds PAGEanalysisofMonelinexpresion;1:Control;2,4~7: Inducedwithdiferentinoculum levels(0.5%,1%,2%,3%, 4%);3:Proteinmarker(b)Efectcurveofinoculumlevelon monelinexpresion 起进行 SDS PAGE 分析 ( 图 7) 由图可见, 目的蛋白的分子量约为 11kDa, 与理论分子量 10.7kDa 相同乳糖

2008,28(3) 杨书慧等 : 乳糖诱导甜蛋白 Monelin 在大肠杆菌中的表达 57 诱导时的目的蛋白和杂蛋白的表达量均较 IPTG 稍高, 目的蛋白的相对表达量达 33.09%, 而 IPTG 诱导时的相对表达量达到了 34.08%, 两者差别不大, 表明可以用乳糖代替 IPTG 进行 Monelin 的诱导表达图 9 纯化产物的 SDS PAGE 电泳分析 Fig.

7 Efectofdiferentinducers(lactose oriptg )onmonelinexpresion 1:Inducedbylactose;2:InducedbyIPTG; 3:Control;4:Proteinmarker 2.4 表达产物的分布将经过处理的上清和沉淀分别电泳, 结果如图 8 所示图 8 表达产物的分布 Fig.

6 Monelin 的甜度测定结果将纯化的 Monelin 样品超滤除盐真空冷冻干燥后, 配制成溶液, 通过试验人员双盲测试, 得到重组 Monelin 的甜度约为同等重量蔗糖的 2500 倍, 且甜味持续时间长 3 讨论 Monelin 作为一种高效非糖甜味剂, 具有广阔的应用前景, 但由于天然资源来源有限, 无法规模化工业生 [6] 产 1989 年,Kim 等利用基因工程技术获得了单链

5 2008,28(3) 杨书慧等 : 乳糖诱导甜蛋白 Monelin 在大肠杆菌中的表达 57 诱导时的目的蛋白和杂蛋白的表达量均较 IPTG 稍高, 目的蛋白的相对表达量达 33.09%, 而 IPTG 诱导时的相对表达量达到了 34.08%, 两者差别不大, 表明可以用乳糖代替 IPTG 进行 Monelin 的诱导表达图 9 纯化产物的 SDS PAGE 电泳分析 Fig.9 SDS PAGEanalysisofthepurifiedprotein 1:Control;2~3:Purifiedprotein; 4:Proteinmarker;5:Totalprotein 图 7 乳糖与 IPTG 诱导效果的比较 Fig.7 Efectofdiferentinducers(lactose oriptg )onmonelinexpresion 1:Inducedbylactose;2:InducedbyIPTG; 3:Control;4:Proteinmarker 2.4 表达产物的分布将经过处理的上清和沉淀分别电泳, 结果如图 8 所示图 8 表达产物的分布 Fig.8 Distributionofexpresionprotein 1:Proteinmarker;2:Depositionsample; 3:Totalsolubleprotein;4:Control 由图 8 可知, 目的蛋白大部分存在于沉淀中凝胶成像系统分析表明, 目的蛋白占沉淀中蛋白的 39.06%, 占上清中可溶性蛋白的 22.04% 2.5 Monelin 的纯化按前述的方法对诱导产物进行纯化, 将收集的部分样品进行 SDS PAGE 电泳结果表明, 纯化后的样品中只有一条分子量约为 11kDa 的目的带 ( 图 9) 2.6 Monelin 的甜度测定结果将纯化的 Monelin 样品超滤除盐真空冷冻干燥后, 配制成溶液, 通过试验人员双盲测试, 得到重组 Monelin 的甜度约为同等重量蔗糖的 2500 倍, 且甜味持续时间长 3 讨论 Monelin 作为一种高效非糖甜味剂, 具有广阔的应用前景, 但由于天然资源来源有限, 无法规模化工业生 [6] 产 1989 年,Kim 等利用基因工程技术获得了单链 monelin, 其耐热性和耐酸性有了提高, 而又保持其原甜 [8] 度崔洪志等利用质粒 pbv221 构建了重组表达载体, 并将 monelin 基因在大肠杆菌中实现了表达, 其表达量为可溶性蛋白的 22.8% 根据大肠杆菌基因偏爱密码子, 人工合成了重组单链 monelin 基因, 构建了大肠杆菌工程菌株未经修饰的植物 monelin 基因含有较多大肠杆菌稀有密码子, 会影响重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平按照大肠杆菌基因偏爱密码子合成 monelin 基因, 将其在大肠杆菌中表达, 由于不含有大肠杆菌稀有密码子, 可能会提高表达水平本研究利用修饰后的不含大肠杆菌稀有密码子的植物 monelin 基因, 在大肠杆菌中实现了较高水平的表达,Monelin 表达量可达菌体总蛋白的 33.09% 所用的表达载体 pet 28a 以 T7 启动子来控制重组产物表达, 在紧邻 T7 启动子的下游有一个 lacoperator 序列, 其上也有编码阻遏蛋白的 laci 序列 IPTG 是一种乳糖类似物, 能与 laci 编码的阻遏蛋白特异性结合, 使阻遏蛋白构象变化, 从而诱导 T7 启动子驱动重组基因的转录和表达 IPTG 是十分有效的诱导剂, 但 IPTG 有潜在的毒性且价格昂贵, 在大规模发酵生产中, 通常

6 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 不用它作为诱导剂乳糖是一种二糖, 没有毒性, 是乳糖操纵子的天然诱导物另外, 乳糖价格低廉, 使其可能成为代替 IPTG 的诱导剂因此, 开展乳糖作诱导剂生产重组蛋白具有十分重要的意义然而, 由于乳糖本身是一种碳源, 可以被菌体代谢利用 ; 同时因乳糖只有借助于乳糖透性酶的作用进入到菌体细胞内, 并经过 β 半乳糖苷酶的作用转化为别构乳糖才会起到诱导作用因此, 需要对乳糖作为诱导剂的诱导条件进行更为精细的研究及优化本文深入研究了乳糖浓度诱导起始生长量诱导温度诱导时间接种量等对 Monelin 表达量的影响, 从中寻找适合 BL21(DE 3 ) pet28a mon 的表达条件结果表明, 在优化的诱导表达条件下,Monelin 表达量可占菌体总蛋白的 33.09%, 与 IPTG 诱导表达量接近一般以乳糖作为诱导剂表达的重组蛋白量在 20% [9] 左右, 如李春丽等用乳糖诱导植物甜蛋白 des pglu1 [10] Brazein 的表达量在 25% 左右, 李兆鹏等用乳糖诱导 hblys 的表达量为 14.3%, 这可能与携带的基因相关, 也可能与一系列的诱导条件相关本研究对诱导条件进行优化,Monelin 的表达量达到菌体总蛋白的 33.09% 参考文献 [1]MorisH A,CaganR H.Characterizationofmonelin, a proteinthattastesweet.journalofbiologicalchemistry,1973, 248(2):534~539 [2] 崔洪志, 李敏, 郭三堆. 植物甜蛋白的研究进展. 生物技术通讯,1997,2:10~14 CuiHZ,LiM,GuoSD.LetersinBiotechnology,1997,2: 10~14 [3] 朱海霞. 甜蛋白的研究进展. 中国食品添加剂,2003(6):11 ~24 ZhuHX.ChinaFoodAdditives,2003(6):11~24 [4] 范长胜. 甜蛋白的开发与应用研究. 食品与发酵工业,2001, 27(12):50~54 FanCS.FoodandFermentationIndustries,2001,27(12):50 ~54 [5] Kohmura M, Nio N, AriyoshiY. Complete amino acid sequenceofthesweetproteinmonelin.agricbiolchem, 1990,54(9):2219~2224 [6]Kim SH,KangC H,Kim R,etal.Redesigningasweet protein: increased stability and renaturability. Protein Engineering,1989,2(8):571~579 [7]KonodoK,MiuraY,SoneH,etal.High leverexpresionofa sweetprotein,monelin,inthefoodyeastcandiautilis.nature Biotechnology,1997,15:452~457 [8] 崔洪志, 李敏, 郭三堆, 等. 植物 Monelin 甜蛋白基因的细菌化改造合成及其在大肠杆菌中的表达. 中国农业科学, 1999,32(1):58~62 CuiHZ,LiM,GuoSD,etal.ScientiaAgriculturaSinica, 1999,32(1):58~62 [9] 李春丽, 陈其新, 何国庆. 乳糖诱导植物甜蛋白 des pglu1 Brazein 在大肠杆菌中的表达. 生物工程学报,2006,22(6): 1021~1025 LiCL,ChenQX,HeGQ.ChineseJournalofBiotechnology, 2006,22(6):1021~1025 [10] 李兆鹏, 张栩, 徐斌, 等. 重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达 hblys. 过程工程学报,2005,5(4):446~449 LiZP,ZhangX,XuB,etal.TheChineseJournalofProces Engineering,2005,5(4):446~449 ExpresionofPlantMonelininEscherichiacoliInducedbyLactose YANGShu hui 1 ZHAOSheng jun 1 LIUJun 2 YANDa zhong 2 YIDan 1 (1WuhanPolytechnicUniversity,HubeiKeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedScience,Wuhan ,China) (2WuhanPolytechnicUniversity,BiologicalandPharmaceuticalEngineeringDepartment,Wuhan ,China) Abstract AccordingtotheaminoacidsequenceofMonelinandthebiasincodenchoiceinEscheriacoli, asinglechainmonelingenewassynthesizedandsubclonedintoaescheriacoliexpresionvectorpet 28a.The recombinedplasmidpet28a monwasthentransformedintoescheriacolibl21(de3).lactosewasusedasan inducerinsteadofiptg.throughproperoptimizationofinductionconditions,anexpresionlevel33.09% oftotal celularproteinwasachieved.theexpresionlevelofrecombinantproteininducedbylactosewasbasicalythe sameasthatinducedbyiptg.theresultindicatedthatlactosecouldbeusedasapromisinginducerinthe productionofrecombinedsweetproteinmonelin. Keywords Monelin Lactose Inducingexpresion Optimization

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