进一步的工作证实 1M 氢氧化钠和 1M 氯化钠联 用能有效清除强阴离子交换介质 Q Sepharose Fast Flow 上的 DNA, 然而这种清除程度取决 于样品的性质 (5) 这些试验中在位清洗的 接触时间为 2 小时 其中一个例子中采用了 DNase 对阴离子交换介质进行 DNA 彻底清

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1 GE Healthcare 应用文献 AF 工业层析 氢氧化钠用于层析介质及系统的清洗和消毒 氢氧化钠被广泛用于清洗 消毒和保存层析介质及层析系统 使用氢氧化钠的一大好处在于有效 低成本 并能容易检测 清除和处理 和其它的消毒剂一样, 氢氧化钠的使用同样要注意采取一些措施, 并对其与层析填料和层析系统之间的兼容性进行考察 本应用文献就氢氧化钠作为清洗和消毒剂的诸多方面进行检查 本文献收入了一些重组蛋白 单克隆抗体以及寡聚核苷酸生产者感兴趣的例子, 因为在这些产品的商业生产中, 设计和放大的清洗工艺验证是一个重要的问题 (1) 清洗效率 氢氧化钠一直被认为能有效去除蛋白和核酸 同时, 它还能灭活大多数的病毒 细菌 酵母 真菌以及内毒素 在实际的工业生产中为了节约时间, 在氢氧化钠中加入氯化钠等盐物质, 从而可将清洗和消毒两者进行结合 去除蛋白和核酸 作为清洗剂, 氢氧化钠能皂化脂肪并且可溶解蛋白 (2) 总体来说, 氢氧化钠可溶解沉淀的蛋白 氢氧化钠的水解作用可被氯增强 (3) 氢氧化钠将蛋白和核酸从层析介质中去除的能力主要取决于介质本身性质 样品 以及干扰清洗效果的样品中的污染物性质 比如, 如果脂类结合蛋白需要高浓度的氢氧化钠进行清洗 为了检验氢氧化钠清洗是否有效, 使用者需要周期性的将储存液上样, 并在每次清洗后运行空白梯度检测 (4) 蛋白 氢氧化钠被广泛用于清除结合在离子交换介质 疏水层析介质以及凝胶过滤介质中的蛋白 由于亲和层析介质大多数的固定配基稳定性不够, 故以前氢氧化钠用于亲和层析时有一定的限制 如今, 最新开发的新一代蛋白 A 亲和层析介质改变了这一事实 如 MabSelect SuRe 纯化单克隆抗体的工艺中, MabSelect SuRe 与氢氧化钠的兼容性已经得到了明显的改善 MabSelect SuRe 是一种碱稳定的蛋白 A 配基, 此介质的设计可以耐受.1-.5M 氢氧化钠溶液作为清洗剂 核酸 核酸物质顽固地结合在阴离子交换介质上 然而, 我们实验室的工作证实 1M 氢氧化钠和 3M 氯化钠联合作用一小时可有效清除来自弱阴离子交换介质 DEAE Sepharose Fast Flow 上放射标记的小牛胸腺 DNA 不过仍有小部分的 DNA 得以保留, 这一部分在测试的所有条件下都未能得到清除 其他试验证实较低浓度或缩短接触时间会导致不能有效清除 DEAE Sepharose Fast Flow 上的核酸以恢复介质的分离能力 23

2 进一步的工作证实 1M 氢氧化钠和 1M 氯化钠联 用能有效清除强阴离子交换介质 Q Sepharose Fast Flow 上的 DNA, 然而这种清除程度取决 于样品的性质 (5) 这些试验中在位清洗的 接触时间为 2 小时 其中一个例子中采用了 DNase 对阴离子交换介质进行 DNA 彻底清除 病毒 细菌 酵母 真菌 朊病毒和内毒素的灭活 病毒和朊病毒来自一个检测实验室的试验结果显示.1M 的 氢氧化钠足以使小鼠白血病病毒 ( 一种典型包 膜病毒 ) 灭活 (6) 最近,Q-One Biotech 公司 公开了氢氧化钠对八种不同的病毒进行灭活 的数据, 该实验采用.1M 和.5M 两个浓度的 氢氧化钠进行研究, 检测的病毒学活性见 ( 表 1) 值得注意的是, 抵抗力较强的非包膜病 毒, 如犬细小病毒和 SV-4 也可用氢氧化钠进 行灭活 并且, 有关新型 Creutzfeldt-Jakob 病与疯牛 病病毒 (BSE) 存在联系的报道更加引起人们对 外来病原的重视 氢氧化钠可有效灭活 BSE 病 毒, 这一病毒对大多数的处理手段都具有相当的抵抗, 包括 36 干烤一小时处理 (7, 8) 细菌, 酵母和真菌 大量的微生物如酵母和细菌可破坏层析柱和介质的功能 它们还具有一些间接影响如阻塞过滤层和其他系统元件 此外, 它们还可产生一些有害物质如内毒素肠毒素和蛋白酶 表 2 显示了氢氧化钠对于灭活大量酵母和细菌方面非常有效, 灭活效果取决于浓度 接触时间和温度 表 2 中也清楚的显示细菌孢子并不能彻底地被氢氧化钠灭活 然而, 药品生产质量管理规范 (GMP) 和严格的卫生措施可杜绝生产环境滋生细菌污染 一些人推荐采用过氧乙酸 (peraceyic acid) 作为层析过程有效灭菌和消毒的制剂 (9) 虽然过氧乙酸确是一个有效的消毒剂, 但层析系统暴露于此试剂剂下可能会改变层析介质的功能, 并泄漏的物质掺入终产品中 表 1. 用.1M 和.5M 氢氧化钠对 8 种不同病毒 * 进行灭活 斜体标示的值表明样品中未检测到病毒, 列出值为理论最小检测滴度 病毒滴度 HIV BVDV C PV BHV P OL SV-4 M LV ADV. M NaOH Spike t = min t = min t = 2 min t = 6 min I nactivation (log) > > 3.8 > M NaOH Spike t = min t = min t = 2 min t = 6 min I nactivation (log) > 3.5 > > > 3.7 > 7. * HIV: 人免疫缺陷病毒 1 型 ;BVDV: 牛病毒性腹泻病毒 ;CPV: 犬细小病毒 ;BHV: 牛疱疹病毒 1 型 ;POL: 人脊髓灰质炎病毒 2 型 ;SV-4: 猿猴病毒 4; MLV: 小鼠白血病病毒 ;ADV: 人腺病毒 2 型 数据来自苏格兰科学园西侧 Glasgow G2 XA,Q-One Biotech Ltd., Todd 大学 除 BHV 和 MLV ( 用空斑形成单位 pfu 表示 ), 其他病毒的病毒滴度均用 TCID5 表示 (tissue culture infective dose) 24

3 表 2 氢氧化钠灭活微生物 A) 所有检测的微生物类型以及美国培养细胞 库 (ATCC) 号 微生物 ATCC 号 类型 大肠杆菌 8739 gram 菌 金黄色葡萄球菌 6538 gram + 菌 铜绿假单胞菌 927 gram 菌 枯草芽孢杆菌 6633 芽孢细菌 白色念球菌 1231 酵母 黑曲霉孢子菌 1644 霉菌 B) 不同时间和不同温度下检测结果 微生物 NaOH(M) 时间 1 温度.( ) 大肠杆菌.1 2 h 4 或 22 金黄色葡萄球菌.1 1 h 4 或 22 白色念球菌.5 1 h 4 或 22 黑曲霉孢子菌.5 1 h 4 或 22 枯草芽孢杆菌 h 2 22 枯草芽孢杆菌 1. 8 d 3 4 绿脓杆菌.5 1 h 减少至检测限以下 <3 微生物 /ml 减少至检测限以下 1 个微生物 /ml 减少至检测限以下 1 个微生物 /ml 为了增加对抗药微生物如草芽孢杆菌的效率, 加入乙醇以增强氢氧化钠的抗菌作用 表 3 显示将 2% 乙醇添加入.1M 和.5M 氢氧化钠后增加的抗菌效果 微生物挑战实验被开展用于不断更新设计满足清洁需要的系统和层析柱 ÄKTAprocess 是一种自动化的层析系统, 被用于工艺放大和大规模生物药物生产 (1) ÄKTAprocess 系统拥有很多特色, 使 1M 氢氧化钠清洁变得简 单而有效 对于另一个用于工艺开发 放大和缩小以及小规模生产使用的 ÄKTApilot 系统, 其清洁过程同样可用 1M 氢氧化钠进行处理 消毒步骤显示了良好的效果, 对测试的 4 种微生物至少可 16 减少克隆形成单位 (11) 同样, 我们发现氢氧化钠对与 BP G (12) 和 Chromaflow (13) 柱在位清洁同样有效 将这些层析柱暴露于不同的微生物, 然后用氢氧化钠进行特定的 CIP 程序证明可进行有效清除 内毒素 图 1 显示了氢氧化钠对于溶液中大量内毒素进行灭活的效果 需要注意的是相对于浓度为.5M 和 1M 的氢氧化钠采用.1M 氢氧化钠时需要更长的接触时间 内毒素挑战实验在 BioProcess 系统上进行, 该系统连接 BP G 柱, 柱内填充 Q Sepharose Fast Flow 介质 该系统和填充柱用每毫升含 12EU 内毒素的溶液充满, 在室温下保持 23h 然后用 1M 氢氧化钠循环清洗 1 小时以除去致热原之后, 用不含内毒素物的灭菌水进行清洗, 最后用 LAL 实验和总有机碳 (TOC) 等方法进行检测 TOC 分析被用于检测残留在系统中不含碳的失活内毒素片段 将柱子的填料倒出, 搅拌, 对 Q Sepharose Fast Flow 介质进行 LAL 检测 结果表明即使在大量致热原存在下,1M 氢氧化钠处理 1 小时后, 可对系统进行致热原清除 (12) 非常重要的一点是每个物料都是唯一的, 而其他的物料物质如脂质和蛋白具有一定的保护效果 我们推荐内毒素检测作为除热原有效性的常规评价部分 表 3. 氢氧化钠添加 2% 乙醇对枯草芽孢杆菌的除菌效果 (log1 减少 ) 抗菌处理 时间.5M NaOH.5M NaOH 和 2% 乙醇.1M NaOH.1M NaOH 和 2% 乙醇 24 h 3 log 7 log 3 h 2 log 4 log 25

4 内毒素 (ng/ml) 9 8 注意 必须注意层析介质 层析柱 系统以及辅助部件是否和使用的氢氧化钠浓度 时间以及在何温度下的兼容性 还需注意的是氢氧化钠对金属和皮肤具有一定的腐蚀作用 (2) M NaOH.5 M NaOH. M NaOH 兼容性 用于 CIP 和消毒的氢氧化钠浓度主要取决于污染的程度 对于层析介质而言, 是否支持严格的消毒条件取决于功能基团成份, 吸附化学物质以及基质等在碱性环境下的稳定性 稳定性方面的研究非常多, 在大量文献中都有记载 (13-18) 表 4 ( 第 6 页 ) 列举了在不同 PH 下一定范围的介质通常的稳定性 < 图 1. 氢氧化钠灭活内毒素 ( 来自 GE Healthcare) 氢氧化钠的其他用途 氢氧化钠和其他消毒剂相比价格相对便宜 作为一种抑菌剂, 氢氧化钠也被推荐作为介质储存液 根据 PDA 生物技术清洁认证委员会 (3) 的报导,.1 至 1.M 的氢氧化钠通常可用来保存的层析柱 通过简单的在线 PH 和电导测定可判断氢氧化钠是否去除干净 而且, 处理氢氧化钠相对容易, 不需要特殊的手段 表 5 显示了 Butyl Sepharose 4 Fast Flow 在 1M 氢氧化钠作用下的功能稳定性 将介质在室 温条件下保存氢氧化钠中,4 周后对四种不同 标准蛋白洗脱的保留时间无明显差异 表 5. Butyl Sepharose 4 Fast Flow 在 1M 氢氧化钠 CIP 处理后的功能稳定性 ( 摘自参考文献 17) 室温下保存与 1 M NaOH 中的星期数 3 4 滞留时间 min A B C Pooled S.D. (n = 9) D A: 细胞色素 C B: 核糖核酸酶 A C: 溶菌酶 D: 糜蛋白酶原 26

5 亲和配基通常比较脆弱, 不能耐受过于剧烈的环境, 因此需要减少使用的氢氧化钠浓度 尽管如此, 近来新一代的亲和填料在性能上已经得到了明显的改善 MabSelect 是一种重组蛋白 A 亲和介质, 被用于工业上单克隆抗体的生产 ( 如高流率下进行大体积样品处理 ) 测试 MabSelect 是否支持有效的 CIP 表明 CIP 溶液 (5mM NaOH 加入 NaCl 或 Na 2SO 4) 清洗至少 3 个生产循环后, 保持样品的高纯度以及高回收率 (19) 分析 IgG 洗脱液中的 CHO 细胞蛋白 (CHOP) 发现整个研究过程并没有增加, 表明 CIP 有效 随着 MabSelect SuRe 投放市场, 加大了对采用氢氧化钠对蛋白 A 亲和介质的清洗能力的研究 MabSelect SuRe 与 MabSelect 一样具有高强度, 高流量的琼脂糖基质, 所不同在于配基为碱稳定性的蛋白 A 该配基源自蛋白 A 上的 IgG 结合域, 经蛋白工程开发而得 对碱敏感的氨基酸被鉴定并替换以碱稳定的氨基酸 因此 MabSelect SuRe 在碱环境中稳定性极高, 已经测试其可经受.1M 氢氧化钠 CIP 处理 2 个循环, 该测试还使用.5M NaOH 进行了重复实验 (2) 图 2 显示了在碱性环境下人抗体的动态结合量 (DBC) (2) 而传统的重组蛋白 A 配基的 MabSelect 基质用于作对照 在经过氢氧化钠进行若干次 CIP 处理后,MabSelect SuRe 还保留了至少 85-9% 的初始 DBC 其他亲和介质, 如 Heparin Sepharose 6 Fast F l o w 同样能耐受氢氧化钠 ( 2 1 ) 图 3 表明 Heparin Sepharose 6 Fast Flow 能承受在.1M 的氢氧化钠下长时间存在, 并且不会导致抗纤维蛋白酶 III(ATIII) 结合量损失 一旦污染严重, 可用.5M 的氢氧化钠进行短时间有效去除 然而, 随着清洗次数的增多, 这一功能会有所下降, 该结果同样显示在图 3 中 在 2. % 穿 透情况下的 DBC( 多 克隆 higg) (%) min 接触时间以及.M NaOH/ 循环 6min 接触时间以及.M NaOH/ 循环 5min 接触时间以及.5M NaOH/ 循环 5min 接触时间以及.M NaOH/ 循 (MabSelect) 5min 接触时间以及.M 动态.5 结合量 (mg ATIII/ml)..5. M NaOH.5 M NaOH. M HCl CIP 循环次数. 5 5 CIP 循环次数 图 2. MabSelect SuRe 与 MabSelect 经.1-.5M NaOH 处理 2 个循环后对人抗体的动态结合量 图 3. 经 NaOH 和 HCl 进行 CIP 处理后 Heparin Sepharose 6 Fast Flow 的功能稳定性 27

6 表 4. 操作 清洗和储存介质的 PH 范围 28

7 工作 ph: 介质吸附蛋白或洗脱用的 ph 范围, 在该过程中不会有长期的副作用出现 这和下面脚注为 1-3 表明的条件下出现操作状况有所区别 短期 ph: 介质在功能没有明显改变的情况下进行在位清洗或消毒 ( 室温下 9-4 小时 ) 的 ph 范围 长期 PH: 在功能不发生明显改变的情况下介质的工作 PH 范围 储存 : 推荐防止微生物生长的储存条件 1 不带电的弱离子交换剂 2 没有结合金属离子的介质 3 没有明显的吸附增加 4 ph 小于 3 有时用于洗脱强吸附的 Ig, 然而蛋白配基在极低的 PH 下会发生潜在的降解 5 许多介质通过 2% 乙醇溶液运输, 而使用 NaOH,2% 乙醇可作为替代方法储存介质 乙醇储存可用于含有 SP 配基 (.2M 醋酸钠 ) 和肝素配基 (5mM 醋酸钠,PH7.2) 的产品 此外,2% 苯甲醇可作为候选储存方案 本处提供的数据仅为推荐范围内的总结, 有关层析稳定性和 GE Healthcare 介质泄漏等的详细信息, 请与工业层析或管理机构的专家联系 没有明显的改 变 表明该介质再次通过我们的质量控制部门检测 参考文献 :. Adner, N., Sofer, G. Biotechnology Product Validation, part 3: Chromatography Cleaning Validation. Biopharm 7, (994). 2. Block, S.S Disinfection, Sterilization, and Preservation, Lea & Febiger, Philadelphia (99). 3. PDA Biotechnology Cleaning Validation Committee. Cleaning and Cleaning Validation: A Biotechnology Perspective, PDA, Bethesda, MD (996). ff, G.F. Biotechnology product validation, part 7: validation of chromatography resin useful life. BioPharm (994). 5. Dasarathy, Y. A validatable cleaning in place (CIP) protocol for total DNA clearance from an anion exchange resin. BioPharm (996). 6. MuLV Inactivation (QBI Protocol #32), 989, Quality Biotech Inc., Copewood St., Camden, NJ Taylor, D.M. Inactivation of BSE agent. Dev. Biol. Standard (99). 8. Technology Report No. 3, 99, Quality Biotech Inc., Copewood St., Camden, NJ Jungbauer, A., Lettner, H.P., Guerrier, L., and Boschetti, E. Chemical sanitization in process chromatography, Part 2: In situ treatment of packed columns and longterm stability of resins BioPharm (994).. le: ÄKTAprocess, GE Healthcare, , Edition AA (26). Application note: Sanitization of ÄKTApilot with sodium hydroxide, GE Healthcare, 8-7- Edition AA (23). 2. Application note: Sanitization of BPG columns with sodium hydroxide, GE Healthcare, , Edition AB (22) , Edition AC (23). ow 4 column, GE Healthcare, 4. D revin, I., Johansson, B-L. Stability of Superdex 75 prep grade and Superdex erent chromatographic conditions. J. Chromatogr (99). 5. Johansson, B-L. Determination of leakage products from chromatographic cation. BioPharm 3437 (April 992). 6. Andersson, M., Drevin, I., Johansson, B-L. Characterization of the chemical and functional stability of DEAE Sepharose Fast Flow Process Biochem (993). 7. B erggrund, A., Drevin, I., Knuuttila, K-G., Wardhammar, J., Johansson, B-L. Chemical and chromatographic characterization of a new BioProcess medium for hydrophobic interaction chromatography: Butyl Sepharose 4 Fast Flow. Process Biochem (994). 8. Hellberg, U., Ivarsson, J-P., Johansson, B-L. Characteristics of Superdex prep ltration chromatography of proteins and peptides. Process Biochem (996). 9. P oster: The use of NaOH for CIP of rprotein A media: a 3 cycle study, GE Healthcare (Code No ) le: MabSeclect SuRe, GE Healthcare, --65, Edition AA (24). le: Heparin Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare, , Edition AB (24). 29

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