300 检验医学 2012 年 4 月第 27 卷第 4 期样本, 血液分析仪已能给临床提供足够可靠的结果, 可替代传统的显微镜检查 [2] 但对于有形态异常细胞或者原始幼稚细胞的样本, 检测结果需依赖于显微镜检查所以, 显微镜检查仍是目前白细胞分类无可替代的经典方法 CelaVision DM

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迢籴却
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1 299 文章编号 : (2012) 中图分类号 :R 文献标志码 :A CelaVisionDM96 自动化数字图像分析系统进行白细胞分类的临床应用黄骥斌, 曾婷婷, 郭曼英, 韩秀华, 江 ( 四川大学华西医院实验医学科, 四川成都 ) 虹摘要 : 目的对 CelaVisionDM96 自动化数字图像分析系统 ( 简称 DM96) 的临床性能进行验证及评价方法选取 422 例外周血样本经自动涂片染色后, 采用 DM96 进行白细胞分类, 运用线性回归方法分析仪器结果与人工镜检结果的相关性 ; 计算基于自带参考细胞库和扩充的参考细胞库 DM96 分析软件预分析识别细胞符合率 ; 计算检出率, 分析采集个细胞时仪器识别具有重要临床意义细胞的能力 ; 统计仪器分类与人工镜检所花费的时间结果经过线性回归分析, 中性粒细胞和淋巴细胞的仪器分析结果与人工镜检结果相关系数较大 (0.91 和 0.88), 而单核细胞的相关系数较小 (0.31);DM96 分析软件预分析识别早中晚幼粒细胞原始细胞和变异淋巴细胞的符合率从基于自带参考细胞库的 27.56% 37.96% 41.85% 45.12% 29.76% 提高到基于扩充参考细胞库的 33.23% 56.86% 48.33% 58.08% 31.25%; 分析个细胞中具有重要临床意义细胞检出率分别为 87.50% 92.65% 94.85% 97.59%; 人工镜检花费 (2.50±0.41)min/ 例, 而仪器分析花费 (1.98±0.20)min/ 例, 人工审查确认预分析结果花费 (0.91±0.14)min/ 例 ; 使用初始参考细胞库和扩充参考细胞库分析所需时间分别为 (2.01±0.39) 和 (2.09±0.54)min/ 例, 而随着系统分析细胞数量增多分析所花费的时间显著延长结论 DM96 对白细胞分类的自动化和标准化具有较好的临床应用价值关键词 : 外周血细胞分析 ; 分类 ; 实验室自动化 ; 性能评价 ClinicalapplicationofwhitebloodceldiferentiationofCelaVisionDM96system HUANGJibin,ZENG Tingting,GUOManying,HAN Xiuhua,JIANGHong. (DepartmentofClinicalLaboratory,WestChinaHospital, SichuanUniversity,SichuanChengdu610041,China) Abstract:Objective ToverifyandevaluatetheperformanceofCelaVisionDM96system(DM96).Methods Atotalof422peripheralbloodsampleswerecolectedandpreparedbyautomatedsmearandstainsystem,andthen analyzedbydm96whitebloodceldiferentiation.theresultsofwhitebloodceldiferentiationbydm96werecompared withthosebymanualmicroscopy.thecorelationoftheresultsbydm96andmanualmicroscopywasanalyzedbylinear regresionanalysis.thecoincidencerateofidentifyingcelsbasedonoriginalandenlargedreferencecellibrarieswas calculated.theabilitytoidentifyimportantabnormalitiesthroughanalyzing110,210,310and410celsandthetime costwerecalculated.results Thecorelationcoeficientsofneutrophilsandlymphocyteswere0.91and0.88between DM96andmanualmicroscopyrespectively,whilethecorelationcoeficientofmonocyteswasonly0.31.DM96agreed 27.56%,37.96%, 41.85%, 45.12% and 29.76% forpre diferentiation ofpromyelocytes, myelocytes, metamyelocytes,blastcelsandvariationlymphocytesbasedonoriginalreferencecellibrary,and33.23%,56.86%, 48.33%,58.08% and31.25% based on enlarged referencecellibrary. Theratiosofidentifyingimportant abnormalitieswere87.50%,92.65%,94.85% and97.59% whenanalyzing110,210,310and410cels.ittook (2.50±0.41)minpercasebymanualmicroscopy,(1.98±0.20)minpercasebyDM96and(0.91±0.14)minper casebymanualconfirming.timecostsofanalyzingbasedonoriginalandenlargedreferencecellibrarieswere(2.01± 0.39)and(2.09±0.54) minpercase.withthenumbersofanalyzedcelsincreasing,timecostsincreased simultaneously.conclusions TheclinicalapplicationofDM96couldimprovetheautomatizationandstandardizationof whitebloodceldiferentiation. Keywords:Peripheralbloodcelanalysis;Diferentiation;Laboratoryautomation;Performanceevaluation 白细胞分类计数已经发展了 100 多年, 至今仍是实验室常用的具有重要临床价值的检查方法之一 [1] 随着各种新的血液分析计数仪器和方法的不断产生, 对于正常或仅有细胞数量异常的作者简介 : 黄骥斌, 男,1984 年生, 学士, 技师, 主要从事临床血液学检验工作和研究通讯作者 : 江虹, 联系电话 :

300 检验医学 2012 年 4 月第 27 卷第 4 期样本, 血液分析仪已能给临床提供足够可靠的结果, 可替代传统的显微镜检查 [2] 但对于有形态异常细胞或者原始幼稚细胞的样本, 检测结果需依赖于显微镜检查所以, 显微镜检查仍是目前白细胞分类无可替代的经典方法 CelaVision DM96 自动化数字图像分析系统 ( 简称 DM96) 采用与血液分析仪的流式细胞术完全不同的技术,

2 300 检验医学 2012 年 4 月第 27 卷第 4 期样本, 血液分析仪已能给临床提供足够可靠的结果, 可替代传统的显微镜检查 [2] 但对于有形态异常细胞或者原始幼稚细胞的样本, 检测结果需依赖于显微镜检查所以, 显微镜检查仍是目前白细胞分类无可替代的经典方法 CelaVision DM96 自动化数字图像分析系统 ( 简称 DM96) 采用与血液分析仪的流式细胞术完全不同的技术, 是一种结合传统显微镜检查和现代神经网络技术的新型细胞分析技术, 用于血细胞形态分析, 其优势在于仪器能通过标准化的工作辅助人工镜检, 筛查异常血涂片, 甚至经完善后能够替代人工镜检且其细胞图像完整保存于数据库, 有利于满足后期复查教学等多方面的需求该仪器目前在我国临床应用较少, 我们对 DM96 临床使用做了评估材料和方法一材料 1. 样本随机选取 2010 年 11 月 4 日至 2011 年 1 月 21 日于四川大学华西医院体检中心进行健康体检的血常规样本 200 例门诊或住院患者的血常规样本 222 例, 共 422 例患者样本包括急慢性炎症细菌或病毒感染寄生虫或过敏性疾病再生障碍性贫血急慢性白血病及严重贫血患者的外周血样本 2. 仪器 DM96(CelaVisionAB 公司生产 ); XE 2100 血液分析仪 ( 日本 Sysmex 公司生产 ) 和 SP 1000i 自动涂片染色仪 ( 日本 Sysmex 公司生产 );Alphaphoto 2YS2 双目生物显微镜 ( 日本 Nikon 公司生产 ) 3. 试剂各仪器均使用原装配套试剂 ( 日本 Sysmex 公司生产 ) 和质控物 ; 瑞氏吉姆萨染液购自珠海贝索生物技术有限公司二方法 1. 样本准备样本统一编号, 采用 SP 1000i 自动化涂片染色仪涂片及染色整个样本收集和准备的过程应在 4h 内完成自动化涂片染色仪采用空气干燥和瑞氏吉姆萨染色 2.DM96 工作原理及方法 DM96 由涂片扫描装置和装有 CelaVision 血细胞分析软件的计算机组成外周血涂片装载到该系统后, 仪器开始扫描涂片, 先在 10 物镜下以城垛跟踪方式找到白细胞的单细胞层并锁定, 再于 100 物镜下通过自动对焦进行细胞分割和提取, 拍摄数码照片, 用基于人工神经网络系统 (artificialneutral networks,ann) 的软件进行分析, 识别各种白细胞, 得到白细胞分类计数的预分析结果预分析白细胞的数码照片通过电脑显示器展现在操作者面前, 操作者可以选择接受或修改结果, 通过人工审查后输出 DM96 的最终结果 ( 下称仪器最终结果 ) 见图 1 图 1 DM96 工作界面 3. 人工镜检人工镜检由 2 位具备资格的检验人员 ( 工作年限超过 15 年, 中级或以上技术职称 ), 按照美国临床实验室标准化协会 (CLSI) H20 2A [3] 规定的方法步骤, 分别对同一血涂片在

3 301 显微镜下分类 100 个白细胞, 共分类 200 个细胞 4. 扩充参考细胞库经过具备资质的 2 位检验人员讨论确认的典型形态细胞方可加入参考细胞库 5. 性能评价 (1) 仪器最终结果与人工镜检结果的相关性 ;(2) 基于自带参考细胞库和扩充的参考细胞库的 DM96 预分析识别细胞的能力 ; (3) 增加分析细胞数量后 DM96 识别具有临床重要意义细胞的能力 ;(4)DM96 分析所需时间的统计三统计学方法统计分析采用 Excel(MicrosoftOfice2010, MicrosoftInc.,Redmond,US) 和 SPSS(SPSS18.0, SPSSInc.,IBM,Chicago,US) 软件计量资料采用 x±s 珋表示人工结果与仪器结果的相关性采用线性回归分析, 预分析识别细胞能力采用符合率 ( 人工同意 DM96 预分析结果的细胞数 / 预分析细胞数 ),DM96 对具有重要临床意义细胞的检出能力采用检出率 ( 人工镜检阳性且 DM96 结果也为阳性样本数 / 人工镜检阳性样本数 ) 漏检率 ( 人工镜检阳性而 DM96 结果为阴性样本数 / 人工镜检阳性样本数 ) 等指标采用双侧检验,P< 0.05 表示差异有统计学意义结一仪器最终结果与人工镜检结果的相关性将 422 例仪器分类最终结果与人工镜检分类结果进行相关分析和线性回归分析, 结果见图 2 其中中性粒细胞和淋巴细胞的相关系数较大 (0.91 和 0.88,P<0.01), 而单核细胞的相关系数较小 (0.31,P<0.01) 果图 2 直接镜检与仪器最终结果的散点图二基于自带和扩充的参考细胞库的 DM96 预分析识别细胞能力在使用自带参考细胞库对 200 名健康体检者和 222 例患者样本进行预分析后, 检验人员审查所有细胞数字图片, 人工同意预分析结果的比例见表 1, 总的符合率为 88.38%, 其中淋巴细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞和有核红细胞的预分析符合率均在 90% 以上, 中性粒细胞和单核细胞的预分析符合率也较高 (>70%), 原始幼稚阶段粒细胞及变异淋巴细胞的预分析符合率较低 (<50%) 该仪器在本室运行期间, 发现采用初始细胞库的预分析结果不能满足我室的工作需要, 尤其是对一些具有重要临床意义的细胞结合我室临床标本的实际情况, 我们在使用的最初 3~4 个月里, 不断充实参考细胞库内的参考细胞, 目前的每类参考细胞数量由最初的约 10 个增加到目前的 30~80 个, 新加入的细胞主要为幼稚和原始细

4 302 检验医学 2012 年 4 月第 27 卷第 4 期胞之后, 我们采用新的参考细胞库对 222 例患者样本进行分析, 其识别具有重要临床意义细胞的能力见表 2 与使用初始参考细胞库相比, 幼稚粒细胞原始细胞和变异淋巴细胞的分析符合率均有一定程度的提高其中主要分类错误的细胞为 : 将单核细胞分类为早幼粒细胞 81 个 ; 将中性中幼粒细胞分类为早幼粒细胞 53 个 ; 将中性分叶核细胞分类为中性晚幼粒细胞 35 个 ; 将单核细胞分类为中性晚幼粒细胞 35 个 ; 将早幼粒细胞分类为原始细胞 177 个 ; 将中性晚幼粒细胞分类为原始细胞 101 个 ; 将淋巴细胞分类为变异淋巴细胞 68 个表 1 基于自带参考细胞库 DM96 预分析识别细胞能力细胞类型 DM96 分为人工审查符合率该类细胞相符合的 (%) 总数细胞数中性核粒细胞嗜酸性分叶核粒细胞嗜碱性分叶核粒细胞淋巴细胞单核细胞早幼粒细胞中性中幼粒细胞中性晚幼粒细胞原始细胞 ( 不区分细胞系 ) 变异淋巴细胞浆细胞有核红细胞总计表 2 基于扩充的参考细胞库 DM96 预分析识别细胞能力细胞类型 DM96 分为人工审查符合率符合率该类细胞相符合的 (%) 提高 (%) 总数细胞数早幼粒细胞中性中幼粒细胞中性晚幼粒细胞原始细胞 ( 不区分细胞系 ) 变异淋巴细胞浆细胞有核红细胞三增加分析细胞数量后 DM96 识别具有临床重要意义细胞的能力我们测试了 DM96 识别具有临床重要意义细胞的能力具有重要临床意义细胞的阳性判断标准为 : 早幼粒细胞 + 中性中幼粒细胞 >1% 中性晚幼粒细胞 >2% 原始细胞 >1% 变异淋巴细胞 >5% 浆细胞 >1% 有核红细胞 >1/100 个白细胞将人工镜检作为参考方法, 每个标本分析 110 个白细胞时,222 例患者样本中, 异常样本检出 119 例, 漏检 17 例, 检出率为 87.50%, 漏检率为 12.50% 进一步查找漏检的原因,17 例样本中,11 例仅有 2.5% ~3.5% 的中性晚幼粒细胞, 且均为感染病例 ;4 例有核红细胞 <1 个 /100 个白细胞 ;2 例将原始细胞错误的划分到变异淋巴细胞, 且比例 <1% 而分析细胞数量为个时, 漏检的样本数量分别为个, 检出率为 92.65% 94.85% 97.59% 四仪器分析花费时间分析人工镜检花费 (2.50±0.41)min/ 例, 而仪器分析 ( 从将血涂片装载入仪器开始至预分析完成为止 ) 花费 (1.98±0.20)min/ 例, 人工审查确认预分析结果花费 (0.91±0.14)min/ 例, 大大节省检验师所花费的时间使用初始参考细胞库和扩充的参考细胞库分析花费的时间分别为 (2.01± 0.39) 和 (2.09±0.54)min/ 例而完成分析个白细胞花费的时间分别为 min/ 例, 时间随着分析的细胞数的增加而显著延长讨 DM96 使用标准化分析程序, 对于分析的区域和路径都预先做好了设定, 降低了分析区域不同造成的误差同时,DM96 预分析后所有细胞图像按照预分析结果排列于屏幕上, 因此检验人员可以很快确认或对其中认为分析结果有误的细胞重新分类检验师认可 DM96 预分析细胞的总比例为 89.37%, 较文献报道略高 (82%) [4 5] 与 1977 年美国病理学家协会 (CAP) 组织进行的白 [6] 细胞分类研究比较,DM96 对淋巴细胞嗜酸性分叶核细胞的分类能力比人工分类的能力高或相当, 其他类型细胞则稍差将仪器分析的最终结果与检验人员直接在显微镜下的分类结果相比较, 两者的回归系数在不同类细胞间差距很大 (0.3~0.9), 在外周血片中出现频率低的细胞 ( 单核细胞 ) 相关性较差, 该结果与文献报道基本相当 [7] 与不同检验师分类论

5 303 [8] 结果之间的相关系数相比,DM96 与人工分类结果的相关系数在中性分叶核粒细胞嗜碱性分叶核细胞和淋巴细胞中较高在 DM96 临床应用中发现, 参考细胞库的容量会影响细胞预分析结果的符合率在使用扩充的参考细胞库预分析时, 具有重要临床意义细胞的分析符合率较使用初始参考细胞库时有明显的提高由此提示, 在实际工作中需要不断完善参考细胞库以提高预分析结果的符合率在实际工作中, 识别样本出现具有临床重要意义的细胞, 是各种分类方法可靠性的决定性因素之一 [9] 如何提高检出率降低漏检率的发生是各种方法着力探讨的问题之一经过试验证实, 增加 DM96 分类的细胞数量可以有效地减少漏检的发生, 但是并不是无限的增大细胞后漏检就能完全避免我们发现当分类的白细胞由 110 个增加到 410 个, 具有重要临床意义的细胞漏检率明显降低 ( 由 12.5% 降低到 2.41%), 而仪器分类的时间明显延长 ( 由 2.89min/ 例延长到 5.59min/ 例 ) 这一点提示在临床使用 DM96 时, 应该根据患者的情况对系统的参数做出调整, 如遇到高危科室, 如血液科患者时, 应当适当增加分类细胞的数量, 以期提高检出率, 避免漏检目前 DM96 在国内应用较少, 多数使用过的检验人员认为该仪器拍摄的细胞图像与显微镜下直接观察到的细胞形态有一定差别, 如 DM96 拍摄的单核细胞图像较显微镜直接观察到的细胞颗粒更明显, 而胞核折叠感欠显著等, 这些差别使得检验人员在初次使用该仪器时判断细胞分类有一定困难这可能是造成预分析符合率不尽如人意的原因之一因此, 检验人员在熟悉 DM96 拍摄的细胞图像形态特征后可进一步提高预分析符合率另外在实践时间上, 人工镜检花费时间是使用 DM96 花费人工时间的近 3 倍使用 DM96 时, 在血涂片装载好后仪器即开始自动预分析, 此段时间内, 检验人员可以离开进行其他工作待其预分析完毕后, 检验人员可以在荧幕上快速对仪器已初步分类的结果进行核对和纠正对于非急诊的样本, 可以集中审查复片结果, 从而大大节省了检验人员花费的时间, 提高了员工的工作效率综上所述,DM96 作为一种图像分类系统, 其分类原理更接近于人工直接镜检的方法对于外周血中数量和百分比高的细胞具有良好的辨识度, 其分类结果与人工分类相关性良好虽然目前 DM96 仍然与预期有差距, 但是经过参考细胞库的完善和分类细胞数的调整可以进一步提高预分析的符合率和具有重要临床意义细胞的检出率因此, 我们认为 DM96 在白细胞分类自动化和标准化上具有较好的临床应用价值由于单个实验室的样本及本次研究时间有限, 尽管已经进行扩展, 所应用的参考细胞库仍存在局限性, 因此多中心联合共享和丰富细胞库在未来的应用中十分必要参考文献 [1] TatsumiN,PiereRV.Automatedimageprocesing. Past,present,andfutureofbloodcelmorphology identification[j].clinlabmed,2002,22(1): [2] SimsonE,GronerW.Thestateoftheartforthe automatedwbcdiferential[j].labhematol,1995, 1(1): [3] ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.Reference leukocyte(wbc) diferentialcount(proportional) and evaluation ofinstrumentalmethods; approved standard secondedition[s].h20 2A,CLSI,2007. [4] KratzA,BengtsonHI,CaseyJE,etal.Performance evaluation ofthecelavision DM96 system: WBC diferentials by automated digital image analysis supportedbyanartificialneuralnetwork[j].am J ClinPathol,2005,124(5): [5] BriggsC,LongairI,SlavikM,etal.Canautomated bloodfilmanalysisreplacethemanualdiferential?an evaluationofthecelavisiondm96automatedimage analysissystem[j].intjlabhematol,2009,31(1): [6] KoepkeJA.Adelineationofperformancecriteriafor thediferentiation ofleukocytes[j]. Am JClin Pathol,1977,68(1Suppl): [7] CeelieH,DinkelaarRB,VanGelderW.Examination ofperipheralbloodfilmsusingautomatedmicroscopy; evaluationofdifmasteroctaviaandcelavisiondm96 [J].JClinPathol,2007,60(1): [8] KoepkeJA,DotsonMA,ShifmanMA.A critical evaluationofthemanual/visualdiferentialleukocyte countingmethod[j].bloodcels,1985,11(2): [9] InternationalSocietyforLaboratoryHematology.Consensus guidelines:positivesmearfindings[eb/ol].( )[ ].htp:// index.php?page=consensus_smear. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 范基农 )

福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析

福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析福建农业学报林甦朱春华陈珍刘斌琼施少华江斌蔡国漳林羽黄瑜甦男硕士助理研究员主要从事病毒学和动物传染病学研究福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析林甦等鸡亚型白血病病毒荧光定量检测方法的建立福建农业学报讨论林甦等鸡亚型白血病病毒荧光定量检测方法的建立责任编辑