皮肤性病诊疗学杂志 2012 年 12 月第 19 卷第 6 期 353 1,tetM genotypesofclinicalisolatesofneiseriagonorhoeaefrom4citiesinguangdongprovince in2011.methods:theagardilut

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家黎
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1 352 淋球菌对头孢克肟等 6 种抗生素敏感性及耐药质粒分型研究论著吴兴中 1, 郑和平 1, 李燕娃 2, 黄澍杰 3, 陈少楠 4, 郭炽星 5, 黄进梅 1, 覃晓琳 1, 薛耀华 1, 曾维英 1, 蓝银苑 1, 李奕歆 1 1, 唐三梅 (1. 广东省皮肤病医院, 广东广州 ;2. 佛山市皮肤病防治所, 广东佛山 ;3. 江门市皮肤医院, 广东江门 ;4. 肇庆市皮肤病医院, 广东肇庆 ;5. 广州市番禺区慢性病防治站, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 检测 2011 年广东省广州佛山江门肇庆四市临床分离的淋球菌流行株对青霉素四环素环丙沙星头孢克肟头孢曲松和大观霉素等 6 种抗生素的敏感性, 对质粒介导的产 β 内酰胺酶淋球菌 (PPNG) 和四环素高水平耐药淋球菌 (TRNG) 进行耐药质粒 TEM 1 和 tetm 基因分型方法 : 采用琼脂稀释法测定菌株对 6 种抗菌药物的最小抑菌浓度 (MIC), 判断敏感性按 WHO 西太区淋球菌耐药性监测统一标准, 其中头孢克肟敏感性试验和判断标准按美国临床和实验室标准化研究所 (CLSI) 判断用纸片酸度法检测产 β 内酰胺酶淋球菌 (PPNG) 菌株, 多重 PCR 方法鉴定 β 内酰胺酶质粒并进行 TEM 1 和 TRNGtetM 基因分型结果 : 来自四市 429 株淋球菌中检出青霉素耐药 364 株 (84 8%), 四环素和环丙沙星耐药株 ( 率 ) 分别为 389 株 (90 7%) 和 418 株 (97 4%), 未发现对大观霉素头孢克肟和头孢曲松耐药菌株, 但头孢曲松低敏率达到 34 0%(146/429), 头孢克肟低敏只有 1 株 (0 2%) 青霉素四环素和环丙沙星的 MIC 50 均已超过耐药标准检出 PPNG 株 156 株 (36 4%),TRNG 株 201 株 (46 9%) 耐药质粒 TEM 1 基因分型以亚洲型为主 (94 9%,148/156), 只有 8 株携带非洲型质粒 ;tetm 基因分型均为荷兰型结论 : 四市淋球菌对青霉素四环素和环丙沙星耐药率较高, 对大观霉素头孢克肟和头孢曲松的敏感性较高,TEM 1 基因质粒分型以亚洲型为主,tetM 基因分型均为荷兰型 [ 关键词 ] 奈瑟氏球菌, 淋病 ; 微生物敏感性试验 ; TEM 1 [ 中图分类号 ] R759 [ 文献标识码 ] A DOI: /j.isn InVitroSusceptibilityto6AntimicrobialAgentsandtheResistancePlasmidsGenotypeof NeiseriagonorhoeaeIsolatesfrom 4CitiesinGuangdong WUXing zhong 1,ZHENGHe ping 1,LIYan wa 2,HUANGShu jie 3,CHENShao nan 4,GUOChi xing 5,HUANGJin mei 1,QINXiao lin 1,XUEYao hua 1,ZENGWei ying 1,LANYin yuan 1,LI Yi xin 1,TANGSan mei 1 (1.GuangdongProvincialCenterforSkinDiseasesandSTIsControlandPrevention,Guangzhou ,China;2.FoshanInstituteofDermatology,Foshan528000,China;3.JiangmenHospi talofdermatology,jiangmen529030,china;4.zhaoqinghospitalofdermatology,zhaoqing ,China;5.PanyuInstituteforChronicDiseases,Guangzhou511400,China) Corespondingauthor:ZHENGHe ping,e mail:hpzheng@21cn.com [Abstract] Objective:Toasestheinvitrosusceptibilityto6antimicrobialagentsandTEM 基金项目 : 广东省医学科研基金项目 ( 编号 :B ) 通信作者 : 郑和平,E mail:hpzheng@21cn.com

2 皮肤性病诊疗学杂志 2012 年 12 月第 19 卷第 6 期 353 1,tetM genotypesofclinicalisolatesofneiseriagonorhoeaefrom4citiesinguangdongprovince in2011.methods:theagardilutionmethodwasusedtodeterminetheminimuminhibitorycon centrations(mics)tosixantibiotics,peniciling,tetracycline,ciprofloxacin,cefixime,ceftriax oneandspectinomycin.thesusceptibilityofalstrainstofiveantibioticswasinterpretedaccording tocriteriaadoptedintheprojectofsurveilanceofgonococcalantibioticsusceptibilityinthewho WesternPacificRegionandcefiximesusceptibilitywasinterpretedasClinicalandLaboratory StandardsInstitute(CLSI).Penicilinase(β lactamase) producingn.gonorhoeae(ppng) wasanalysedbythepaperacidometricmethod.amulti PCRwasusedtodistinguishsubtypesof TEM 1andtetM.Results:429strainsofN.gonorhoeaecolectedfrom Guangzhou,Foshan, JiangmenandZhaoqininGuangdongprovincewerestudied.364isolates(84 8%)showedresist ancetopenicilin.theprevalenceoftetracycline andciprofloxacin resistancewas90 7% and 97 4%,whilenoneofthestrainsappearedtoberesistanttospectinomycin,cefiximeandceftriax one,respectively,but146(34 0%)and1(0 2%)showedreducedsensitivitytoceftriaxoneand cefixime.mic50andmic90ofpenicilin,tetracyclineandciprofloxacinweresignificantlyhigher thanresistantstandards.156(36 4%)strainswerePPNGand201(46 9%)strainswereTRNG. SubtypingofTEM 1geneinβ lactamaseplasmidsofppngshowedthat148(94 9%)PPNGs cariedtheasian typeplasmidswhileafrican typeplasmidwasfoundinonly8strains.subtyping oftetm geneshowedthatal201trngsweredutchvariant.conclusion:resistancetopenicil lin,tetracyclineandciprofloxacinspreadsseriouslyinfourcitiesofguangdongprovince.theiso latesofn.gonorhoeaeshowbetersusceptibilitytospectiomycin,cefiximeandceftriaxone.the Asian typeβ lactamaseplasmidsaredominantinppng,whileafrican typeplasmidissporad ic.alofthetrngscarythedutchvariantplasmid. [KeyWords] Neiseriagonorhoeae; Microbialsusceptibilitytests; TEM 1 有效的抗生素治疗是治愈淋病和遏制淋病播散的重要途径, 随着淋球菌的耐药性的变化和耐药质粒流行株的扩散, 临床选用抗生素显得日益重要为了解广东省四市 2011 年度淋球菌流行株的耐药性和产 β 内酰胺酶淋球菌 (PPNG) 耐药质粒 TEM 1 以及四环素高水平耐药淋球菌 (TRNG)tetM 基因分型情况, 对广州佛山江门和肇庆四市临床分离的 429 株淋球菌流行株测定了 6 种抗生素的最小抑菌浓度 (MIC) 以及进行了 TEM 1 以及 tetm 基因分型的研究, 现将结果报告如下 1 材料与方法 1.1 菌株临床菌株 429 株淋球菌由四市性病门诊患者的泌尿生殖道分泌物中分离得到, 男性标本自尿道口内 3cm~4cm 处, 女性由宫颈口内 1 cm~2cm 处取材, 接种于选择性培养基 (TM), 所有菌株经革兰染色氧化酶和过氧化氢酶试验及糖发酵试验确证后冻存备用质控菌株 PPNG 阳性和阴性质控菌株 (WHOJ 和 WHOD 株 ), 由中国 CDC 性病艾滋病控制中心赠送质粒分型标准质粒由加拿大 Jo AnneR.D 教授赠送 1.2 抗生素大观霉素 ( 普强公司 ) 头孢曲松 (Roche 公司 ) 青霉素 (SmithKline 公司 ) 四环素 (Sigma 公司 ) 和环丙沙星 (BayerLeverkusen 公司 ) 等 5 种抗菌药物均为标准品, 由中国 CDC 性病控制中心提供头孢克肟标准品由中国药品生物制品检定所提供 1.3 培养基 GC 基础培养基 (OXOID 公司 ) 加入 10% 新鲜羊血 1.4 标准菌株 6 株淋球菌标准菌株 D G J L 由中国疾病预防控制中心性病控制中心赠送, 其中 D G L 株

3 354 为产 β 内酰胺酶阴性菌株,J 株为产 β 内酰胺酶 (PPNG) 菌株 1.5 试剂及仪器 TaqDNA 聚合酶,10 Bufer MgCl 2 dntp 等 PCR 试剂购自宝生生物工程 ( 大连 ) 有限公司 DNA 相对分子质量标准标记物购自立陶宛 Fer mentas 公司 PCR 引物由上海 Invitrogen 生物工程公司合成 PCR 仪为美国 PEPKINELMER 公司产品, 电泳仪为美国 Bio Rad 公司产品, 凝胶成像系统为法国 Bio print 公司产品 1.6 方法菌株对抗生素敏感性测定采用 WHO 西太区淋球菌耐药监测规划协作组推荐的琼脂稀释法测定最小抑菌浓度 (MIC) [1] 先将各抗生素用适当的缓冲液溶解, 配成溶液, 再倍比稀释, 各抗菌药物在培养基平皿上的最终浓度分别为 : 青霉素四环素和环丙沙星均为 0 03μg/mL~32 μg/ml, 头孢曲松 0 001μg/mL~1μg/mL, 大观霉素 0 5μg/mL~128μg/mL 试验菌株和标准菌株先在无选择性培养基 (GC) 上传代 2 次, 用 16~18 小时的新鲜培养物制成 107~108cfu/mL 的菌悬液, 用多头点接种器蘸取菌液接种于各抗生素琼脂平皿, 经 35 培养 24 小时观察结果, 以能抑制淋球菌生长的最小药物浓度为该药的最小抑菌浓度 (MIC) 每批试验均由标准菌株作质控, 按 WHO 西太平洋地区淋球菌耐药监测项目推荐的标准判断药物敏感性 [1], 头孢克肟敏感性试验和判断标准按美国临床和实验室标准化研究所 (CLSI) 判断 [2], 并统计出 MIC 50 和 MIC 产 β 内酰胺酶淋球菌 (PPNG) 测定采用纸片酸度法 [3] 以标准菌株 J 株作为阳性对照, 标准菌株 D 株为阴性对照 PCR 模版 DNA 的提取取 GC 培养基上纯培养 18h 淋球菌, 用灭菌水配成菌悬液, 浓度相当于 1 个麦氏单位, 取该菌悬液 100μL 离心去掉灭菌水, 加入 50μL 裂解液,100 沸水浴 10 min, 冷却后以 10000r/min 的速度在低温离心机中离心 5min, 上清液即为 DNA 模板, 将上清液转移到一干净无菌微量离心管,-20 保存备用多重 PCR 采用 Palmer 多重 PCR 方法测定 TEM 1 基因型 [4] 引物包括 :BL1:5 TACT CAATCGGTAATTGGCT 3, BL2:5 CACCTATA AATCTCGCAAGC 3,BL3:5 CCATAGTGTTGAG TATTGCGAA 3,BL4:5 TCATTCGTGCGTTCTAG GA 3 ;tetm 基因型引物包括通用正向引物 (UF):5 TCGGACAAGCGGAAAGC 3, 反向引物美国型 (AR):5 GCATTACACATCCCTAC 3, 反向引物荷兰型 (DR):5 TGCAACAGAGTGAGG 3 反应总体系 25 μl, 包括 Taq 酶 (5U) 0 125μL,dNTP(2 5μmol)2μL,10 PCR 缓冲液 2 5μL, 引物 (10μM) 各 0 5μl, 模板 DNA 2μL PCR 反应条件 : 预变性 94,3min; 变性 94,15s; 退火 64,15s; 延伸 72,1min;30 个循环每批试验作阴性和阳性对照 PCR 扩增产物以 0 8% 琼脂糖凝胶中进行电泳后, 紫外分析仪观察结果, 最后用 BIO PRINT 凝胶成像系统观察并照相 2 结果 2.1 MIC 测定结果青霉素耐药株为 364 株 (70%), 四环素和环丙沙星耐药株分别为 389 株 (90 7%) 和 418 株 (97 4%), 青霉素四环素和环丙沙星的 MIC 50 及 MIC 90 均已超过耐药标准未发现对头孢曲松和大观霉素耐药株, 头孢曲松低敏率为 34 0%(146/ 429), 头孢克肟低敏只有 1 株 (0 2%) 见表 1 表株淋球菌对 6 种抗生素的敏感性抗菌药物敏感性 [ 株 (%)] MIC(μg/mL) 敏感中敏耐药 MIC 50 MIC 90 MIC 范围青霉素 10(2.3) 55(12.8) 364(84.8) 2 >32 <0.125~>32 四环素 40(9.3) 389(90.7) 4 >32 <0.125~>32 环丙沙星 2(0.5) 9(2.1) 418(97.4) 8 16 <0.25~32 头孢克肟 428(99.8) 1(0.2) 1) <0.001~0.5 头孢曲松 283(66.0) 146(34.0) 0(0) <0.001~0.5 大观霉素 429(100) 0(0) 0(0) <0.5~64 注 :1):1 株淋球菌头孢克肟 MIC=0 5μg/mL

4 皮肤性病诊疗学杂志 2012 年 12 月第 19 卷第 6 期 PPNG 及 TEM 1 基因质粒和 TRNG 及 tetm 基因分型检测结果检出 PPNG 株 156 株, 阳性率为 36 4%, TRNG 株 201 株, 阳性率为 46 9% TEM 1 基因质粒分型检测出亚洲型质粒 148 株, 占 94 9%,8 株携带非洲型质粒, 占 5 1%;tetM 基因分型均为荷兰型 3 讨论头孢菌素作为治疗淋病的一线药物, 一直受到临床医师的青睐, 但近年来其敏感性受到了挑战,2009 年日本东京从淋球菌咽炎患者中分离出一株对头孢曲松耐药淋球菌 [5],2008 年中国淋球菌耐药监测网监测的头孢曲松低敏率 47 42% [6], 本次对广东省四市淋球菌耐药性监测中发现头孢曲松低敏率达到 34 0%, 而美国淋球菌耐药监测项目 (GISP) 报道的头孢曲松低敏率只有 0 5% [7], 澳大利亚报道头孢曲松低敏率 1 1% [8], 虽然本次监测尚未发现头孢曲松耐药株, 但低敏率偏高, 应引起足够重视, 治疗时应注意剂量和疗效, 防止头孢曲松耐药株在本省出现头孢克肟是第三代口服头孢菌素类抗生素, 是美国 CDC 淋病治疗方案推荐的口服三代头孢菌素类药物, 根据 GISP 报告, 头孢克肟的敏感性在快速下降, 其最低抑菌浓度 (MIC) 值 0 25μg/mL 的菌株分离率, 由 2006 年的 0 1% 上升到 2011 年上半年的 1 7% [7] 在我省及国内临床医师首选头孢曲松用于治疗淋病, 很少选用第三代口服的头孢克肟头孢克肟的 MIC 耐药折点没有被定义, 但美国临床和实验室标准化研究所 (CLSI) 认为其 MIC 值应 0 5μg/mL 为敏感, 本次监测只检测出一株 MIC 值等于 0 25μg/mL, 检出率为 0 2%(1/429), 其 MIC 50 和 MIC 90 分别为 0 03μg/ ml 和 0 125μg/mL, 均处在敏感范围大观霉素的耐药株较为少见, 据报道近年国内陕西和山东偶见有大观霉素耐药株出现, 但其耐药率介于 1 97% ~2 78% [6,9], 本次监测尚未发现大观霉素耐药株, 大观霉素的 MIC 90 为 32μg/mL, 处在敏感范围青霉素四环素和环丙沙星耐药率分别为 84 8% 90 7% 和 97 4%,MIC 结果分析显示四环素和环丙沙星的 MIC 50 分别超过耐药标准的 4 倍及大于 32 倍和 8 倍及 16 倍青霉素的 MIC 50 也超过了耐药标准提示青霉素四环素和环丙沙星已不能作为治疗淋病的主 [10] 要药物与国内的一些报道类似 PPNG 和 TRNG 是由质粒介导的耐药性, 耐药质粒可以在同种菌属甚至在不同菌属间传递造成耐药质粒的广泛播散和高水平的耐药性, 使得淋病的防治形势愈加严峻连续监测数据表明广州地区 PPNG 流行率从 2000 年的 17 1% 增加到 2008 年的 42 1% [11],TRNG 流行率由 2000 年的 20% 上升到 2006 年的 43 6% [12],2008 年全国淋球菌耐药性监测报道 PPNG 和 TRNG 的流行率分别为 51 21% 和 34 91% [6] 本省四地 2011 年度的 PPNG 检出率达到 36 4%,TRNG 检出率达到 46 9% 表明 PPNG 和 TRNG 在本省四地处于较高的流行率对 156 株 PPNG 进行 β 内酰胺酶 TEM 1 基因耐药质粒分型研究显示有 148 株 PPNG 携带亚洲型质粒, 占 94 9%,8 株携带非洲型质粒 (5 1%), 说明广东四地流行 PPNG 以携带亚洲型质粒为主, 国外的研究表明来自亚洲地区的 PPNG 流行株主要携带亚洲型质粒为主的结果相似 [13], 国内上海报道的 PPNG 流行株也是以亚洲型质粒为主 [14], 而亚洲区以外以非洲型质粒流行为主, 如加拿大报道 59 9%PPNG 流行株携带非洲型质粒 [15] 有 8 株 (5 1%)PPNG 携带非 [11] 洲型耐药质粒, 与广州地区报道的 2000~2008 年 230 株 PPNG 中只发现 1 株非洲型质粒相比, 似乎非洲型耐药质粒有进一步播散的迹象 TRNG 株 tetm 基因介导对四环素高度耐药,tetM 基因可分为美国型和荷兰型两种变型, 本次监测发现所有 201 株 TRNG 菌株均为荷兰型, 与南京 [16 17] [13] 和四川等地区报道相似, 与 Turner 报道所有来自东南亚地区分离的 TRNG 分离株均为荷兰型 tetm 基因的研究结果相同 [ 参考文献 ] [1] WorldHealthOrganization.SensitivtytestingofNeiseria gonorhoeae:methodologiesforusebyparticipantsinthe WHOWesternPacificRegionalSurveilanceProgramme [S].In:WHO/WPR RegionalAntimicrobialSurevil lanceworkinggroupmeetingproceedings,1992:33. [2] ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.M100 S15 Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytes ting;fifteenth informationalsupplement[s]. Wayne, Pa.ClinicalandLaboratorystandardsInstitute,2010. ( 下转第 358 页 )

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. 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" # $ %&'$!!"! )0 #! $ # 2! 2 & $! 4$ $2 7& 2& 0 # & " 2 &!! &!!& ( & 2& $ &2 4 "2& &#!""! 4 0 8# $2 4 "2& & )0

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