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拟连
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1 MALDI-TOF/TOF MS 基础与应用微生物研究所孙树涛

2 内容概要质谱技术发展回顾 MALDI-TOF/TOF MS 构造与原理分析策略和实验流程样品前处理数据检索和结果分析 MALDI-TOF/TOF MS 应用 2

3 质谱技术发展回顾 1906 年,J.J.Thompson 因发明质谱技术并用以研究气体的电导获得诺贝尔物理奖 ; 1922 年,F.W.Aston 因用质谱仪发现了非放射性元素同位素获得诺贝尔化学奖 ; 1980 年,W.Paul 因发明离子阱质谱原理和技术获得诺贝尔物理奖 ; 1996 年,R.E.Smally 等因用质谱发现 C60 获得诺贝尔化学奖 ; 2002 年,J.B.Fenn,K.Tanaka 因发明生物大分子质谱电离技术获得诺贝尔化学奖 3

4 质谱样品在离子源内电离, 产生的各种离子经过质量分析器按其质荷比 (m/z) 分离, 并依次被检测器检测并记录下来, 形成一个按顺序记录各种质荷比 (m/z) 离子相对丰度的谱图特点 Sensitivity Speed Specificity Stoichiometry 灵敏度的比较分析方法 NMR IR GC UV MS 检测灵敏度 (g) 10-3 ~ ~ ~ ~ ~

5 质谱仪器基本构造离子源质量分析器离子检测器进样系统真空泵信号处理 m/z 5

6 离子源生物大分子的电离 MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization 基质辅助激光解吸离子化 ESI Electrospray ionization 电喷雾电离 6

7 质量分析器电磁扇型双聚焦质谱仪 (Magnetic Sector) 飞行时间质谱仪 (TOF, time of flight) 四极杆质谱仪 (Quadrupole) 离子阱质谱仪 (Ion trap) 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪 (FT ICR) 静电场轨道阱质谱仪 (Orbitrap) 7

8 飞行时间质谱 TOF (time of flight) 线性模式 (linear mode), 分辨率较低 ; 反射模式 (reflectron mode), 分辨率高反射镜片激光器衰减镜片样品靶离子源离子检测器反射模式反射板飞行管离子检测器线性模式 KE= qv = 1/2 mv 2 v = (2qV/m) 1/2 t = L/v =L / (2V/m/q) 1/2 m/z = m/q = 2V t 2 / L 2 8

9 串级质谱 (MS/MS) 串联质谱是通过对选定某个 m/z 母离子反应产物的分析, 对目标化合物进行断裂机理或结构鉴定等方面的研究 Ion source Detector Selection Activation Mass analysis MS1 Collision Cell MS2 9

10 基础概念分辨率 (Resolution) 信噪比 (S/N) R = M Δ M 灵敏度 (Sensitivity) 最低检测限 fmol,amol M M m o 质量精度 (Accuracy) ppm 稳定性 (Stability) 单同位素质量 (Monoisotopic mass) 质荷比 (m/z) M + z z 10

11 常用基质 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid CHCA a- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 2,5-Dihydroxybenzoic acid DHB 2,5- 二羟基苯甲酸 Sinapinic acid SA 芥子酸 CHCA 主要用于 20KDa 以下的蛋白质 DHB 和 SA 可用于 20KDa 以上的蛋白质低质量区 (<700Da) 基质背景信号干扰 11

12 纳米材料作为基质七种氨基酸混合溶液的 MALDI 质谱 12

13 MALDI-TOF/TOF MS 特点可得到 MS/MS 谱, 得到肽段氨基酸组成信息分辨率高 ~20000 灵敏度高 ~fmol,amol 分析速度快, 通量高质量精度高 ~20ppm 分子量测量范围大 ~200000Da 对样品中的盐等杂质有一定的容忍性 13

14 MALDI-TOF/TOF MS 的应用范围分子量测定蛋白多肽脂类糖类寡聚核苷酸天然产物等蛋白质鉴定 1D, 2D-GE 单一蛋白溶液酶解液蛋白质翻译后修饰 (PTM) 研究疾病诊断 Biomarker 筛选 14

15 基于质谱的蛋白质组分析策略获取样品样品前处理 ( 提取分离 ) 质谱鉴定数据检索评估整合得到结果 Cells Tissues Plasma Urine Protein extraction Protein separation Digestion Peptide separation PTM enrichment TOF TOF-TOF Ion trap FT-ICR Orbitrap Databases MASCOT SEQUEST Identification Quantification Function INPUT 15

16 基于质谱的蛋白质组学实验流程 2D-GE 2D-Gel Electrophoresis Protein Mixture Digestion MutPIT Shotgun In-Gel Digestion Peptide Mixture MALDI-TOF/TOF MS HPLC- MS/MS 2D-HPLC (SCX+RP) -MS/MS Database Search Proteins 16

17 定量 15 N metabolic label Cell State 1 Cell State 2 15 N/ 14 N combine 14 N unlabeled SILAC Cell Lysis Cell Lysis Chemical tag-d Digestion Tag combine Digestion Chemical tag-h ICAT Chemical tag-d Tag combine Chemical tag-h itraq Relative Abundance MutPIT or 2D-GE MS/MS Cell State 1 Cell State Time (min) Label Free 17

18 样品处理注意事项用进口的离心管防止皮肤头发的角蛋白 ( 戴无粉手套 ), 及 BSA 污染制备过程中防止发生修饰和降解水的纯度 : 二次去离子水, 电阻率 18MΩ cm 不希望有钠钾加合离子常用溶剂 : 水乙氰乙醇甲醇丙酮甲酸三氟乙酸等避免使用 SDS Triton CHAPS 等去垢剂, PEG 等聚合物对质谱信号造成严重干扰的物质 18

19 样品分子量测定待分析的蛋白样品处于溶解状态或冻干粉, 要求不含盐, 不含去垢剂提供样品浓度为几十 pm/μl, 一次提供样品 10μL 左右即可送样要求 : 检测目的, 样品来源制备方法溶剂可能混有成分分子量范围蛋白鉴定单一蛋白, 考染能见的条带需把蛋白溶液或胶内酶切成 Da 左右的肽段染色的样品需先清洗脱色还原烷基化酶切送样要求 : 蛋白物种来源检测目的制备方法溶剂可能混有成分 19

20 MALDI-TOF MS 可容忍的最高浓度 Urea Guanidine-HCl Glycerol Alkali metal salts Tris buffer 0.05M NH 4 HCO M Phosphate buffer SDS, CHAPS, PEG, Triton 0.5M 0.5M 1% 0.02M 0.01M 需去除 20

21 去除杂质干扰, 浓缩样品超滤较多量样品过固相萃取柱 (SPE) 微量样品过 ZipTip 柱 C18 去除 peptide,protein(<50kda),oligonucletides 样品中盐的干扰及浓缩 C4 蛋白质 (20KDa-100KDa) 除盐及浓缩 SCX 去除样品中去垢剂及浓缩样品 21

22 数据采集点靶记录样品点在靶上位置 A1-H24 选择采集方法采集数据导出数据搜索数据库分析数据 22

23 蛋白质鉴定指纹谱 (PMF, peptide mass fingerprint) 蛋白质经酶切位点专一的蛋白酶水解后得到肽段混合物, 经过质谱分析得到的质谱图由于组成不同蛋白质的氨基酸序列不同, 酶解后产生的肽段也不相同, 其肽段混合物质量数具有特征性, 所以称肽质量指纹谱优点 : 是蛋白质鉴定的经典方法, 算法简单, 速度快, 在串联质谱鉴定出现之前应用广泛缺点 : 质量相近的多肽增加匹配难度, 并且无法实现混合蛋白的鉴定, 不太适合数据库不完整的物种的蛋白质鉴定, 不能分析到翻译后修饰位点 23

24 PMF 谱图示例 24

25 二级谱图 (MS/MS) 可提供结构组成信息, 可用于对蛋白分离效果较差的样品原理 : 对一个或者多个未被解析的肽段 MS/MS 数据进行对数据库比较从而进行蛋白鉴定优点 : 是目前应用最广的高通量鉴定蛋白质方法, 鉴定准确度更高, 无需人工序列解析, 可以实现混合蛋白的鉴定缺点 : 增加了一步操作, 对仪器要求更严格 25

26 MS/MS 谱图示例 26

27 MS/MS 肽段断裂的碎片命名规则 CID ETD 27

28 数据库检索 Mascot Local Server PMF 数据库搜索时, 将数据库中的蛋白序列理论酶切成肽段, 计算其理论图谱, 与实验图谱进行比对得到结果扣除基质本底酶自切和角蛋白污染峰理论酶切选取酶 ( Da) 理论数据与实验谱图进行比对 28

29 PMF 检索界面 29

30 MS/MS 检索界面 30

31 PMF 检索结果示例 (continued) 31

32 32

33 Mascot PMF 分数算法基于概率, 显著性分析 S = -10*Log(P), P: 比对匹配的一个随机事件的可能性大小 P=E/N,E= 期望值, N= 数据库中蛋白质数目的大小 33

34 MS/MS 检索结果示例 34

35 35

36 36

37 37

38 38

39 39

40 40

41 MS/MS 分数算法不同于 PMF 打分原则, 将匹配离子打分, 再得到蛋白分数算法复杂 41

42 检索结果分析一个点鉴定得到多个蛋白的选择 : 一般选择得分最高的蛋白, 但是如果得分最高的蛋白功能不明确 (unknown or hypothetical), 同时得分稍低一些的蛋白与最高分差别不大且功能相对明确, 也可以选择得分稍低一些的蛋白 MS/MS 以 peptide summary 结果为主, 碎片离子可信度高, 再结合 protein summary 分析看碎片离子峰匹配状况, 匹配越好越可信鉴定到的蛋白可以结合其它 ( 如 pi, Mw) 等信息有的鉴定到的结果差别较大 : 很多翻译后修饰蛋白提取及电泳过程中的人为修饰以及蛋白降解可变剪切等造成此现象, 与质谱鉴定结果的好坏无关 42

43 一级质谱鉴定和二级质谱鉴定如何选择首先, 一级质谱专一性信息少, 只适用于有完整非冗余基因组序列或者蛋白序列的物种鉴定, 对于大库检索 ( 比如哺乳动物总库 ), 随着库容量的增加, 其特异性越差, 结果越不可靠二级质谱提供的专一性信息多, 即使对于大库检索, 其鉴定结果也很可靠二级质谱鉴定所有物种 ( 包括有完整基因组信息的测序物种 ) 也是一种质谱鉴定的趋势 43

44 Denovo 难, 对样品仪器要求高解析 MS/MS 谱图要很有经验 44

45 MALDI-TOF/TOF MS 应用举例肝癌 / 健康人血清中磷酸化多肽表达的差异分析 45

46 人肝蛋白糖基化蛋白和位点的鉴定 46

47 Distinguished groups Ruedi Lab, ETH Zürich the Institute for Systems Biology Mann Lab, University of Southern Denmark Max Planck Institute of Biochemistry Gygi Lab, Harvard University Yates Lab, the Scripps Research Institute Heck Lab, University Utrecht 47

48 质谱仪器使用选择 48

49 谢谢大家!

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计 222 E 2006, 36(2): 222~234 * 1** 1,2 1,2 1,2 1,2 3 3 1 1 1,2 (1., 100080; 2., 100039; 3., 200031),. ;,,.. 20 90 (human genome project, HGP), ; HGP 2003, 21. (proteomics) ; (computational proteomics),,,