26 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2009 Vol.25 酸 20 个酪氨酸和 35 个半胱氨酸 ) [6], 作为动物体内重要的转运蛋白,BSA 参与了动物体内一系列重要的氧化还原反应. 在光生物学和辐射生物学中, 光及电离辐射与氨基酸肽链及蛋白质相互作用是近年来生

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妊姜
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1 January 物理化学学报 (Wuli Huaxue Xuebao) Acta Phys. 鄄 Chim.Sin., 2009, 25(1): [Article] 牛血清白蛋白的光损伤和光氧化机理程伶俐赵萍王玫朱慧朱融融孙晓宇汪世龙 ( 同济大学生命科学与技术学院, 上海 ) 摘要 : 运用激光闪光光解瞬态吸收技术, 在 266 nm 激光激励下, 研究了牛血清白蛋白 (BSA) 光损伤和被 SO 4 单电子氧化的反应机理, 表征了反应过程中生成的自由基. 结果表明, 在 266 nm 激光照射下,BSA 可同时发生光电离和光激发, 生成色氨酸阳离子自由基 (/NH + ), 由 /NH + 快速脱质子形成的色氨酸中性自由基 (/N ) 及色氨酸三重激发态 ( 3 ), 3 再与酪氨酸 (Tyr) 发生分子内电子转移生成酪氨酸中性自由基 (Tyr/O ). 在 SO 4 单电子氧化的反应中, 借助减谱技术, 求得 BSA 中 Tyr 和色氨酸 () 自由基的表观生成速率常数, 但未发现分子内电子转移现象, 阐明了 SO 4 自由基是通过与 BSA 中的 Tyr 和发生电子转移反应来氧化 BSA 的,SO 4 氧化 BSA 的反应速率常数为 1.51 伊 L mol -1 s -1, 从而为进一步研究血清白蛋白的氧化还原代谢过程提供理论基础. 关键词 : 牛血清白蛋白 ; 光电离 ; 光激发 ; 电子转移 ; 单电子氧化中图分类号 : O644 Photodamageand Photooxidation Mechanisms of BovineSerumAlbumin CHENGLing 鄄 Li ZHAOPing WANGMei ZHUHui ZHURong 鄄 Rong SUNXiao 鄄 Yu WANGShi 鄄 Long (SchoolofLife Science and Technology, TongjiUniversity, Shanghai , P. R. China) Abstract: Photodamageandphotooxidationmechanismsofbovineserumalbumin(BSA)asinducedbyUVradiation and one 鄄 electron oxidation by SO 4 were investigated by 266 nm laser flash photolysis. BSA can be photoionized and photoexcited by 266 nm photons to give tryptophan ()/NH +,/N resulting from the rapid deprotonation of / NH +,and 3.Through intermolecular electron transfer between 3 and tyrosine (Tyr), Tyr/O was produced. In one 鄄 electron oxidation of BSA by SO 4 the apparent set up rate constants of Tyr and radicals were calculated but intermolecular electron transfer was not observed. We propose that SO 4 oxidizes BSA by electron transfer to the Tyr and of BSA with arate constant of 1.51 伊 L mol -1 s -1.This research provides an introductory theory to enable furtherstudy on the redoxmetabolic processofbsa. KeyWords: Bovine serumalbumin; Photo 鄄 ionization; Photo 鄄 excitation; Electron transfer; One 鄄 electron oxidization 蛋白质是生物体中一类重要的大分子, 对于维持生命是十分重要和必不可少的. 血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质, 它能够储存和转运众多内源性和外源性物质. 由于血清白蛋白在生理上的重要性以及易于分离提纯而常被用作模 [1-4] 型球蛋白. 牛血清白蛋白 (BSA) 由于其重要的生物化学和生物物理学意义, 在过去的 40 年内被广泛 [5] 地研究.BSA 是一种广泛应用的球蛋白, 它的分子结构中含有 583 个氨基酸残基, 其中有 78 个氨基酸容易被氧化 (2 个色氨酸 4 个甲硫氨酸 17 个组氨 Received: July25,2008;Revised: September30,2008;PublishedonWeb:November12,2008. Correspondingauthor. wsl@mail.tongji.edu.cn;tel: 鄄国家自然科学基金 ( , ) 上海市基础重点项目 (06JC14068) 及上海市教委科技创新项目 (08DZ21) 资助鬁 Editorial officeofactaphysico 鄄 ChimicaSinica

2 26 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2009 Vol.25 酸 20 个酪氨酸和 35 个半胱氨酸 ) [6], 作为动物体内重要的转运蛋白,BSA 参与了动物体内一系列重要的氧化还原反应. 在光生物学和辐射生物学中, 光及电离辐射与氨基酸肽链及蛋白质相互作用是近年来生命科学研究的热门课题, 由于这些研究均涉及自由基和激发态过程, 与生物体内的氧化还原反应, 酶催化反应及生物体对辐射 ( 包括紫外光 ) 的保护和敏化作用有着极其密切的关系 [7], 所以探讨 BSA 的光损伤和光氧化反应机理就显得非常必要. 由于生命体系的原初反应过程都是微观动态过程, 本研究采用纳秒激光光解技术研究了 BSA 的光损伤和 SO 4 自由基氧化 BSA 的反应, 初步阐述了 BSA 在水溶液中的光损伤和光氧化反应机理, 从而为进一步研究血清白蛋白的氧化还原代谢过程提供理论基础. 1 实验部分 1.1 实验试剂牛血清白蛋白 (BSA, 99%, Sigma 公司 ), 未经进一步纯化直接使用. 过硫酸钾 (K 2 S 2 O 8 )( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司 ), 重结晶后使用, 其它试剂均为分析纯. 实验体系均为磷酸盐缓冲液 (ph=7);n 2 N 2 O 和 O 2 为 99.99% 的高纯气体. 除非特殊说明, 本实验所用溶液均用 Millipore 纯水配制, 并且保存在暗处, 尽量避免光照. 溶液根据需要, 分别在实验前用高纯气体鼓泡 20 min 处理研究样品, 所有实验均在室温下进行. 1.2 实验装置研究在同济大学生命科学与技术学院的纳秒级激光光解装置上进行 [8,9], 采用 YAG 固体激光器为激励光源, 脉宽为 3-6 ns, 输出激光波长为 266 nm 时, 单脉冲最大能量为 60 mj, 氙灯作为全光谱分析检测光源, 与激光光路垂直, 分析光经透镜系统汇聚于 1cm 石英样品池, 经单色仪分光后由 R955 光电倍增管转化为电信号, 为安捷伦 1G 高速数字示波器记录, 数据转至计算机后用自编软件进行分析处理. 可控流量通气仪为本实验室研制 ; 所用仪器还有紫外鄄可见分光光度仪 (Cary 50 Probe, VARIAN, 美国 ) 电子分析天平 (AL204,MettlerToledo, 瑞士 ) ph 计 (DELTA 320, Mettler Toledo, 瑞士 ) 超声清洗仪 (DL 鄄 360D, 上海之信仪器有限公司 ) 恒温干燥箱 (DHG 鄄 9140A, 上海精宏实验设备有限公司 ) 及超纯水器 (Milli 鄄 Q,Millipore, 美国 ). 图 1 BSA 激光光解后不同时刻的瞬态吸收光谱 Fig.1 Transientabsorption spectraofbsa Thespectra were recordedat 0.1 滋 s( 姻 ),5 滋 s( 茵 )following 266nm laserpulseexcitation ofn 2 鄄 saturated aqueoussolutioncontaining 7.55 伊 10-6 mol L -1 BSA.Inset showsthe transient absorptioncurve observedat680nm. 2 结果与讨论 nm 激光作用下 BSA 光损伤机理研究配制 7.55 伊 10-6 mol L -1 氮气饱和的 BSA 中性水溶液,266 nm 激光光解后得到图 1 所示不同时刻的瞬态吸收谱. 从图 1 可以看出,BSA 水溶液在 266 nm 的激光作用后, 在 0.1 滋 s 时, 在 nm 范围内出现瞬态吸收, 通入水合电子清除剂 N 2 O 后该区域的瞬态吸收几乎消失 ( 图 2), 具有水合电子的瞬态吸收特征, 因此可判定这一吸收为水合电子的贡献. 根据水合电子的存在, 可以初步判定 BSA 在 266 nm 激光的作用下发生了光电离 [10]. 分别对比在 N 2 N 2 O 和 O 2 饱和条件下, 同一时刻 BSA 中性水溶液的瞬态吸收光谱 ( 图 2), 在 N 2 和图 2 不同气氛下 BSA 激光光解后的瞬态吸收光谱 Fig.2 Transientabsorption spectraofbsarecorded atdifferentsaturated solutions Thespectra were recordedat0.1 滋 sfollowing266nm laserpulse excitation ofn 2 鄄 saturated ( 姻 ),N 2 O 鄄 saturated ( 茵 ),ando 2 鄄 saturated ( 翌 )aqueoussolution containing 7.55 伊 10-6 mol L -1 BSA.

3 No.1 程伶俐等 : 牛血清白蛋白的光损伤和光氧化机理 27 N 2 O 饱和条件下, 均可以观察到和 570 nm 的特征吸收峰, 而在 O 2 饱和条件下,460 nm 处的吸收峰消失. 由于 O 2 是激发三重态的猝灭剂, 意味着 460 nm 处可能是激发三重态的贡献. Bensasson 等 [11] 曾经报道过, 蛋白质中的芳香氨基酸, 由于其氧化电位是氨基酸中最低的, 对 UV 光和氧化剂敏感, 因此是蛋白质光氧化损伤的重要位置. 在蛋白质的化学和放射性损伤过程中, 常常出现色氨酸吲哚自由基 (N ) 和酪氨酸酚氧自由基 (TyrO ). 根据文献 [12-15] 报道, 3 的特征吸收在 460 nm 处, 而 /NH + 的特征吸收在约 350 和 560 nm 处, N 和 TyrO 的特征吸收分别位于约 520 和 410 nm 处. 故上述 BSA 中性水溶液瞬态吸收谱中 360 和 570 nm 处的特征吸收峰可归属为 /NH + 的贡献,510 nm 处的可归属为 N 的贡献,410 nm 处的可归属为 TyrO 的贡献,460 nm 处的归属为 3 的贡献. 对比氮气饱和条件下,460 和 410 nm 处时间衰减谱图 ( 图 3), 观察到伴随着 460 nm 处 3 的衰减, 410 nm 处 TyrO 呈现一个迅速生成, 然后缓慢衰减的过程. 故初步可推断体系经历了两个过程 : 首先, 残基被光激发生成 3, 随后 3 通过分子内电子转移氧化 Tyr 残基, 生成 TyrOH +, 其 pk a 值 ( 弱酸性或弱碱性物质在 50% 解离时溶液的 ph 值 ) 为 -1, 在此体系中迅速脱质子生成 TyrO [16]. 其原因可能是, 在 266 nm 的摩尔消光系数比 Tyr 大近 10 倍, 在此体系中, 激光能量主要被吸收, 光解生成 NH + 和 3. 的 pk a 值为 4.3, 在此体系中会迅速脱质子形成 N, 而由于 Tyr 的氧化电位比低 (1.05V,Tyr0.94V(vs NHE)) [17], 故 Tyr 可以被所氧化, 且 3 的氧化性大于 NH + 和 N, 所以推测是由 3 通过分子内电子转移氧化 Tyr 残基, 最终生成 TyrO nm 激光作用下 SO 4 自由基氧化 BSA 的机理研究实验体系中 K 2 S 2 O 8 与 BSA 的浓度配比是将二者的 266 nm 吸光度之比保持在 100 以上, 这样可以保证激光能量主要被 S 2 O 2-8 吸收. 在氮气饱和条件下,0.05 mol L -1 过硫酸钾中性水溶液经 266 nm 激光激发后得到的 0.1 滋 s 瞬态吸收谱具有 nm 处的宽吸收峰, 其中特征吸收位于 460 nm 处 ( 见图 4 插图 ), 此谱与文献中得到的过硫酸钾瞬态吸收谱完全吻合, 可将其归为 SO 4 自由基的瞬态吸收谱 [18]. 当含有 7.55 伊 10-6 mol L -1 BSA 和 0.05 mol L -1 过硫酸钾中性水溶液经 266 nm 激光激发后,10 滋 s 时得到的瞬态吸收谱如图 4 所示. 激光光解后, 很快可以观察到 SO 4 自由基的特征吸收峰, 随着 SO 4 自由基的衰减, 含 BSA 的二元体系在和 560 nm 处有新的吸收, 说明有新的瞬态物种生成, 由于在此体系中激光能量基本都被过硫酸钾吸收,BSA 几乎不发生光电离, 所以新的瞬态物种是由过硫酸钾光电离产生的 SO 4 自由基氧化 BSA 产生的. 改变 BSA 的浓度, 发现 SO 4 自由基的衰减随 BSA 浓度增加而加快 ( 图 5), 进一步说明 SO 4 自由基确实与图 3 BSA 激光光解后在 460nm( 阴 ) 和 410 nm( ) 记录的时间衰减谱曲线 Fig.3 Transientabsorption curves ofbsaat 460nm ( 阴 )and 410nm( ) N 2 鄄 saturatedaqueoussolution containing 7.55 伊 10-6 mol L -1 BSAexcitedby266nm laserpulse. 图 4 过硫酸钾在有 ( 茵 ) 无 ( 姻 )BSA 条件下的瞬态吸收谱 Fig.4 Transientabsorption spectraofk 2 S 2 O 8 without ( 姻 )or with ( 茵 )BSA Thespectrawererecordedat 10 滋 sfollowing 266nmlaserpulse excitation ofn 2 鄄 saturated aqueoussolution containing 0.05mol L -1 K 2S 2O 8 and7.55 伊 10-6 mol L -1 BSA( 茵 )oronlycontaining0.05mol L -1 K 2S 2O 8 ( 姻 ).Inset showsthe spectrarecorded at0.1 滋 sunderthe same condition.

4 28 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2009 Vol.25 表 1 NH + N 和 TyrO 表观生成速率常数 Table1 Apparentsetup rateconstants ofnh +, N and TyrO Transient product Maximum absorption (nm) 10-5 k obs /s -1 NH + N TyrO 图 5 过硫酸钾在不同浓度 BSA 时 460nm 处的时间衰减谱图 Fig.5 Transientabsorption curvesofk 2 S 2 O 8 with differentconcentrations ofbsaat460nm N 2 鄄 saturatedaqueoussolution containing 0.05mol L -1 K 2S 2O 8 with 3.02 伊 10-6 ( 阴 ), 6.04 伊 10-6 ( 茵 ),7.55 伊 10-6 ( 吟 ),9.06 伊 10-6 ( 翌 ),or 伊 10-6 ( 伊 )mol L -1 BSAexcitedby266 nm laserpulse.inset showsthedependenceofthe SO 4 decay rate constant (k obs)with BSA 发生了作用. 因此, 在研究的体系中, 初步判断 10 滋 s 时得到的瞬态吸收谱应该是 SO 4 自由基和氨基酸自由基的叠加谱. concentration ofbsa. BSA 中的 NH 和 TyrOH 残基提供电子给 SO 4, 生成 SO 2-4 和对应的氨基酸阳离子自由基 (NH + 或 TyrOH + ). 根据前面对 NH + 和 TyrOH + 特征吸收峰的分析, 可将图 4 过硫酸钾和 BSA 二元体系中出现的 350 和 560 nm 的特征吸收峰归属为 NH + 的贡献. 在本实验条件下 (ph 越 7), NH + (pk a =4.3) 和 TyrOH + (pk a =-1) 会脱质子, 转变为中性自由基 N [13,16] 和 TyrO. 结合前面对 N 和 TyrO 特征吸收谱的分析, 可将图 4 过硫酸钾和 BSA 二元体系中出现的 520 和 410 nm 的特征吸收峰分别归属为 N TyrO 的贡献. 和但由于氨基酸自由基的吸收和 SO 4 的吸收发生重叠, 很难直接观察到氨基酸自由基的生成. 故采用减谱技术 [19], 扣除 SO 4 瞬态吸收的贡献, 得到了 NH + (350 和 560 nm) N (520 nm) 和 TyrO (410 nm) 的净生成曲线 ( 图 6), 分别求得其表观生成速率常数如表 1 所示. 在此体系中, 未观察到分子内电子转移现象, 其可能的原因是在此体系中, 光子能量主要被 K 2 S 2 O 8 吸收, 生成强氧化剂 SO 4, 故不可能发生光激发产生 3, 因此不能观察到上述的分子内电子转移现象. 根据以上分析, 推断 SO 4 与 BSA 之间可能发生了如下反应 : 图 6 过硫酸钾和 BSA 激光光解后在 350nm ( 茵 ) 460 nm( 阴 ) 和 nm( 吟 ) 处的时间衰减谱曲线 Fig.6 Transientabsorption curves ofk 2 S 2 O 8 and BSA at350nm( 茵 ),460nm( 阴 ),and nm( 吟 ) N 2 鄄 saturatedaqueoussolution containing 0.05 mol L -1 K 2S 2O 8 and 7.55 伊 10-6 mol L -1 BSAexcitedby 266nmlaserpulse nm representsthe set upand decay curveofnh + obtainedbysubstract 460nm from 350 nm.inset showsthesetuptransientabsorption curvesobservedat 520nm(a),410nm (b),and560 nm (c). 由于此二元体系中所产生的 SO 4 的浓度远远大于其氧化所生成的氨基酸残基自由基的浓度, 故保证二元体系中过硫酸钾的浓度不变, 在一定范围内改变 BSA 的浓度, 分别计算 460 nm 处 SO 4 的表观衰减速率常数, 然后对 BSA 的浓度作图 ( 见图 5 插

5 No.1 程伶俐等 : 牛血清白蛋白的光损伤和光氧化机理 29 图 ), 斜率即为 BSA 猝灭 SO 4 的反应速率常数, 求得此值为 1.51 伊 L mol -1 s -1. 此值大于 SO 4 与氨基酸反应的速率常数 [20], 这是因为本实验所用的 BSA 的浓度是根据其分子量算得的摩尔浓度, 而非氨基酸残基所表示的摩尔浓度. 3 结论利用纳秒级激光光解技术, 对 BSA 的紫外光损伤和 SO 4 氧化 BSA 的机理进行了系统的研究. 发现在 266 nm 激光作用下,BSA 中的残基首先以脱电子和发生分子内电子能级跃迁的形式受到破坏, 进而通过分子内电子转移的形式氧化 Tyr 残基, 最终其光损伤以这两种氨基酸残基自由基的形式表现出来. 而在 SO 4 氧化 BSA 的体系中,SO 4 可通过与 BSA 中的和 Tyr 残基发生电子转移而氧化 BSA, 并且求得了这些氨基酸残基自由基的表观生成速率常数, 获得了 SO 4 氧化 BSA 的反应速率常数. 本研究为进一步理解 BSA 参与的某些生物体内的氧化还原反应和探讨蛋白质的光损伤机理提供了理论依据. References 1 Deep,S.; Ahluwalia,J.C. Phys.Chem.Chem.Phys., 2001, 3: Vasilescu,M.; Angelescu,D.; Almgren,M.; Valstar,A. Langmuir, 1999, 15: Giancola, C.; de Sena, C.; Fessas, D.; Graziano, G.; Barone, G. Int. J.Biol. Macromol., 1997, 20: Saboury,A.A. J.Chem.Thermodyn., 2003,35: Gelamo, E. L.; Itri,R.; Alonso,A.; Silva,J.V.D.; Tabak,M. J.Colloid InterfaceSci., 2004, 277: Hirayama, K.; Akashi,S.; Furuya,M.; Fukuhara,K. Biochem. Biophys.Res.Commun., 1990, 173: Chu,G.S.; Song,Q.H.; Wang,Z.Y.; Ge,X.W.; Zhang,Z. C.; Wang,W. F.; Yao,S.D. ActaPhys. 鄄 Chim.Sin., 2000,16(3): 232 [ 储高升, 宋钦华, 王忠义, 葛学武, 张志成, 王文峰, 姚思德. 物理化学学报, 2000, 16(3):232] 8 Sun,X.Y.; Zhang,C. J.; Wang, M.; Wang, S. L; Ni, Y. M.; Yao, S. D. Sci. ChinaSer.B,2002,32(4): 148 [ 孙晓宇, 张超杰, 王玫, 汪世龙, 倪亚明, 姚思德. 中国科学 B 辑, 2002, 32(4): 148] 9 Zhao,P.;Wang, M.; Zhang,S. P.; Shao,S.C.; Sun, X.Y.; Yao,S. D.; Wang,S. L. Sci. China Ser.B,2008,38(7): 618 [ 赵萍, 王玫, 张淑萍, 邵思常, 孙晓宇, 姚思德, 汪世龙. 中国科学 B 辑, 2008, 38(7):618] 10 Fang,H. J.; Dong,W.B.; Zhang,R.X.; Hou, H. Q. Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2006, 22(6): 761 [ 房豪杰, 董文博, 张仁熙, 侯惠奇. 物理化学学报, 2006, 22(6): 761] 11 Bensasson,R.V.;Land,E.J.;Truscott,T.G.Proteinandcomponent inexcitedstatesandfreeradicalsinbiologyandmedicine.oxford: OxfordUniversity Press, 1993: Swagata,B.; Sharmistha, D.C.; Swagata,D.; Samita,B.J. Luminescence, 2008, 128: Filipe,P.;Morli 侉 re,p.; Patterson,L. K.; Hug,G.L.; Mazi 侉 re,j. C.; Freitas, J. P.; Fernandes, A.; Santus, R. Biochemistry, 2002, 41: Solar, S.; Getoff,N.; Surdhar, P.S.; Armstrong, D.A.; Singh, A. J. Phys. Chem., 1991,95: Bent, D. V.; Hayon, E.J.Am.Chem.Soc., 1975, 97: Galian,R.E.; Pastor 鄄 P 佴 rez,l.; Miranda,M.A.; P 佴 rez 鄄 Prieto,J. Chem.Eur.J., 2005, 11: Deflippis, M.R.; Murthy,C.P.; Faraggi,M.; Klapper,M.H. Biochemistry, 1989, 28: Fu,H.Y.;Wu,G.Z.; Long,D.W.;Liu,Y.D.; Wang,W. F.; Yao, S. D. Acta Chim.Sin., 2006, 64(6):483 [ 付海英, 吴国忠, 龙德武, 刘耀东, 王文峰, 姚思德. 化学学报, 2006, 64(6): 483] 19 Zhu,H. P.; Zhang,Z.X.; Zhao,H.W.; Wang, W.F.; Yao,S.D. Sci. ChinaSer.B,2006, 36(1): 76 [ 朱红平, 张兆霞, 赵红卫, 王文峰, 姚思德. 中国科学 B 辑, 2006, 36(1):76] 20 Wang,S.L.;Sun, X. Y.; Zhang,C.J.; Wang,M.; Li, W.Z.; Liu,S. H.; Ni, Y.M.; Yao, S.D. Sci.ChinaSer. B,2002, 32(3): 278 [ 汪世龙, 孙晓宇, 张超杰, 王玫, 李文哲, 姮刘仕, 倪亚明, 姚思德. 中国科学 B 辑, 2002, 32(3): 278]

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