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停寿
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1 一质谱分析技术简介 Introduction of Mass Spectrometry

2 主要内容 1 概述 2 质谱仪的基本结构 (1) 进样系统 (2) 离子源 (3) 质量分析器 (4) 检测器 3 质谱仪

3 1 概述质谱 (Mass Spectrometry) 分析将样品分子经过离子化后, 在电场与磁场的共同作用下, 利用其质荷比 (m/z) 不同而进行分离, 检测得到质谱图的一种分得的种析方法

4 质谱的主要作用 1 测定物质的分子量 ; 2 根据碎片特征进行化合物的结构分析 ; 3 对于高分辨质谱可获得元素组成信息质谱的分类

5 2 质谱仪的基本结构质谱仪工作原理样品分子从进样系统进入离子源, 形成带电离子进入质量分析器在质量分析器中, 不同质荷比 m/z 的离子实现时空分离检测器中检测和记录数据

6 质谱仪组件构成进样系统离子源质量分析器检测器 1. 直接插入 1. 电子轰击 EI 2. 直接喷入 2. 化学电离 CI 3. 场致电离 FI 4. 场解吸 FD 5. 快原子轰击 FAB 6. 电喷雾电离 ESI 7. 大气压力化学电离 APCI 8. 基质辅助激光解吸 MALDI 1. 磁扇形 ( 含单聚焦和双聚焦 ) 2. 四级杆 Q 3. 离子阱 IT 4. 飞行时间 TOF 5. 傅立叶变换离子回旋共振 FTICR 6. 几种组合, 如 QQQ, Q TOF 1. 电子倍增管 2. 光电倍增管 3. 闪烁检测器 4. 法拉第杯 5. 照相检测

7 (1) 进样系统最常见的试样引入方式有 : 直接插入 (direct insertion): 样品置于探针或样品板 ( 如 MALDI) 直接插入离子源, 热或激光解吸使之挥发和离子化直接喷入 (direct infusion): 采用毛细管或毛细管柱将气体或液体样品喷入质谱仪中进行分析检测 ( 如 EI, ESI), 可以通过注射泵连续泵入 (GC/MS LC/MS 接口 ) (EI, ESI) (MALDI)

8 (2) 离子源作用 : 将被分析的样品分子电离成带电的离子种类 : 气相源 : 如 EI, CI, FI 解吸源 : 如 FD, FAB, APCI, ESI, LD, MALDI 硬源 : 如 EI, 离子化能量高, 伴有化学键的断裂, 谱图复杂, 可得到分子官能团的信息软源 : 如 CI, FI, FD, FAB, APCI, ESI, LD, MALDI 离子化能量低, 产生的碎片少, 谱图简单, 可得到分子离子峰, 即得到分子量信息

9 常见离子源离子源简称离子化试剂最初应用年份电子轰击离子化 (electron bomb EI 高能电子 1920 ionization) 化学电离 (chemical ionization) CI 试剂离子 1965 场电离 (field ionization) FI 高电势场 1970 场解吸 (field desorption) FD 高电势场 1969 快原子轰击 (fast atom FAB 快原子或离子束 1981 bombandment) 电喷雾离子化 (electrospray ESI 荷电微粒能量 1984 ionization) 基质辅助激光解吸 (matrix-assisted MALDI 激光束 1988 laser desorption ionization)

10 1 电子轰击电离源 (EI) 采用高速 ( 高能 ) 电子束冲击样品, 从而产生电子和分子离子 M + : M+e M + +2e 高能电子束产生的分子离子 M + 将进一步裂解, 释放出部分能量, 并产生质量较小的碎片离子和中性自由基 : M 1+ +N 1 1 M + M 2+ + N M e 加速聚焦加速特点 : 使用最广泛, 谱库最完整 ; 电离效率高 ; 结构简单, 操作方便 ; 但分子离子峰强度较弱或不出现 ( 因电离能量最高 )

11 2 化学电离源 (CI) 离子化机理 : 样品分子在承受电子轰击前, 被一种反应气 ( 通常是 CH 4 4) 稀释, 稀释比例约为 10 4 :1, 因此样品分子与电子的碰撞几率极小, 所生成的样品分子离子主要经过离子 - 分子反应组成离子化过程 : 甲烷首先在电子轰击下被电离 : CH CH 4 +CH 3 +CH 2 +CH +C +H 甲烷离子与分子进行反应, 生成加合离子 : CH CH 4 CH 5+ +CH 3 CH 3+ +CH 4 C 2 H 5+ +H 2

12 加合离子与样品分子反应 : CH 5+ +M MH + +CH 4 C 2 H 5+ +M MH + +C 2 H 4 (M+1) + CH 5+ +M (M-H) - +CH 4 +H 2 (M-1) - C 2H 5+ +M (M-H) - +C 2H 6 复合反应 : CH 5+ +M (M+CH( 5 5) + (M+17) + C 2 H 5+ +M (M+C 2 H 5 ) + +C 2 H 4 (M+29) + 一系列准分子离子

13 3 场致电离源 (FI) 离子化机理 : 应用强电场诱导样品电离 : ( 电压 :7~10kV,d<1mm) 1mm) 离子化过程 : 样品蒸汽邻近或接触带高的正电位的阳极尖端时, 由于高曲率半径的尖端处产生很强的电位梯度, 使样品分子电离

14 4 场解吸电离源 (FD) 过程 : 样品溶液涂于发射器表面强电场分子电离奔向阴极引入磁场 EI 特点 : 特别适于非挥发性且分子量高达 10,0000 的分子 ; FI 样品只产生分子离子峰和准分子离子峰, 谱图最为简单 FD

15 5 快原子轰击电离源 (FAB) 过程 : 稀有气体 ( 如氙 Xe 或氩 Ar 电离 ) 通过电场加速获得高动能快原子快原子撞击涂在金属板上的样品样品分子电离二次离子电场作用下, 离子被加速后, 进入质量分析器

16 特点 : 分子离子和准分子离子峰强 ; 碎片离子峰也很丰富 ; 适合热不稳定难挥发样品分析 ; 涂在金属板上的溶剂也被电离, 谱图复杂化该离子源的出现促进了质谱从化学跨入生物学领域

17 6 电喷雾电离 (ESI) 结构 : 喷嘴 ( 金属或镀金属的毛细管 ), 雾化气, 加热气

18 ESI 的原理离子蒸发模型电场和辅助气流作用下形成 Taylor 锥喷成雾状的液滴加热气体作用下, 溶剂蒸发和液滴破碎解吸成气态离子

19 ESI 的特点 : 电喷雾源属软电离技术, 只产生分子离子峰 ; 产生的离子常带有多电荷, 尤其是生物大分子 ; 适用于强极性分子量大的样品, 如肽蛋白质糖等 ; 主要用于液相色谱 - 质谱联用仪

20 数个带多电荷离子经数学转换, 得到分子离子 ESI 使蛋白质产生多个带多电荷离子

21 NanoESI 为提高灵敏度, 采用内径较小 (5-50μM) 的毛细管, 可使液体体积流量大大降低, 可达到 nl 级 ESI: ~100 L/min NanoESI: ~100nL/min 雾化效率更高试剂 / 试样消耗量更少

23 7 大气压力化学电离源 (APCI) 样品的离子化是在处于大气压下的离子化室内完成 APCI 过程样品雾化电晕放电针对其放电在高压电弧中, 样品被电离去溶剂化形成离子检测

24 APCI 的特点优点 : 1. 适用于弱极性小分子化合物, 如醇和醚类 ; 2. 易操作, 耐受性好 ; 3. 流速大, 可达 2.0ml/min. 缺点 : 1. 有限的结构信息, 产生极少的碎片 ; 2. 易发生热裂解 ; 3. 应用范围有限, 不适合做分子量大于 1000 的化合物

25 8 基质辅助激光解吸电离 (Matrix-Assisted t i A i t d Laser Desorption Ionization, MALDI) 激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜, 基质从激光中吸收能量传递给样品分子, 电离过程中将质子转移到样品分子, 使样品分子电离

26 基质的作用把样品分子彼此分开, 减弱样品分子之间的相互作用 ( 稀释样品 ); 基质吸收激光的能量, 并将部分能量传递给样品 ; 辅助样品离子化

27 常见的 MALDI 基质

28 MALDI 法的优点 : 属于软电离, 通常形成单电荷离子, 提供分子离子峰, 获得分子量信息, 对蛋白质的鉴定非常有用 ; 抗基质干扰能力强, 适用于较复杂样品的分析 ; 高灵敏度, 可达 pmol MALDI 法的缺点 : 准确度不够高, 只能精确值小数点后两位 ; 不适于低分子量检测

29 (3) 质量分析器主要类型 : 磁分析器 (Magnetic Sector)( 包括单聚焦和双聚焦 ) 四极杆分析器 (Quadrupole,Q) Q) 离子阱分析器 (Ion Trap, IT) 飞行时间分析器 (Time-of-Flight, TOF) 傅立叶变换离子回旋共振分析器 (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) 以上分析器的变型和组合, 如 QQQ Q-TOF

30 1 单聚焦磁分析器依据离子在磁场的运动行为, 将不同质量的离子分开进入分析器前, 加速离子的动能为 :mv 2 =2zV 进入分析器后, 在磁场 H 作用下, 改作圆周运动, 只有离心力与向心力相等时, 离子才能飞出弯曲区, 即按曲线轨迹飞行 f 离 =f f 向 mv 2 R Hzv 质谱方程式 : 2 m H r z 2VV 2

31 单聚焦磁分析器特点方向聚焦 : 相同质荷比, 入射方向不同的离子会聚 ; 分辨率不高, 适合于能量分散较小的离子源

32 2 双聚焦磁分析器为了消除离子能量分散对分辨率的影响, 通常在扇型磁场前附加一个扇型电场 ( 静电分析器 ), 进入电场的离子受到一个静电力的作用, 改做圆周运动 : Ez 2 mυ R e mυ Ez R e 2

33 双聚焦磁分析器特点能量聚焦 : 相同质荷比, 速度 ( 能量 ) 不同的离子会聚方向聚焦 : 相同质荷比, 入射方向不同的离子会聚静电分析器将具有相同速度 ( 或能量 ) 的离子分成一类 ; 进入磁分析器后, 再将具有相同质荷比而能量不同的离子进行分离分辨率高, 但体积大

34 3 四极杆质量分析器原理 : 四根棒状电极形成四极场特点 : 结构简单体积小, 分析速度快, 适合与色谱联用 ; 分辨率较高 ( 比磁分析器略低 ); 准确度低于磁分析器, 对质量高的离子有质量歧视效应

35 4 离子阱质量分析器由一对环形电极和两个呈双曲面形的端盖电极形成一个阱, 使带电离子拘于阱内, 通过改变电场, 可使离子依次离开进入电子倍增器而分离

36 离子阱分析器特点优点 : 1. 结构简单, 性价比高 ; 2. 单一的离子阱可实现了多级串联质谱 (MS) n, 是时间上的串联质谱 ; 3. 灵敏度高, 较四极杆高倍 ; 4. 质量范围大, 单电荷已达 6000 缺点 : 质谱与标准图谱有一定差别, 重复性较差, 因离子在阱中停留时间较长, 易发生离子 - 分子反应

37 5 飞行时间质量分析器 (TOF) 核心部分是一个离子漂移管 (Drift tube) 利用从离子源飞出的离子其动能基本相等, 但在加速电压作用下, 不同 m/z 的离子飞行速率不一样 : 2zV v m 质荷比小的离子飞行速度快, 到达检测器的时间不同而被检测 t L m 2zV

38 飞行时间分析器特点优点 : 质量范围宽 ; 结构简单 ; 扫描速率快 ; 灵敏度高缺点 : 分辨率低, 因离子进入漂移管前的时间分散空间分散和能量分散激光脉冲电离方式离子延迟引出技术和离子反射技术离子延迟引出技术和离子反射技术

39 6 傅立叶变换离子回旋共振质量分析器 (FTICR) 结构 : 由超导磁体组成强磁场和置于磁场中的 ICR 分析室组成原理 : 进入分析室的离子, 在一个快速扫频电压下, 若电压的频率正好与离子回旋的频率相同会发生共振, 离子吸收射频能量, 轨道逐渐增大作回旋运动, 产生可检出信号回旋频率 (ω) 仅与磁场强度 (B) 和离子的质荷比 (m/z) 有关 FTICR 是一种具有超高分辨率和质量准确度的质谱仪器

40 FTICR 分析器特点优点 : 分辨率极高 ( 可达 10 6 以上 ) 灵敏度高 ( 可达 pg 量级 ) 扫描速度快可完成多级 ( 时间上 ) 串联质谱的操作缺点 : 价格高昂维护成本高

41 7 三重四极杆质量分析器 (QQQ) 空间串联的多级质谱 : 通过 QQQ 质量分析器完成每个四极杆有单独的作用 : Q1: 选择 -- 设定的质荷比范围扫描和选择所需的离子 Q2: 碎裂 -- 也称碰撞池, 用于碎裂和传送离子在所选择离子的飞行途中, 引入碰撞气体, 例如氮气等 Q3: 分析 -- 用于分析在碰撞池中产生的碎片离子

42 QQQ 分析器的特点优点 : 1. 定量重现性较好 ; 2. 在中性丢失扫描和母子扫描模式具有最好的灵敏性和准确性缺点 : 1. 分辨力不足, 容易受 m/z 近似的离子干扰 ; 2. 售价较高, 需仔细维护

43 8 四极杆串联 TOF(Q-TOF) TOF) 结构 Q 是质量过滤器功能在 MS 模式下 : 离子导向 MS/MS 模式下 : 质量分选 TOF 具有质量分析功能

44 Q-TOF 的特点优点 : 1. 全扫描模式下, 具有高灵敏度高选择性 ; 2. 可测定精确分子量及元素组成分析 ; 3. 能够提供高分辨谱图, 定性能力好于 QQQ; 4. 分析速度快缺点 : 价格较高, 需仔细维护

45 用于 ESI 的典型质量分析器一般性能比较 Quadrupol e Ion trap TOF Magnetic Sector FT-ICR Q-TOF Accuracy 0.01% (100ppm) 0.01% (100ppm) 0.02 to 0.2%(20 0ppm) % ( 5ppm) % ( 5ppm) 0.001% (10ppm) Resolution 4,000 4,000 8,000 30, ,000 10,000 m/z Range 4,000 4, ,000, s s s Scan speed s s ms 10,000 10,000 10,000 Tandem MS 2 MS n MS MS 2 MS n MS 2 MS (triple quad)

46 (4) 离子检测器电子倍增器光电倍增管闪烁检测器法拉第杯照相检测电子倍增器

47 3 质谱仪傅立叶变换质谱仪 (FT-MS) ESI-FT-MS 在低质量段具有很高的分辨率, 用于有机小分子或生物大分子的 MS 以及 MS/MS 测定优点 :(1) 扫描速度快 ;(2) 灵敏度高 ;(3) 分辨率好 ;(4) 可进行多级质谱 MS n 分析缺点 :(1) 价格昂贵 (~500 万 );(2) 维护成本高 ( 单液氦 ~20 万 / 年 )

48 GC-MS 适用于易挥发低分子量的有机化合物分析优点 : 分析速度快 ; 灵敏度高 ; 准确度高 ( 能准确至小数点后四位 ) 缺点 : 只适用于易挥发的组分分析 LC-MS 应用范围广, 采用 ESI 离子源, 可分析有机小分子, 也可分析多肽蛋白质 ( 先裂解成多肽 ) 等生物大分子

49 MALDI TOF/TOF MS 适用于分子量大于 1000 的生物大分子如多肽蛋白质分析优点 : 分析速度快 ; 灵敏度高 ; 抗干扰能力强 ; 谱图简单 ( 单电荷, 以准分子离子峰为主 ) 缺点 : 准确度相对较低 ( 只能准确至小数点后两位 )

50 二聚合物 (PEG2000) 和蛋白质 (BSA) 的 MALDI 质谱分析实验

51 主要内容 1 MALDI-TOF/TOF MS 质谱仪的简介 2 MALDI 质谱的研究对象 3 样品的制备流程 4 数据采集 5 MALDI 谱图解析 6 MALDI 对样品的要求

52 1 MALDI-TOF/TOF 质谱仪的简介

53 2 MALDI 质谱的研究对象 1. 生物样品 : 多肽, 蛋白质, 核酸, 寡糖, 获得分子量一级序列的鉴定 2. 有机小分子 : 金属有机配合物, 部分难以气化的有机分子 (Mw>300), 获得分子量同位素分辨峰 3. 合成的聚合物 : 多环芳烃,PEG, 获得分子量重复单元和端基多环芳烃获得分子量复单元和端信息

54 3 样品制备流程待分析物种类 / 选择适当的选择适当的分析目的基质样品靶点靶配置样品 / 基质溶液选择适当的点靶方法

55 常见的 MALDI 基质

56 靶板的种类和选择英文名称中文名称适用性特点 Ground steel target 纯金属靶常规样品分析灵敏度一般 Polished steel target 抛光靶常规样品分析灵敏度一般 AnchorChip Standard (800 m) AnchorChip Small (400 m) 标准增敏靶蛋白质酶解样品分析灵敏度较好小型增敏靶核苷酸样品分析灵敏度较好 Pre-spotted Anchorchip 修饰了基质的增敏靶蛋白质酶解样品分析灵敏度较好

58 MALDI 制样方法 1. 干滴法 (Dried Droplet) 样品和基质以一定比例在离心管内混合均匀, 然后点靶, 自然晾干 2. 薄层法 (Thin layer method) 先将基质点靶, 待基质结晶后, 再把样品溶液点于基质的层上, 自然晾干 3. 双层法 ( Double layer method) 先将基质点靶, 形成基质薄膜, 取样品点靶, 自然晾干, 再取样品和基质的混匀物点靶, 自然晾干此法可增强灵敏度一般首先采用干滴法

59 基质及靶板的选择指南样品基质靶制备方法多肽 HCCA Ground steel AnchorChip Standard 干法干法 Pre-spotted Anchorchip 薄层多肽 / 多糖 / 蛋白 2,5-DHB Ground steel 干法 AnchorChip Standard 干法蛋白 2,5-DHAP Ground steel 干法蛋白 SA Ground steel 双层蛋白 (TDS) sdhb Ground steel 干法蛋白 (TDS) 1,5 -DAN Ground steel 干法核酸 3-HPA Ground steel AnchorChip Small 干法薄层

60 4 质谱数据的采集 (1) 一级质谱 (MS) 数据的采集流程 : 选取适当的数据采集方法根据图谱质量, 改变激光能量等参数, 获取质量更佳的质谱图保存质谱数据

61 两种检测模式反射模式 (Reflectron Mode): a. 分子量样品 (Mw<4000D) b. 分辨率较高, 单同位素峰清晰准确 c. 灵敏度降低线性模式 (Linear Mode): ) a. 大分子量样品 (Mw>4000D) b. 分辨率低, 得到的是平均分子量的质荷比 c. 灵敏度较高

62 根据分子量大小选择相应的方法方法的选择

63 基质峰抑制

64 (2) 二级质谱 (MS/MS) 数据的采集流程 : 获取 PMF 图从 PMF 图里选取信噪比较高的峰做 TOF/TOF 选择 LIFT 方法获取母离子质谱 (parent mode) 获取子离子质谱 (fragment mode) 保存数据

65 Mascot 数据库 MASCOT 是一套利用质谱数据与数据库序列进行比对来鉴定蛋白质的软件提供的对比方式 : Peptide mass fringerprint (PMF) Sequence Query MS/MS Ion search MASCOT 数据库 : MASCOT 本身不带数据库, 所有数据库都是用户自建或网上免费下载 ; 可以是蛋白质数据库, 也可以是 DNA 数据库 MASCOT 服务器 : Pubilic Web version( 在线服务器 ) In House version( 本地服务器 )

66 数据库检索基本流程

67 5 MALDI 谱图解析 1. 常见离子峰 : 正电荷模式 : 加合质子峰 [M+H] + 加合碱金属峰 [M+Na] +, [M+K] + 负电荷模式 : 失去一个质子峰 [M-H] - 2. 单电荷分子离子峰出现较多, 双电荷和多电荷峰很少或几乎不出现

68 6 MALDI 对样品的要求 Avoid: Glycerol, sodium azide, DMSO, SDS, phosphate, NaCl, 2M urea, 2M guanidine Tolerable: (<50mM) HEPES, MOPS, Tris, NH4OAc, octyl glucoside No interference: TFA, formic acid, 2-mercaptoethanol, DTT, Volatile organic solvents, HCl, NH 4 OH, acetic acid

69 样品中各成分的浓度上限 Phosphate 20mM EDTA 1mM Detergents 0.1% Glycine 20mM Glycerol 2% Sodium Citrate 20mM Buffer (Tris) 50mM K phosphate 25mM Guanidine 1M Na phosphate 0.1M Na azide 1% Octyl glucoside 0.3% SDS 0.05% 05% Ammon. Bicarb. 01M 0.1M

70 样品的前处理目的 : 去除缓冲盐尿素 EDTA 甘油 DMSO 处理方法 : 洗涤剂等 a. 稀释 b. 洗涤 c. 透析 d. 阳离子交换 e. 吸管尖柱色谱法 f. ZipTips

71 谢谢!

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛

不同基源石斛属植物不同来源商品石斛徐蓓杨莉陈崇崇王峥涛徐珞珊建立黄草类石斛的薄层色谱定性鉴别方法采用薄层色谱法考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素石斛酚杓唇石斛素和三羟基甲氧基联苄的薄层色谱行为对石斛药材进行定性鉴别通过种不同基源的石斛及批商品石斛的薄层色谱鉴别证明此方法专属性强操作简单重复性好为石斛的鉴别提供了一种准确有效的新方法本方法可用于黄草类石斛的鉴别为中药石斛的质量标准研究提供科学依据