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1 第 35 卷第 12 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年 12 月 Vol.35 No.12 JournalofSouthwetUniverity (NaturalScienceEdition) Dec 文章编号 : (2013) 一株具有 Capae7 抑制活性的 1 糖多孢菌属菌株的分离鉴定 袁丽杰 1,2, 熊亚南 1, 张玉琴 2, 余利岩 2, 张月琴 2 1. 河北联合大学基础医学院, 河北唐山 3000; 2. 中国医学科学院医药生物技术研究所, 北京 摘要 : 从云南景洪曼亭药用植物牛心果根际土样中分离到具有 Capae7 抑制活性的放线菌株 1. 菌株在大多数培养基上生长状况, 只在 SP4 培养基上生长弱. 基内菌丝由乳白至棕黄, 在 SP2 及马铃薯浸汁琼脂上有白色气丝产生. 可溶性色素由淡黄至棕黄. 进一步结合菌株的形态特征 生理生化特征 细胞壁化学组分 分子分类特征等, 将菌株 1 鉴定为糖多孢菌属的一个菌株. 关键词 : 根际 ; 放线菌 ; 分离 ; 鉴定中图分类号 :R372 文献标志码 :A 在从普通生境分离新微生物种类越来越困难的今天, 根际放线菌以其特殊的生长环境 多方面的生物 作用引起人们的普遍关注. 根际放线菌不仅能拮抗植物病原菌 [1], 保护植物根系, 分解土壤中有机物, 为 [23] [4] 植物提供养料, 而且其代谢产物表现出多种多样的药学活性. 黄小龙等报道, 来自 12 种海南热带药 用植物根际放线菌株中,21% 具抗金黄色葡萄球菌活性,29.75% 具抗白色念珠菌活性,3% 具有抗肝癌 SMMC7721 细胞毒活性,2.75% 具有抗 PTP1B 活性,1.75% 具有抗 Capae3 活性. 活性菌数中有 [2] 40.52% 在 1 个以上的筛选模型上表现出生物活性. 高蓬明等分离了药用植物冬凌草根际土壤微生物, 其 中具有抗肿瘤活性的根际放线菌占 12%. 因此, 根际放线菌已成为新药筛选的一类重要药源微生物. 本研 究从我国云南采集具有我国地域特色的药用植物根际土样, 进行根际放线菌的分离和活性筛选. 在分离过 程中得到具有 Capae7 抑制活性的放线菌株 1, 本文报道对该菌株的鉴定情况. 1 材料与方法 1.1 材料 菌种 土样. 菌株 1 由本课题组分离自云南景洪曼亭药用植物牛心果 (RadixAnnonaereticulatae) 根际 主要试剂和仪器 菌株 PCR 试剂购自天根生化科技有限公司 ;PCR 引物由上海生物工程公司合成 ;BioRad 公司 PTC 1 收稿日期 : 基金项目 : 科技部自然科技资源平台项目 (20DKA21203); 河北省教育厅资助项目 ( ). 作者简介 : 袁丽杰 (1970 ), 女, 河南南阳人, 博士, 教授, 主要从事微生物与生化药学的研究工作.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.wu.cn 第 35 卷 200 型 PCR 仪 ;Agilent 公司 6890N 型气相色谱仪 ;SHMADZU LC10Avp 型高效液相色谱仪 培养基 HV 培养基 (g/l): 腐殖酸 1,Na2HPO40.5,KCl1.7,MgSO4 7H2O0.05,FeSO4 7H2O0.01, CaCl21,B 族维生素 0.005, 水 1000mL,pH7.2. 发酵培养基 (g/l): 葡萄糖 5; 酵母膏 5; 牛肉膏 5; 蛋白胨 5; 黄豆饼粉 10; 玉米浆 4; 可溶性淀粉 20; CaCO34;CoCL2(0.002%)1;H2O1000 ml;ph 方法 稀有放线菌的分离 取牛心果根际土样 2g, 自然风干研细, 配成 1% 土悬液,180rpm 摇 60 min, 取 1 ml 土悬液加入到 9mL1% 酚液中,180rpm 摇 30min 取出, 稀释 10 倍后取 0.2mL 均匀涂布 HV 平板,28 培养观察, 挑 取放线菌菌落, 划线分离纯化后, 甘油管 80 冻存 菌株发酵及粗品制备 将在 SP2 斜面培养基上生长 10d 左右的菌株 1 接种于发酵培养基中,180rpm,28 发酵培 养 4d. 发酵液 4000r/min,4 离心, 上清液过滤后冷冻真空干燥 ; 收集菌丝体, 加入 20mL 丙酮浸泡过 夜, 过滤取上清, 挥干丙酮,50% DMSO 溶解备用测活 形态及培养特征观察 将菌株在 SP2 培养基上进行埋片培养 (28 ), 定期取出埋片光镜下观察基内菌丝和气生菌丝, 扫描 电镜观察孢子丝与孢子特征. 将菌株分别接种于 SP2,SP3,SP4,SP5, 营养琼脂, 马铃薯浸汁琼脂, 察氏 琼脂进行菌株培养特征观察 生理生化特性 菌株 1 生理生化测定主要参照 Bergey ManualofSytematicBacteriology (Volume4) 中相 [5] 应属 种鉴定的有关内容 细胞化学组分分析 [67] 参照相关文献方法进行 SrRNA 基因序列分析 [8] 参照文献进行菌株基因组 DNA 提取及 16SrRNA 基因序列扩增.PCR 扩增产物送大连宝生物公司 进行测序. 将所测序列在 GenBank(htp:// 做 Blat 比对, 后与相似性较高的相 关菌株通过 ClutalX 进行多序列比对, 用 MEGA2.1 软件包中的邻接法 (NJ) 聚类分析, 构建相关菌株系 统进化树,Boottrap1000 次进行稳定性验证. 2 结果与分析 2.1 放线菌的分离及活性 通过药用植物牛心果根际土样放线菌的分离和活性筛选, 得到具有 Capae7 抑制活性的放线菌 株 形态及培养特征 菌株 1 在 SP2 培养基上培养时, 菌落隆起, 初期桔黄色, 之后菌落表面逐渐出现白色气丝, 并产生浅棕色可溶性色素. 基内菌丝丰富, 高度分支, 气生菌丝发达, 孢子圆或卵圆形, 表面光滑, 排列成 长链状 ( 培养 7d 后的菌落特征见图 1, 菌丝的显微形态及孢子的扫描电子显微镜观察结果见图 2). 符合糖 多孢菌属的形态特征. 菌株 1 生长的酸碱耐受范围是 ph6.0~9.0, 最适 ph7.0~7.5, 耐受盐浓度 0~10%, 最适 耐受盐浓度 0~7.0%, 生长温度范围 20~37. 在 28 于供试培养基上生长情况如表 1 所示, 在大多数

3 第 12 期 袁丽杰,等:一株具有 Ca pa e 7 抑制活性的糖多孢菌属菌株的分离鉴定 3 培养基上生长状况,只在 SP4 培养基上生长弱.基内菌丝由乳白至棕黄,在 SP2 及 马 铃 薯 浸 汁 琼 脂 上有白色气丝产生.可溶性色素由淡黄至棕黄.在 SP4 察氏琼脂上无可溶性色素产生. 图 1 菌株 1 的菌落形态及在 SP2 平板上的生长状况 图2 1 在 SP2 培养基上培养 14d 的光学显微镜( 400) 扫描电镜照片 表 1 菌株 1 的培养特征 培养基 生长情况 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素 SP2 SP4 弱 白色 桔黄 浅棕 SP3 乳黄 淡黄 SP5 马铃薯浸汁琼脂 察氏琼脂 营养琼脂 乳白 乳黄 淡黄 白色 棕黄 黄 中等 乳白 注: 表示生长阴性或未产色素. 乳黄 棕黄 2.3 生理生化特征 菌 株 1 对 碳 源 利 用 很 广 泛.除 不 能 利 用 西 蒙 枸 橼 酸 盐 丙 二 酸 盐 葡 萄 糖 酸 盐 醋 酸 盐 酒石 酸 盐 粘 液 酸 苯 丙 氨 酸 β 半 乳 糖 苷 外,对 其 余 测 试 的 碳 源 都 能 利 用.不 产 生 H2S,硝 酸 盐 还 原 阴 性,在 所 测 试 的 氮 源 中 只 能 利 用 腺 嘌 呤 和 酪 蛋 白,对 0.05% 的 苯 酚 有 抗 性.牛 奶 凝 固 胨 化 阳 性,纤 维 素水解阴性. 2.4 细胞壁化学组分分析 从 全细胞壁氨基酸及全细胞水解液糖组分分析结果看,菌株含有 me o DAP,半乳糖 阿拉伯糖.主要 磷脂有 DPG, PG, PC, P, PE.优势脂肪酸是i o t e i o S9.优势 MK 为 MK9(H4), C16 0,an C17 0,C17 1C MK9(H6).这些特征均与 Sac char opo l ra 属的主要化学特征相符 911. ypo [ ]

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.wu.cn 第 35 卷 表 2 菌株 1 的部分生理生化特征观察结果 特 征 结果 特 征 结果 特 征 结果 葡萄糖 + 棉子糖 + 亚硝酸盐产气 甘露醇 + 松三糖 + 醋酸盐 阿拉伯糖 + 糊精 + 酒石酸盐 木糖 + 淀粉 + 粘液酸 半乳糖 + 蕈糖 + DNA + 山梨醇 + 葡萄糖胺 + β 半乳糖苷 卫茅醇 + 水杨素 + 腺嘌呤 + 鼠李糖 + 尿素 丙氨酸 肌醇 + 七叶苷 + 次黄嘌呤 侧金盏花醇 + 西蒙枸橼酸盐 酪氨酸 果糖 + 丙二酸盐 脯氨酸 甘露糖 + 葡萄糖酸盐 酪蛋白 + D 核糖 + 苯丙氨酸 几丁质 山梨糖 + H2S 黄嘌呤 麦芽糖 + 明胶液化 + 弹力蛋白 蔗糖 + 硝酸盐还原 0.05% 苯酚 R 松二糖 + 葡萄糖产气 0.1% 苯酚 S 蜜二糖 + 硝酸盐产气 0.5% 苯酚 S 纤维二糖 + 糊精 + 1% 苯酚 S 5% 乳糖 + 淀粉 + 牛奶凝固胨化 + 乳糖 + 纤维素水解 2.5 菌株分子鉴定结果 菌株 1 基因组 DNA G+C mol% 值为 68.8%.16SrRNA 基因序列长度是 1443bp,Geṉ Bank 登录号为 EU 通过 Blat 搜索从 GenBank 与 EMBL 等数据库中调出同源性较高的相关放线 菌菌株的 16SrRNA 基因序列, 并建立系统进化树. 结果如图 3 所示. 图 3 菌株 1 与相关菌株的系统进化树 2.6 分类鉴定结果分析 孢菌属. 通过形态特征 培养特征和细胞化学组分分析及分子鉴定结果, 可以确定菌株 1 归属于糖多

5 第 12 期 袁丽杰, 等 : 一株具有 Capae7 抑制活性的糖多孢菌属菌株的分离鉴定 5 从进化树可见, 菌株 1 与糖多孢菌属菌株高度相关, 其与 Saccharopolyporagregori DSM T 以极高的自展值 (boottrapvalue,100%) 支持聚在同一进化分支上.16SrRNA 基因序列分析表 明, 两者之间序列相似性最高, 为 98.0%, 其次是菌株 Saccharopolyporacebueni DSM45019 T, 序列相 似性为 97.0%. 同时, 经菌株表型特征分析,1 与系统发育关系最密切的 S.gregoriDSM44324 T 在多方面存在明显差异 ( 表 3), 因此确定菌株 1 为糖多孢菌属中的一个菌株. 表 3 菌株 1 和亲缘关系最近的 SaccharopolyporagregoriDSM44324 T[12] 表型特征差异 特征 1 S.gregoriDSM44324 T 孢子排列 直链 弯曲 孢子表面 光滑 光滑 基内菌丝 分枝 碎片 气生菌丝颜色 白色 黄白色 基内菌丝颜色 乳白 桔黄 无色 浅黄 可溶性色素 浅黄 棕黄 无 基丝上形成孢子 降解能力腺嘌呤 + 弹性蛋白 + 酪氨酸 + 黄嘌呤 + D 乳糖 + NaCl 耐受性 (w/v) 生长温度范围 / 20~37 10~35 + 为阳性 ; 为阴性. 3 结论 通过药用植物牛心果根际土样放线菌的分离, 得到一株具有 Capae7 抑制活性的放线菌株 1. 菌株基内菌丝丰富, 气生菌丝发达, 孢子圆或卵圆形, 表面光滑, 排列成长链状. 菌落隆起, 初期桔黄色, 之后出现白色气丝, 并产生浅棕色可溶性色素. 生长的酸碱耐受范围是 ph6.0~9.0, 耐受盐浓度 0~10%, 生长温度范围 20~37. 对碳源利用很广泛. 不产生 H2S, 硝酸盐还原阴性, 可以利用腺嘌呤和酪蛋白, 牛奶凝固胨化阳性, 纤维素水解阴性. 菌株细胞壁 Ⅳ 型. 主要磷脂有 DPG,PG,PC,P,PE. 优势脂肪酸是 ioc16 0,aṉ teioc17 0,C17 1CS9. 优势 MK 为 MK9(H4),MK9(H6). 基因组 DNAG+Cmol% 值为 68.8%. 在进化树上, 菌株 1 与该属中菌株 SacharopolyporagregoriDSM44324 T 位于同一分支, 两者之间序列相似性为 98.0%, 同时两者表型特征有多方面差异. 菌株 1 归属于糖多孢菌属. 参考文献 : [1] 庹利, 旭格拉 哈布丁, 郭琳, 等. 罗布泊地区沙生植物根际放线菌多样性及生物活性的研究 [J]. 中国抗生素杂志,2012,37(1):2126. [2] 高蓬明. 冬凌草根际土壤微生物抗肿瘤活性菌株筛选 [J]. 安徽农业科学,2008,36(25): [3] HONG K,GAO A H,XE Q Y,etal.Actinomycetefor MarineDrugDicoveryolatedfrom MangroveSoiland PlantinChina[J].MarDrug,2009,7(1):2444. [4] 黄小龙, 陈吉良, 李建平, 等. 热带药用植物根际放线菌的分离 鉴定及生物活性分析 [J]. 生物技术通报,2012,(2): [5] WLLAMS S T.Bergey MannualofSytematic Bacteriology [M].Baltimore: Wiliamand Wilkin,1989: [6] GROTH,SCHUMANNP,RANEYFA,etal.DemetriaTerragenagen.nov.,ṗ nov.,anew GenuofActino

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.wu.cn 第 35 卷 myceteolatedfrom CompotSoil[J].ntJSytBacteriol,1997,47(4), [7] MEER A,KRSCHNERP,SCHRÖDER K H,etal.Mycobacteriumntermediumṗ nov. [J].ntJSytBacteriol, 1993,43(2), [8] 袁丽杰, 章广玲, 张玉琴, 等. 药用植物根际放线菌的种群多样性及生物活性初步研究 [J]. 中国抗生素杂志,2009, 34(8): [9] EMBLEY T M,WATR,DOBSONG,etal.FatyAcidCompoitionintheClaificationofSaccharopolyporahiruta [J].FEMS MicrobiolLet,1987,41(1), [10]EMBLEY T M,ROSTRONJ,O DONNELL A G,etal.ChemotaxonomyofWalV ActinomyceteLacking MAcid [J].JGen Microbiol,1988,134, [11]GOODFELLOW M,LACEYJ,ATHALYE M,etal.SaccharopolyporagregoriandSaccharopolyporahordei: TwoNew ActinomyceteSpeciefrom Fodder[J].JGen Microbiol,1989,135: [12]LUZ,LUZ,WANGL,etal.Saccharopolyporaflavap.nov.andSaccharopolyporathermophilap.nov.,NovelActinomycetefromSoil[J].ntJSytEvolMicrobiol,2001,51(2): olationanddentificationofasaccharopolypora StrainwithCapae7nhibitingActivity YUANLijie 1,2, XONG Yaṉan 1, ZHANG Yuqin 2, YU Liyan 2, ZHANG Yueqin 2 1. ColegeofBaicMedicine,HebeiUnitedUniverity,TanghanHebei3000,China; 2.ntituteofMedicinalBiotechnology,ChineeAcademyofMedicalScience,Beijing100050,China Abtract:AnactinomycetetrainwithCapae7inhibitingactivity,deignateda1,waiolated fromtherhizophereoilofbulock heartcutardapple(radixannonaereticulatae),amedicinalplant colectedfrom Yunnan.1grew welonalthemediatetedexceptsp4.thetrainformedextenivelybranchedubtratemyceliacreamywhitetobrownincolor,andwhiteaerialhyphaeoccurredon SP2andpotatoextractagar.Difuiblepigmentwereproducedonomeagarmedia,whichwerebufyto brownincolor.nviewofitmorphology,biochemicalcharacteritic,chemotaxonomicdata,andphylogeneticanalyibaedon16srrna geneequence,1 waidentifiedaasaccharopolypora train. Keyword:rhizophere;actinomycete;iolation;identification 责任编辑 周仁惠

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