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1 微 生 物 常 规 鉴 定 技 术 一 形 态 结 构 和 培 养 特 性 观 察 1 微 生 物 的 形 态 结 构 观 察 主 要 是 通 过 染 色, 在 显 微 镜 下 对 其 形 状 大 小 排 列 方 式 细 胞 结 构 ( 包 括 细 胞 壁 细 胞 膜 细 胞 核 鞭 毛 芽 孢 等 ) 及 染 色 特 性 进 行 观 察, 直 观 地 了 解 细 菌 在 形 态 结 构 上 特 性, 根 据 不 同 微 生 物 在 形 态 结 构 上 的 不 同 达 到 区 别 鉴 定 微 生 物 的 目 的 2 细 菌 细 胞 在 固 体 培 养 基 表 面 形 成 的 细 胞 群 体 叫 菌 落 (colony) 不 同 微 生 物 在 某 种 培 养 基 中 生 长 繁 殖, 所 形 成 的 菌 落 特 征 有 很 大 差 异, 而 同 一 种 的 细 菌 在 一 定 条 件 下, 培 养 特 征 却 有 一 定 稳 定 性, 以 此 可 以 对 不 同 微 生 物 加 以 区 别 鉴 定 因 此, 微 生 物 培 养 特 性 的 观 察 也 是 微 生 物 检 验 鉴 别 中 的 一 项 重 要 内 容 1) 细 菌 的 培 养 特 征 包 括 以 下 内 容 : 在 固 体 培 养 基 上, 观 察 菌 落 大 小 形 态 颜 色 ( 色 素 是 水 溶 性 还 是 脂 溶 性 ) 光 泽 度 透 明 度 质 地 隆 起 形 状 边 缘 特 征 及 迁 移 性 等 在 液 体 培 养 中 的 表 面 生 长 情 况 ( 菌 膜 环 ) 混 浊 度 及 沉 淀 等 半 固 体 培 养 基 穿 刺 接 种 观 察 运 动 扩 散 情 况 2) 霉 菌 酵 母 菌 的 培 养 特 征 : 大 多 数 酵 母 菌 没 有 丝 状 体, 在 固 体 培 养 基 上 形 成 的 菌 落 和 细 菌 的 很 相 似, 只 是 比 细 菌 菌 落 大 且 厚 液 体 培 养 也 和 细 菌 相 似, 有 均 匀 生 长 沉 淀 或 在 液 面 形 成 菌 膜 霉 菌 有 分 支 的 丝 状 体, 菌 丝 粗 长, 在 条 件 适 宜 的 培 养 基 里, 菌 丝 无 限 伸 长 沿 培 养 基 表 面 蔓 延 霉 菌 的 基 内 菌 丝 气 生 菌 丝 和 孢 子 丝 都 常 带 有 不 同 颜 色, 因 而 菌 落 边 缘 和 中 心, 正 面 和 背 面 颜 色 常 常 不 同, 如 青 霉 菌 : 孢 子 青 绿 色, 气 生 菌 丝 无 色, 基 内 菌 丝 褐 色 霉 菌 在 固 体 培 养 表 面 形 成 絮 状 绒 毛 状 和 蜘 蛛 网 状 菌 落 第 1 页, 共 19 页

2 第 2 页, 共 19 页

3 革 兰 氏 染 色 : 革 兰 氏 染 色 法 是 1884 年 由 丹 麦 病 理 学 家 C.Gram 所 创 立 的 革 兰 氏 染 色 法 可 将 所 有 的 细 菌 区 分 为 革 兰 氏 阳 性 菌 (G + ) 和 革 兰 氏 阴 性 菌 (G ) 两 大 类, 是 细 菌 学 上 最 常 用 的 鉴 别 染 色 法 该 染 色 法 所 以 能 将 细 菌 分 为 G + 菌 和 G 菌, 是 由 这 两 类 菌 的 细 胞 壁 结 构 和 成 分 的 不 同 所 决 定 的 G 菌 的 细 胞 壁 中 含 有 较 多 易 被 乙 醇 溶 解 的 类 脂 质, 而 且 肽 聚 糖 层 较 薄 交 联 度 低, 故 用 乙 醇 或 丙 酮 脱 色 时 溶 解 了 类 脂 质, 增 加 了 细 胞 壁 的 通 透 性, 使 初 染 的 结 晶 紫 和 碘 的 复 合 物 易 于 渗 出, 结 果 细 菌 就 被 脱 色, 再 经 蕃 红 复 染 后 就 成 红 色 G + 菌 细 胞 壁 中 肽 聚 糖 层 厚 且 交 联 度 高, 类 脂 质 含 量 少, 经 脱 色 剂 处 理 后 反 而 使 肽 聚 糖 层 的 孔 径 缩 小, 通 透 性 降 低, 因 此 细 菌 仍 保 留 初 染 时 的 颜 色 步 骤 : (1) 涂 片 : 涂 片 方 法 与 简 单 染 色 涂 片 相 同 (2) 晾 干 : 与 简 单 染 色 法 相 同 (3) 固 定, 与 简 单 染 色 法 相 同 (4) 结 晶 紫 色 染 色 : 将 玻 片 置 于 废 液 缸 玻 片 搁 架 上, 加 适 量 ( 以 盖 满 细 菌 涂 面 ) 的 结 晶 紫 染 色 液 染 色 1 分 钟 (5) 水 洗 : 倾 去 染 色 液, 用 水 小 心 地 冲 洗 (6) 媒 染 : 滴 加 卢 哥 氏 碘 液, 媒 染 1min (7) 水 洗 : 用 水 洗 去 碘 液 (8) 脱 色 : 将 玻 片 倾 斜, 连 续 滴 加 95% 乙 醇 脱 色 20 25s 至 流 出 液 无 色, 立 即 水 洗 (9) 复 染 : 滴 加 蕃 红 复 染 5min (10) 水 洗 : 用 水 洗 去 涂 片 上 的 蕃 红 染 色 液 (11) 晾 干 : 将 染 好 的 涂 片 放 空 气 中 晾 干 或 者 用 吸 水 纸 吸 干 (12) 镜 检 : 镜 检 时 先 用 低 倍, 再 用 高 倍, 最 后 用 油 镜 观 察, 并 判 断 菌 体 的 革 兰 氏 染 色 反 应 性 (13) 实 验 完 毕 后 的 处 理 : 1 将 浸 过 油 的 镜 头 按 下 述 方 法 擦 拭 干 净,a. 先 用 擦 镜 纸 将 油 镜 头 上 的 油 擦 去 b. 用 擦 镜 纸 沾 少 许 二 甲 苯 将 镜 头 擦 2 3 次 c. 再 用 干 净 的 擦 镜 纸 将 镜 头 擦 2 3 次 注 意 擦 镜 头 时 向 一 个 方 向 擦 拭 2 看 后 的 染 色 玻 片 用 废 纸 将 香 柏 油 擦 干 第 3 页, 共 19 页

4 Aseptic technique: 第 4 页, 共 19 页

5 Streak plate: Pour plate 第 5 页, 共 19 页

6 Spread plate 第 6 页, 共 19 页

7 The method of a serial dilutions for viable counting 二 生 理 生 化 试 验 微 生 物 生 化 反 应 是 指 用 化 学 反 应 来 测 定 微 生 物 的 代 谢 产 物, 生 化 反 应 常 用 来 鉴 别 一 些 在 形 态 和 其 它 方 面 不 易 区 别 的 微 生 物 因 此 微 生 物 生 化 反 应 是 微 生 物 分 类 鉴 定 中 的 重 要 依 据 之 一 微 生 物 检 验 中 常 用 的 生 化 反 应 有 : 1 尿 素 酶 (Urease) 试 验 有 些 细 菌 能 产 生 尿 素 酶, 将 尿 素 分 解 产 生 2 个 分 子 的 氨, 使 培 养 基 变 为 碱 性, 酚 红 呈 粉 红 色 尿 素 酶 不 是 诱 导 酶, 因 为 不 论 底 物 尿 素 是 否 存 在, 细 菌 均 能 合 成 此 酶 其 活 性 最 适 ph 为 7.0 试 验 方 法 : 挑 取 18~24h 待 试 菌 培 养 物 大 量 接 种 于 液 体 培 养 基 管 中, 摇 均, 于 36±1 培 养 10,60 和 120min, 分 别 观 察 结 果 或 涂 布 并 穿 刺 接 种 于 琼 脂 斜 面, 不 要 到 达 底 部, 留 底 部 作 变 色 对 照 培 养 2,4 和 24h 分 别 观 察 结 果, 如 阴 性 应 继 续 培 养 至 4 天, 作 最 终 判 定, 变 为 粉 红 色 为 阳 性 2 氧 化 酶 (Oxidase) 试 验 氧 化 酶 亦 即 细 胞 色 素 氧 化 酶, 为 细 胞 色 素 呼 吸 酶 系 统 的 终 末 呼 吸 酶, 氧 化 酶 先 使 细 胞 色 素 C 氧 化, 然 后 此 氧 化 型 细 胞 色 素 C 再 使 对 苯 二 胺 氧 化, 产 生 颜 色 反 应 第 7 页, 共 19 页

8 试 验 方 法 : 在 琼 脂 斜 面 培 养 物 上 或 血 琼 脂 平 板 菌 落 上 滴 加 试 剂 1~2 滴, 阳 性 者 Kovacs 氏 试 剂 呈 粉 红 色 ~ 深 紫 色,Ewing 氏 改 进 试 剂 呈 蓝 色 阴 性 者 无 颜 色 改 变 应 在 数 分 钟 内 判 定 试 验 结 果 注 意 事 项 : (1) 盐 酸 二 甲 基 对 苯 撑 二 胺 溶 液 容 易 氧 化, 溶 液 应 装 在 棕 色 瓶 中, 并 在 冰 箱 内 保 存, 如 溶 液 变 为 红 褐 色, 即 不 宜 使 用 (2) 铁 镍 铬 丝 等 金 属 可 催 化 二 甲 基 对 苯 撑 二 胺 呈 红 色 反 应, 若 用 它 来 挑 取 菌 苔, 会 出 现 假 阳 性, 故 必 须 用 白 金 丝 或 玻 璃 棒 ( 或 牙 签 ) 来 挑 取 菌 苔 (3) 在 滤 纸 上 滴 加 试 剂, 以 刚 刚 打 湿 滤 纸 为 宜, 如 滤 纸 过 湿, 会 防 碍 空 气 与 菌 苔 接 触, 从 而 延 长 了 反 应 时 间, 造 成 假 阴 性 3 过 氧 化 氢 酶 的 测 定 过 氧 化 氢 酶 又 称 接 触 酶, 能 催 化 过 氧 化 氢 分 解 水 和 氧 1. 试 剂 :3-10% 过 氧 化 氢 (H 2 O 2 ) 2. 菌 种 培 养 : 将 测 试 菌 种 接 种 于 合 适 的 培 养 基 斜 面 上, 适 温 培 养 18-24h 3. 试 验 方 法 : 取 一 干 净 的 载 波 片, 在 上 面 滴 1 滴 3-10% 的 H 2 O 2, 挑 取 1 环 培 养 18-24h 的 菌 苔, 在 H 2 O 2 溶 液 中 涂 抹, 若 有 气 泡 ( 氧 气 ) 出 现, 则 为 过 氧 化 氢 酶 阳 性, 无 气 泡 者 为 阴 性 也 可 将 过 氧 化 氢 溶 液 直 接 加 入 斜 面 上, 观 察 气 泡 的 产 生 4. 注 意 事 项 : 过 氧 化 氢 酶 是 1 种 以 正 铁 血 红 素 作 为 辅 基 的 酶, 所 以 测 试 菌 所 生 长 的 培 养 基 不 可 含 有 血 红 素 或 红 血 球 4 甲 基 红 (Methyl Red) 试 验 肠 杆 菌 科 各 菌 属 都 能 发 酵 葡 萄 糖, 在 分 解 葡 萄 糖 过 程 中 产 生 丙 酮 酸, 进 一 步 分 解 中, 由 于 糖 代 谢 的 途 径 不 同, 可 产 生 乳 酸, 琥 珀 酸 醋 酸 和 甲 酸 等 大 量 酸 性 产 物, 可 使 培 养 基 PH 值 下 降 至 ph4.5 以 下, 使 甲 基 红 指 示 剂 变 红 试 验 方 法 : 挑 取 新 的 待 试 纯 培 养 物 少 许, 接 种 于 MR-VP 生 化 鉴 定 管, 于 36 通 用 培 养 基, 培 养 于 36±1 C 或 30 C( 以 30 C 较 好 )3~5 天, 从 第 二 天 起, 每 日 取 培 养 液 1ml, 加 甲 基 红 指 示 剂 1~2 滴, 阳 性 呈 鲜 红 色, 弱 阳 性 呈 淡 红 色, 阴 性 为 黄 色 迄 至 发 现 阳 性 或 至 第 5 天 仍 为 阴 性 即 可 判 定 结 果 甲 基 红 为 酸 性 指 示 剂,pH 范 围 为 4.4~6.0, 其 pk 值 为 5.0 故 在 ph5.0 以 下, 随 酸 度 而 增 强 黄 色, 在 ph5.0 以 上, 则 随 碱 度 而 增 强 黄 色, 在 ph5.0 或 上 下 接 近 时, 可 能 变 色 不 够 明 显, 此 时 应 延 长 培 养 时 间, 重 复 试 验 5 V-P 试 验 第 8 页, 共 19 页

9 某 些 细 菌 在 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 中 能 分 解 葡 萄 糖 产 生 丙 酮 酸, 丙 酮 酸 缩 合, 脱 羧 成 乙 酰 甲 基 甲 醇, 后 者 在 强 碱 环 境 下, 被 空 气 中 氧 氧 化 为 二 乙 酰, 二 乙 酰 与 蛋 白 胨 中 的 胍 基 生 成 红 色 化 合 物, 称 V-P(+) 反 应 试 验 方 法 : 1)O Meara 氏 法 : 将 试 验 菌 接 种 于 通 用 培 养 基, 于 36±1 C 培 养 48h, 培 养 液 1ml 加 O Meara 试 剂 ( 加 有 0.3% 肌 酸 Creatine 或 肌 酸 酐 Creatinine 的 40% 氢 氧 化 钠 水 溶 液 )1ml, 摇 动 试 管 1~2min, 静 置 于 室 温 或 36±1 C 恒 温 箱, 若 4h 内 不 呈 现 伊 红 即 判 定 为 阴 性 亦 有 主 张 在 48~50 C 水 浴 放 置 2h 后 判 定 结 果 者 2)Barritt 氏 法 : 将 试 验 菌 接 种 于 通 用 培 养 基, 于 36±1 C 培 养 4 天 培 养 液 2.5ml 先 加 入 5 Cα 萘 酚 (2-na-phthol) 纯 酒 精 溶 液 0.6ml, 再 加 40% 氢 氧 化 钾 水 溶 液 0.2ml, 摇 动 2~5min, 阳 性 菌 常 立 即 呈 现 红 色, 若 无 红 色 出 现, 静 置 于 室 温 或 36±1 C 恒 温 箱, 如 2h 内 仍 不 显 现 红 色 可 判 定 为 阴 性 3) 快 速 法 : 将 0.5% 肌 酸 溶 液 2 滴 放 于 小 试 管 中 挑 取 产 酸 反 应 的 三 糖 铁 琼 脂 斜 面 培 养 物 一 接 种 环, 乳 化 接 种 于 其 中, 加 入 5%α- 萘 酚 3 滴,40% 氢 氧 化 钠 水 溶 液 2 滴, 振 动 后 放 置 5min, 判 定 结 果 不 产 酸 的 培 养 物 不 能 使 用 本 试 验 一 般 用 于 肠 杆 菌 科 各 菌 属 的 鉴 别 在 用 于 芽 胞 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 等 其 它 细 菌 时, 通 用 培 养 基 中 的 磷 酸 盐 可 阻 碍 乙 酰 甲 基 醇 的 产 生, 故 应 省 去 或 以 氯 化 钠 代 替 6 含 碳 化 合 物 的 利 用 细 菌 能 否 利 用 某 些 含 碳 化 合 物 作 为 唯 一 碳 源, 反 映 该 菌 是 否 产 生 代 谢 这 种 化 合 物 的 有 关 酶 系, 因 而 作 为 鉴 定 依 据 测 定 的 基 础 培 养 基 配 方 很 多, 因 种 而 异 现 介 绍 1 种 合 成 的 基 础 培 养 基, 有 些 细 菌 还 可 适 当 补 加 各 种 维 生 素 培 养 基 可 制 成 液 体, 分 装 试 管, 也 可 制 成 固 体 平 板 可 用 于 测 定 的 底 物 种 类 很 多, 有 单 糖 双 糖 糖 醇 脂 肪 酸 羟 基 酸 及 其 他 有 机 酸 醇 各 种 氨 基 酸 类 胺 类 以 及 碳 氢 化 合 物 等 糖 的 含 量 一 般 为 1%, 醇 类 酚 类 等 的 含 量 一 般 为 %, 氨 基 酸 的 含 量 一 般 为 0.5% 因 碳 氢 化 合 物 不 溶 于 水, 可 在 液 体 培 养 基 中 振 荡 培 养, 或 加 入 到 45 的 固 体 培 养 基 中, 振 荡 后 立 即 倒 成 平 板 有 些 底 物 不 宜 用 高 压 灭 菌, 可 用 过 滤 法 灭 菌 后 加 入 已 灭 菌 的 基 础 培 养 基 中, 某 些 醇 类 和 酚 类 不 必 灭 菌 接 种 和 观 察 结 果 : 菌 种 最 好 做 成 悬 液, 避 免 带 入 少 量 碳 源 干 扰 试 验 结 果 平 板 培 养 用 接 种 环 点 种, 液 体 培 养 则 用 直 针 接 种 每 一 测 定 菌 必 须 接 种 未 加 碳 水 化 合 物 的 空 白 基 础 培 养 基 作 对 照 适 温 培 养 天 后 观 察, 凡 测 定 菌 在 有 碳 水 化 合 物 的 培 养 基 中 生 长 情 况, 明 显 超 过 空 白 培 养 基 的 生 长 量 为 阳 性, 否 则 为 阴 性 假 若 两 种 培 养 基 上 生 长 情 况 差 别 不 明 显, 开 在 同 一 培 养 基 上 连 续 移 种 3 次, 如 差 别 仍 不 明 显 则 以 阴 性 论 7 葡 萄 糖 的 氧 化 发 酵 试 验 第 9 页, 共 19 页

10 在 细 菌 鉴 定 中, 糖 类 发 酵 产 酸 是 1 项 重 要 依 据 细 菌 对 糖 类 的 利 用 有 2 种 类 型 :1 种 是 从 糖 类 发 酵 产 酸, 不 需 要 以 分 子 氧 作 为 最 终 受 氢 体, 称 发 酵 型 产 酸 ; 另 一 种 则 以 分 子 氧 作 为 最 终 受 氢 体, 称 氧 化 型 产 酸 前 者 包 括 的 菌 种 类 型 为 多 数 氧 化 型 产 酸 量 较 少, 所 产 生 的 酸 常 常 被 培 养 基 中 的 蛋 白 胨 分 解 时 所 产 生 的 胺 所 中 和, 而 不 表 现 产 酸 为 此,Hugh 和 Leifson 提 出 一 种 含 有 低 有 机 氮 的 培 养 基, 用 以 鉴 定 细 菌 从 糖 类 产 酸 是 属 氧 化 型 产 酸 或 发 酵 型 产 酸 这 一 试 验 广 泛 用 于 细 菌 鉴 定 一 般 用 葡 萄 糖 作 为 糖 类 代 表 也 可 利 用 这 一 基 础 培 养 基 来 测 定 细 菌 从 其 他 糖 类 或 醇 类 产 酸 的 能 力 (1) 接 种 : 以 18-24h 的 幼 龄 菌 种, 穿 刺 接 种 在 上 述 培 养 基 中, 每 株 菌 接 4 管, 其 中 2 管 用 油 封 盖 ( 凡 士 林 : 液 体 石 蜡 =1:1 混 合 后 灭 菌 ), 约 加 厘 米 厚, 以 隔 绝 空 气 为 闭 管 另 2 管 不 封 油 为 开 管, 同 时 还 要 有 不 接 种 的 闭 管 作 对 照 适 温 培 养 天 观 察 结 果 (2) 结 果 观 察 : 氧 化 型 产 酸 仅 开 管 产 酸, 氧 化 作 用 弱 的 菌 株 往 往 先 在 上 部 产 碱 (1-2d), 后 来 才 稍 变 酸 发 酵 型 产 酸 则 开 管 及 闭 管 均 产 酸, 如 产 气, 则 在 琼 脂 柱 内 产 生 气 泡 8 糖 或 醇 类 发 酵 试 验 不 同 微 生 物 分 解 利 用 糖 类 的 能 力 有 很 大 差 异, 或 能 利 用 或 不 能 利 用, 能 利 用 者, 或 产 气 或 不 产 气 可 用 指 示 剂 及 发 酵 管 检 验 试 验 方 法 : 以 无 菌 操 作, 用 接 种 针 或 环 移 取 纯 培 养 物 少 许, 接 种 于 发 酵 液 体 培 养 基 管, 若 为 半 固 体 培 养 基, 则 用 接 种 针 作 穿 刺 接 种 接 种 后, 置 36±1.0 C 培 养, 每 天 观 察 结 果, 检 视 培 养 基 颜 色 有 无 改 变 ( 产 酸 ), 小 倒 管 中 有 无 气 泡, 微 小 气 泡 亦 为 产 气 阳 性, 若 为 半 固 体 培 养 基, 则 检 视 沿 穿 刺 线 和 管 壁 及 管 底 有 无 微 小 气 泡, 有 时 还 可 看 出 接 种 菌 有 无 动 力, 若 有 动 力 培 养 物 可 呈 弥 散 生 长 本 试 验 主 要 是 检 查 细 菌 对 各 种 糖 醇 和 糖 苷 等 的 发 酵 能 力, 从 而 进 行 各 种 细 菌 的 鉴 别, 因 而 每 次 试 验, 常 需 同 时 接 种 多 管 一 般 常 用 的 指 示 剂 为 酚 红 溴 甲 酚 紫, 溴 百 里 蓝 和 An-drade 指 示 剂 注 : 对 于 糖 醇 类 发 酵 现 在 一 般 用 糖 醇 类 细 菌 微 量 生 化 鉴 定 管 在 h 即 可 出 结 果 9 硝 酸 盐 (Nitrate) 还 原 试 验 有 些 细 菌 具 有 还 原 硝 酸 盐 的 能 力, 可 将 硝 酸 盐 还 原 为 亚 硝 酸 盐 氨 或 氮 气 等 亚 硝 酸 盐 的 存 在 可 用 硝 酸 试 剂 检 验 试 验 方 法 : 临 试 前 将 试 剂 的 A( 磺 胺 酸 冰 醋 酸 溶 液 ) 和 B(α- 萘 胺 乙 醇 溶 液 ) 试 液 各 0.2ml 等 量 混 合 取 混 合 试 剂 约 0.1ml 加 于 液 体 培 养 物 或 琼 脂 斜 面 培 养 物 表 面, 立 即 或 于 10min 内 呈 现 红 色 即 为 试 验 阳 性, 若 无 红 色 出 现 则 为 阴 性 用 α- 萘 胺 进 行 试 验 时, 阳 性 红 色 消 退 很 快 故 加 入 后 应 立 即 判 定 结 果 进 行 试 验 时 必 须 有 未 接 种 的 培 养 基 管 作 为 阴 性 对 照 α- 萘 胺 具 有 致 癌 性 故 使 用 时 应 加 注 意 第 10 页, 共 19 页

11 10 靛 基 质 (Imdole) 试 验 某 些 细 菌 能 分 解 蛋 白 胨 中 的 色 氨 酸, 生 成 吲 哚 吲 哚 的 存 在 可 用 显 色 反 应 表 现 出 来 吲 哚 与 对 二 甲 基 氨 基 苯 醛 结 合, 形 成 玫 瑰 吲 哚, 为 红 色 化 合 物 试 验 方 法 : 将 待 试 纯 培 养 物 小 量 接 种 于 试 验 培 养 基 管, 于 36±1C 培 养 24h 时 后, 取 约 2ml 培 养 液, 加 入 Kovacs 氏 试 剂 2~3 滴, 轻 摇 试 管, 呈 红 色 为 阳 性, 或 先 加 少 量 乙 醚 或 二 甲 苯, 摇 动 试 管 以 提 取 和 浓 缩 靛 基 质, 待 其 浮 于 培 养 液 表 面 后, 再 沿 试 管 壁 徐 缓 加 入 Kovacs 氏 试 剂 数 滴, 在 接 触 面 呈 红 色, 即 为 阳 性 实 验 证 明 靛 基 质 试 剂 可 与 17 种 不 的 靛 基 质 化 合 物 作 用 而 产 生 阳 性 反 应, 若 先 用 二 甲 苯 或 乙 醚 等 进 行 提 取, 再 加 试 剂, 则 只 有 靛 基 质 或 5- 甲 基 靛 基 质 在 溶 剂 中 呈 现 红 色, 因 而 结 果 更 为 可 靠 11 三 糖 铁 (TSI) 琼 脂 试 验 试 验 方 法 : 以 接 种 针 挑 取 待 试 菌 可 疑 菌 落 或 纯 培 养 物, 穿 刺 接 种 并 涂 布 于 斜 面, 置 36±1 培 养 18~24h, 观 察 结 果 本 试 验 可 同 时 观 察 乳 糖 和 蔗 糖 发 酵 产 酸 或 产 酸 产 气 ( 变 黄 ); 产 生 硫 化 氢 ( 变 黑 ) 葡 萄 糖 被 分 解 产 酸 可 使 斜 面 先 变 黄, 但 因 量 少, 生 成 的 少 量 酸, 因 接 触 空 气 而 氧 化, 加 之 细 菌 利 用 培 养 基 中 含 氮 物 质, 生 成 碱 性 产 物, 故 使 斜 面 后 来 又 变 红, 底 部 由 于 是 在 厌 氧 状 态 下, 酸 类 不 被 氧 化, 所 以 仍 保 持 黄 色 12 氨 基 酸 脱 羧 酶 的 测 定 有 些 细 菌 含 有 氨 基 酸 脱 羧 酶, 使 羧 基 释 出, 生 成 胺 类 和 二 氧 化 碳 此 反 应 在 偏 酸 的 条 件 下 进 行 当 培 养 基 含 胺 类 时 呈 碱 性 反 应, 使 指 示 剂 变 色 接 种 与 观 察 结 果 : 用 幼 龄 培 养 液 作 为 菌 种, 直 接 接 种 接 种 后 封 油, 对 照 管 与 测 定 管 同 时 接 种 封 油 肠 肝 菌 科 的 细 菌 于 37 培 养 4 天 观 察 当 指 示 剂 呈 紫 色 或 带 红 色 调 的 紫 色 者 为 阳 性, 呈 黄 色 者 为 阴 性 对 照 管 应 呈 黄 色 反 应 13 硫 化 氢 (H 2 S) 试 验 有 些 细 菌 可 分 解 培 养 基 中 含 硫 氨 基 酸 或 含 硫 化 合 物, 而 产 生 硫 化 氢 气 体, 硫 化 氢 遇 铅 盐 或 低 铁 盐 可 生 成 黑 色 沉 淀 物 试 验 方 法 : 在 含 有 硫 代 硫 酸 钠 等 指 示 剂 的 培 养 基 中, 沿 管 壁 穿 刺 接 种, 于 36±1 培 养 24~28h, 培 养 基 呈 黑 色 为 阳 性 阴 性 应 继 续 培 养 至 6 天 也 可 用 醋 酸 铅 纸 条 法 : 将 待 试 菌 接 种 于 一 般 营 养 肉 汤, 再 将 醋 酸 铅 纸 条 悬 挂 于 培 养 基 上 空, 以 不 会 被 溅 湿 为 适 度 ; 用 管 塞 压 住 置 36±1 培 养 1~6 天 纸 条 变 黑 为 阳 性 14 柠 檬 酸 盐 或 丙 酸 盐 的 利 用 某 些 细 菌 能 利 用 柠 檬 酸 盐 或 丙 酸 盐 作 为 碳 源, 及 磷 酸 胺 作 为 氮 源, 将 柠 檬 酸 分 解 为 二 氧 化 碳, 则 培 养 基 中 由 于 有 游 离 钠 离 子 存 在 而 呈 碱 性 接 种 与 观 察 结 果 : 取 幼 龄 菌 种 接 种 于 斜 面 上, 适 温 培 养 3-7 天, 培 养 基 呈 碱 性 ( 蓝 色 ) 者 为 阳 性 反 应, 不 变 者 则 为 阴 性 第 11 页, 共 19 页

12 15 利 用 丙 二 酸 盐 试 验 丙 二 酸 盐 是 三 羧 酸 循 环 中 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 抑 制 剂 能 否 利 用 丙 二 酸 盐, 也 是 细 菌 鉴 定 中 的 一 个 鉴 别 性 特 征 许 多 微 生 物 代 谢 有 三 羧 酸 循 环, 而 琥 珀 酸 脱 氢 是 三 羧 酸 循 环 的 一 个 环 节, 丙 二 酸 与 琥 珀 酸 竞 争 琥 珀 酸 脱 氢 酶, 与 丙 二 酸 不 被 分 解, 所 以 琥 珀 酸 脱 氢 酶 被 占 据, 不 能 释 放 出 来 催 化 琥 珀 酸 脱 氢 反 应, 抑 制 了 三 羧 酸 循 环 接 种 和 观 察 结 果 : 用 幼 龄 菌 种 接 种 测 定 培 养 基 和 空 白 培 养 基, 于 适 温 培 养 1-2d, 观 察 培 养 基 变 色 情 况 如 测 定 培 养 基 生 长 并 变 蓝 色, 表 示 可 利 用 丙 二 酸 盐, 为 阳 性 结 果 反 之, 如 测 定 培 养 基 未 变 色, 而 空 白 对 照 培 养 基 生 长, 则 为 阴 性, 即 不 利 用 丙 二 酸 盐 16 葡 萄 糖 酸 盐 的 氧 化 假 单 胞 菌 属 和 肠 道 杆 菌 科 的 细 菌, 可 氧 化 葡 萄 糖 酸 为 2- 酮 基 葡 萄 糖 酸 葡 萄 糖 酸 无 还 原 性 基 团, 氧 化 后 形 成 酮 基, 则 可 将 斐 林 氏 试 剂 的 呈 蓝 色 的 铜 盐 还 原 为 砖 红 色 的 Cu 2 O 沉 淀 试 验 方 法 : 用 ph7.2 的 磷 酸 缓 冲 液 配 制 成 含 1% 葡 萄 糖 酸 盐 ( 可 用 葡 萄 糖 酸 钠 或 葡 萄 糖 酸 钙 ) 的 溶 液 分 装 试 管, 每 管 2mL 刮 取 适 温 培 养 小 时 的 菌 苔 至 2mL 的 葡 萄 糖 酸 盐 溶 液 中 制 成 浓 的 菌 悬 液, 置 30 过 夜, 然 后 每 管 加 入 0.5mL 的 斐 林 试 剂, 放 在 沸 水 浴 中 加 热 10 分 钟, 试 管 中 液 体 由 蓝 色 变 为 黄 绿, 绿 橙 色 或 出 现 红 色 沉 淀 者 为 阳 性 反 应, 如 溶 液 不 变 色 者 为 阴 性 17 硫 化 氢 - 靛 基 质 - 动 力 (SIM) 琼 脂 试 验 试 验 方 法 : 以 接 种 针 挑 取 菌 落 或 纯 养 物 穿 刺 接 种 约 1/2 深 度, 置 36±1 培 养 18~24h, 观 察 结 果 培 养 物 呈 现 黑 色 为 硫 化 氢 阳 性, 混 浊 或 沿 穿 刺 线 向 外 生 长 为 有 动 力, 然 后 加 Kovacs 氏 试 剂 数 滴 于 培 养 表 面, 静 置 10min, 若 试 剂 呈 红 色 为 靛 基 质 阳 性 培 养 基 未 接 种 的 下 部, 可 作 为 对 照 本 试 验 用 于 肠 杆 菌 科 细 菌 初 步 生 化 筛 选, 与 三 糖 铁 琼 脂 等 联 合 使 用 可 显 著 提 高 筛 选 功 效 18 β- 半 乳 糖 苷 酶 (ONPG) 的 测 定 本 试 验 应 用 于 肠 肝 菌 科 的 鉴 定 测 定 步 骤 : (1) 将 测 定 菌 接 种 于 TSI 斜 面 上, 培 养 于 37 18h( 或 其 他 最 适 温 度 ) (2) 挑 取 1 大 环 菌 苔 入 约 0.25mL 的 生 理 盐 水 中 制 成 菌 悬 液, 每 管 加 1 滴 甲 苯, 摇 匀 ( 有 助 于 酶 的 释 放 ), 于 37 放 置 5 分 钟 第 12 页, 共 19 页

13 (3) 在 菌 悬 液 中 加 入 0.25mL 的 0.75mol/L ONPG, 测 定 管 置 于 37 水 浴 培 养 经 30 分 h 进 行 观 察, 如 有 黄 色 者 则 为 阳 性 19 耐 盐 性 试 验 本 试 验 是 观 察 渗 透 压 对 细 菌 生 长 的 影 响 由 于 不 同 菌 类 耐 盐 性 不 同, 故 常 以 此 作 为 鉴 别 特 征 一 般 可 根 据 不 同 种 类 的 菌 株, 选 择 其 适 合 生 长 的 培 养 基, 在 其 中 加 入 不 同 量 的 NaCl, 接 种 后 观 察 其 生 长 与 否, 以 判 断 其 耐 盐 性 以 肉 汤 培 养 液 根 据 鉴 定 需 要, 配 成 不 同 浓 度 的 NaCl, 如 2% 3.5% 5% 7% 10% 等 培 养 基 要 求 十 分 澄 清, 接 种 时 应 采 用 幼 龄 菌 液, 直 针 接 种, 适 温 培 养 3-7d, 与 未 接 种 的 对 照 管 对 比, 目 测 生 长 情 况 20 卵 磷 脂 酶 的 测 定 菌 体 如 存 在 有 卵 磷 脂 酶, 就 能 使 卵 磷 脂 分 解 生 成 脂 肪 和 水 溶 性 的 磷 酸 胆 碱 接 种 与 观 察 结 果 : 将 测 试 菌 的 菌 液, 环 接 在 有 卵 黄 的 试 管 和 不 加 卵 黄 的 对 照 管 中, 适 温 培 养 1 3 或 5 天 观 察 假 若 与 对 照 管 相 比 较, 在 卵 黄 胰 胨 液 中 或 表 面, 形 成 白 色 沉 淀 者, 则 为 阳 性 反 应, 表 示 卵 磷 脂 被 分 解, 生 成 脂 肪 和 水 溶 性 的 磷 酸 胆 碱, 说 明 有 卵 磷 酶 的 存 在 另 一 种 方 法 : 以 无 菌 操 作 取 出 卵 黄, 放 入 灭 菌 的 三 角 瓶 中, 加 相 当 于 等 量 的 生 理 盐 水 摇 匀 后, 取 10mL 卵 黄 液 加 入 到 溶 化 的 约 的 200mL 肉 汁 胨 琼 脂 培 养 基 中, 混 合 均 匀 后 倒 入 培 养 皿, 制 成 卵 黄 平 板, 过 夜 后 即 可 使 用 接 种 与 观 察 结 果 : 将 测 试 菌 点 接 在 卵 黄 平 板 上, 每 皿 可 分 散 点 接 4-5 株 菌 ( 芽 孢 杆 菌 以 点 接 1-2 株 菌 为 宜 ) 以 不 影 响 结 果 观 察 为 度, 如 测 试 厌 氧 菌, 则 须 在 上 面 加 盖 无 菌 的 盖 玻 片 每 株 菌 至 少 重 复 点 接 两 皿 适 温 培 养 1-2d 观 察, 在 菌 落 周 围 形 成 乳 白 色 混 浊 环, 表 示 卵 磷 脂 被 分 解, 生 成 脂 肪, 说 明 该 菌 株 有 卵 磷 脂 酶 存 在 21 石 蕊 牛 奶 的 反 应 牛 奶 中 主 要 含 有 乳 糖 和 酪 蛋 白, 在 牛 奶 中 加 入 石 蕊 是 作 为 酸 碱 指 示 剂 和 氧 化 还 原 指 示 剂 石 蕊 在 中 性 时 呈 淡 紫 色, 酸 性 时 呈 粉 红 色, 碱 性 呈 蓝 色, 还 原 时 则 自 上 而 下 地 褪 色 变 白 细 菌 对 牛 奶 的 作 用 有 一 下 几 种 : (1) 产 酸 细 菌 发 酵 乳 糖 产 酸, 使 石 蕊 变 红 (2) 产 碱 细 菌 分 解 酪 蛋 白 产 生 碱 性 物 质, 使 石 蕊 变 蓝 (3) 胨 化 细 菌 产 生 蛋 白 酶, 使 酪 蛋 白 分 解, 故 牛 奶 变 得 比 较 澄 清 (4) 酸 凝 固 细 菌 发 酵 乳 糖 产 酸, 使 石 蕊 变 化, 当 酸 度 很 高 时, 可 使 牛 奶 凝 固 第 13 页, 共 19 页

14 (5) 凝 乳 酶 凝 固 有 些 细 菌 能 产 生 凝 乳 酶, 使 牛 奶 中 的 酪 蛋 白 凝 固, 此 时 石 蕊 常 呈 蓝 色 或 不 变 色 (6) 还 原 细 菌 生 长 旺 盛, 使 培 养 基 氧 化 还 原 电 位 降 低, 因 此 石 蕊 还 原 褪 色 接 种 与 观 察 结 果 : 接 种 待 测 菌 株, 适 温 培 养 3 5 7d 或 14d, 按 上 述 特 征 观 察 和 记 录 牛 奶 产 酸 产 碱 凝 固 或 胨 化 等 反 应 22 酪 素 水 解 试 验 ( 酪 蛋 白 水 解 ) 牛 奶 平 板 的 制 备 : 取 5g 脱 脂 奶 粉 加 入 50mL 蒸 馏 水 中 ( 或 用 50mL 脱 脂 牛 奶 ), 另 称 1.5g 琼 脂 溶 于 50mL 蒸 馏 水 中, 将 两 液 分 开 灭 菌 待 冷 至 时, 将 两 液 混 匀 倒 平 板, 即 成 牛 奶 平 板 将 平 板 倒 置 过 夜, 使 表 面 水 分 干 燥, 然 后 将 菌 种 点 接 在 平 板 上, 每 皿 可 点 接 3-5 株 菌 适 温 培 养 天, 记 录 菌 落 周 围 和 下 面 酪 素 是 否 已 被 分 解 而 呈 透 明 配 制 该 培 养 基 时, 切 勿 将 牛 奶 和 琼 脂 混 合 灭 菌, 以 防 牛 奶 凝 固 23 酪 氨 酸 水 解 将 L- 酪 氨 酸 0.5g 悬 浮 于 10mL 蒸 馏 水 中,8 磅 20 分 钟 灭 菌, 然 后 于 100mL 无 菌 的 营 养 肉 汤 琼 脂 混 合, 倾 倒 平 板, 待 凝 固 后, 将 测 试 菌 接 种 于 平 皿 上, 培 养 7 到 14d, 记 录 酪 氨 酸 结 晶 是 否 被 水 解 而 变 透 明 24 苯 丙 氨 酸 脱 氨 试 验 某 些 细 菌 ( 如 变 形 杆 菌 ) 具 有 苯 丙 氨 酸 脱 氨 酶, 能 将 苯 丙 氨 酸 氧 化 脱 氨, 形 成 苯 丙 酮 酸, 苯 丙 酮 酸 遇 到 三 氯 化 铁 呈 蓝 绿 色 本 试 验 用 于 肠 肝 菌 科 和 某 些 芽 孢 杆 菌 属 的 鉴 定 接 种 与 观 察 结 果 : 将 菌 种 接 种 于 该 培 养 基 斜 面 上, 适 温 培 养 3-7d( 某 些 芽 孢 杆 菌 须 培 养 21d) 取 10% 的 FeCl 3 水 溶 液 4-5 滴, 滴 加 在 生 长 菌 苔 的 斜 面 上, 当 斜 面 和 试 剂 液 面 处 呈 蓝 绿 色 时 为 阳 性 反 应, 表 示 从 苯 丙 氨 酸 形 成 苯 丙 酮 酸 25 产 糊 精 结 晶 试 验 某 些 需 氧 芽 孢 杆 菌 能 产 生 淀 粉 酶, 使 淀 粉 水 解 为 糊 精 该 反 应 仅 用 于 区 别 多 粘 芽 孢 菌, 浸 麻 芽 孢 菌 和 环 状 芽 孢 菌 的 培 养 物 在 大 试 管 中 (200X20mm) 装 碾 过 的 小 麦 ( 或 燕 麦 )0.5g,CaCO 3 0.2g, 蒸 馏 水 10mL, 灭 菌 后 接 种,35 培 养 3 5 和 7d 后, 取 1 滴 卢 哥 尔 氏 碘 液 混 匀, 干 燥 后, 用 显 微 镜 观 察 有 暗 褐 色 或 蓝 色 的 六 角 形 结 晶 的 糊 精, 假 若 大 量 形 成, 则 排 列 为 扇 形 或 针 状 26 从 甘 油 产 生 二 羟 基 丙 酮 本 试 验 主 要 是 用 于 区 分 醋 酸 单 胞 菌 属 和 假 单 胞 菌 属 以 及 某 些 芽 孢 杆 菌 的 鉴 定 生 酮 反 应 是 由 相 应 的 多 元 醇 的 脱 氢 酶 的 作 用, 此 反 应 就 是 测 定 有 否 这 些 脱 氢 酶 第 14 页, 共 19 页

15 接 种 与 观 察 结 果 : 融 化 三 角 瓶 中 的 培 养 基, 倒 成 平 板, 凝 固 后 在 平 板 上 划 短 线 接 种, 适 温 培 养 10 天, 在 平 板 上 倒 入 斐 林 试 剂 A B 混 合 液, 以 覆 盖 菌 落 为 度, 2 小 时 内 检 查, 若 在 菌 落 周 围 出 现 红 色 的 晕 者 为 阳 性 反 应 为 了 能 掌 握 这 一 试 验, 可 接 种 多 粘 芽 孢 杆 菌 作 阳 性 对 照 27 厌 氧 硝 酸 盐 产 气 在 厌 氧 情 况 下, 有 些 好 氧 细 菌, 能 以 硝 酸 盐 代 替 分 子 氧 作 为 受 氢 体, 进 行 厌 氧 呼 吸, 将 硝 酸 盐 还 原 为 气 态 氮, 即 为 土 壤 中 的 反 硝 化 作 用 某 些 芽 孢 杆 菌, 假 单 胞 菌 及 产 碱 菌 等 属 的 细 菌 具 有 此 反 应 接 种 封 油 : 以 斜 面 菌 种 用 接 种 环 接 种 后, 用 凡 士 林 油 ( 凡 士 林 和 液 体 石 蜡 为 1:1) 封 管, 封 油 的 高 度 约 1 厘 米 必 须 同 时 接 种 不 含 有 硝 酸 钾 的 肉 汁 胨 培 养 液 作 对 照 观 察 结 果 : 培 养 2-7d, 观 察 在 含 有 硝 酸 钾 的 培 养 基 中 有 否 生 长 和 产 生 气 泡 如 有 气 泡 产 生, 表 示 反 硝 化 作 用 产 生 氮 气, 为 阳 性 反 应 但 如 不 含 硝 酸 钾 的 对 照 培 养 基 也 可 产 生 气 泡, 则 只 能 按 可 疑 或 阴 性 处 理 28 马 尿 酸 盐 水 解 试 验 本 试 验 作 为 区 分 某 些 芽 孢 杆 菌 的 鉴 定 和 黄 单 胞 菌 属 的 鉴 定 之 用 接 种 和 观 察 结 果 : 以 幼 龄 菌 种 接 种 于 上 述 培 养 液 中, 适 温 培 养 4 周 ( 高 温 芽 孢 菌 培 养 2 周 ), 取 1mL 培 养 物, 和 1.5mL50% 的 ; 硫 酸 混 合, 静 置 片 刻, 在 酸 性 混 合 物 中 有 针 状 结 晶 出 现 为 阳 性, 证 明 从 马 尿 酸 盐 形 成 安 息 香 酸 29 对 叠 氮 化 钠 的 抗 性 本 试 验 用 于 高 温 芽 孢 杆 菌 的 测 定 接 种 和 观 察 结 果 : 取 1 环 幼 龄 的 菌 液, 接 种 于 上 述 培 养 基 中, 同 时 接 种 营 养 肉 汤 作 为 对 照 45 培 养 7 至 14d 观 察 生 长 情 况 30 氰 化 钾 试 验 氰 化 钾 (KCN) 是 呼 吸 链 末 端 抑 制 剂 能 否 在 含 有 氰 化 钾 的 培 养 基 中 生 长, 是 鉴 别 肠 杆 菌 科 各 属 常 用 的 特 征 之 一 接 种 和 观 察 结 果 : 用 幼 龄 菌 种 接 种 于 加 氰 化 钾 的 测 定 培 养 基 和 未 加 氰 化 钾 的 空 白 培 养 基 中, 适 温 培 养 1-2d, 观 察 生 长 情 况 能 在 测 定 培 养 基 上 生 长 者, 表 示 氰 化 钾 对 测 定 菌 无 毒 害 作 用, 为 阳 性 若 在 测 定 培 养 基 和 空 白 培 养 基 上 均 不 生 长, 表 示 空 白 培 养 基 的 营 养 成 分 不 适 于 测 定 菌 第 15 页, 共 19 页

16 的 生 长, 必 须 选 用 其 它 合 适 的 培 养 基 而 测 定 菌 在 空 白 培 养 基 上 能 生 长, 在 含 氰 化 钾 的 测 定 培 养 基 上 不 生 长, 为 阴 性 结 果 应 该 注 意 : 氰 化 钾 是 剧 毒 药 品, 操 作 时 必 须 小 心 培 养 基 用 毕, 每 管 加 几 粒 硫 酸 亚 铁 和 0.5mL20%KOH 以 解 毒, 然 后 清 洗 31 对 溶 菌 酶 抗 性 的 测 定 在 100mL 的 三 角 瓶 中, 放 入 60-65mL 无 菌 的 0.01mol/L HCL, 在 其 中 加 入 0.1g 溶 菌 酶, 瓶 上 塞 无 菌 棉 花, 在 小 火 上 煮 沸 20 分 钟 后, 冷 到 室 温, 加 无 菌 的 0.01mol/L HCL 补 足 到 100mL 取 1mL 溶 菌 酶 溶 液 与 99mL 无 菌 的 肉 汤 培 养 液 混 合, 分 装 无 菌 试 管, 每 管 2.5mL, 在 含 有 0.001% 溶 菌 酶 肉 汤 管 子 及 无 溶 菌 酶 的 营 养 肉 汤 对 照 管 中, 各 接 种 1 环 菌 液, 适 温 培 养 5-7d, 记 录 两 管 的 生 长 情 况 32 在 ph5.7 营 养 肉 汤 上 的 生 长 本 试 验 应 用 于 芽 孢 杆 菌 属 中 种 的 鉴 定 接 种 和 观 察 结 果 : 取 菌 液 一 环, 接 种 于 上 述 培 养 基 中, 同 时 接 种 普 通 肉 汤 液 (7.2pH) 作 对 照 适 温 培 养 1-3d 后 观 察 生 长 情 况 该 培 养 液 要 求 十 分 澄 清,pH 必 须 准 确, 最 好 用 ph 计 调 测 33 需 氧 性 试 样 若 在 培 养 基 中 加 入 还 原 剂, 如 巯 基 醋 酸 钠 和 甲 醛 次 硫 酸 钠 等, 以 除 去 培 养 基 中 的 氧 气 或 氧 化 型 物 质, 使 厌 氧 菌 能 在 有 氧 情 况 下 生 长 1. 接 种 与 观 察 结 果 : 用 1 小 环 ( 外 径 1.5 毫 米 的 接 种 环 ) 的 肉 汤 菌 液, 穿 刺 接 种 到 上 述 培 养 基 中, 必 须 穿 刺 到 管 底 30 培 养, 分 别 在 3 至 7 天 观 察 结 果 如 细 菌 在 琼 脂 柱 表 面 上 生 长 者 为 好 氧 菌, 如 沿 着 穿 刺 线 上 生 长 者 为 厌 氧 菌 或 兼 性 厌 氧 菌 34 明 胶 (Gelatin) 液 化 试 验 有 些 细 菌 具 有 明 胶 酶 ( 亦 称 类 蛋 白 水 解 酶 ), 能 将 明 胶 先 水 解 为 多 肽, 又 进 一 步 水 解 为 氨 基 酸, 失 去 凝 胶 性 质 而 液 化 试 验 方 法 : 挑 取 18~24h 待 试 菌 培 养 物, 以 较 大 量 穿 刺 接 种 于 明 胶 高 层 约 2/3 深 度 或 点 种 于 平 板 培 养 基 于 20~22 培 养 7~14 天 明 胶 高 层 亦 可 培 养 于 36±1 每 天 观 察 结 果, 若 因 培 养 温 度 高 而 使 明 胶 本 身 液 化 时 应 不 加 摇 动 静 置 冰 箱 中 待 其 凝 固 后 再 观 察 其 是 否 被 细 菌 液 化, 如 确 被 液 化, 即 为 试 验 阳 性 平 板 试 验 结 果 的 观 察 为 在 培 养 基 平 板 点 种 的 菌 落 上 滴 加 试 剂, 若 为 阳 性,10~20min 后, 菌 落 周 围 应 出 现 清 晰 带 环 否 则 为 阴 性 35 淀 粉 水 解 试 验 第 16 页, 共 19 页

17 某 些 细 菌 可 以 产 生 分 解 淀 粉 的 酶, 把 淀 粉 水 解 为 麦 芽 糖 或 葡 萄 糖 淀 粉 水 解 后, 遇 碘 不 再 变 蓝 色 试 验 方 法 : 以 18~24h 的 纯 培 养 物, 涂 布 接 种 于 淀 粉 琼 脂 斜 面 或 平 板 ( 一 个 平 板 可 分 区 接 种, 试 验 数 种 培 养 物 ) 或 直 接 移 种 于 淀 粉 肉 汤 中, 于 36±1 C 培 养 24~48h, 或 于 20 培 养 5 天 然 后 将 碘 试 剂 直 接 滴 浸 于 培 养 表 面, 若 为 液 体 培 养 物, 则 加 数 滴 碘 试 剂 于 试 管 中 立 即 检 视 结 果, 阳 性 反 应 ( 淀 粉 被 分 解 ) 为 琼 脂 培 养 基 呈 深 蓝 色 菌 落 或 培 养 物 周 围 出 现 无 色 透 明 环 或 肉 汤 颜 色 无 变 化 阴 性 反 应 则 无 透 明 环 或 肉 汤 呈 深 蓝 色 淀 粉 水 解 系 逐 步 进 行 的 过 程, 因 而 试 验 结 果 与 菌 种 产 生 淀 粉 酶 的 能 力 培 养 时 间, 培 养 基 含 有 淀 粉 量 和 ph 等 均 有 一 定 关 系 培 养 基 ph 必 须 为 中 性 或 微 酸 性, 以 ph7.2 最 适 淀 粉 琼 脂 平 板 不 宜 保 存 于 冰 箱, 因 而 以 临 用 时 制 备 为 妥 36 生 长 温 度 的 测 定 细 菌 生 长 的 最 高 最 适 和 最 低 温 度, 常 常 是 某 些 细 菌 鉴 定 的 特 征 之 一 测 定 细 菌 的 生 长 温 度, 要 求 培 养 液 十 分 清 晰 ( 如 普 通 肉 汤 培 养 液 ), 并 采 用 液 体 菌 种 直 针 接 种 ( 不 用 接 种 环 接 种 ) 放 置 于 恒 温 水 浴 培 养 指 示 温 度 计 应 放 在 同 样 的 试 管 和 培 养 基 内, 在 指 定 温 度 下 培 养 2-5d, 观 察 生 长 情 况 在 接 近 0 的 低 温 培 养, 则 观 察 时 间 可 延 长 至 7-10d, 甚 至 30d 观 察 记 录 结 果 : 目 测 生 长 情 况, 与 未 接 种 的 空 白 培 养 基 对 比, 注 意 混 浊 度 沉 淀 物 和 悬 浮 物 等 项, 并 分 级 记 录 如 下 : (1) + : 表 示 生 长 良 好 ; 与 对 照 管 相 比, 可 清 楚 地 判 定 是 混 浊 的 (2) +- : 表 示 生 长 差 ; 与 对 照 管 相 比, 只 有 在 某 一 观 察 角 度 时 方 能 看 到 明 显 的 混 浊 (3) - : 表 示 不 生 长 ; 在 适 宜 的 角 度 下 观 察, 与 对 照 无 差 异 总 之, 培 养 5d, 能 生 长 者 均 按 生 长 计, 否 则 按 不 生 长 计, 凡 培 养 5d 仍 属 可 疑 者 或 不 生 长 者 必 须 重 测, 在 重 测 时, 可 能 出 现 有 时 生 长, 有 时 不 生 长 的 不 稳 定 现 象, 这 可 能 有 两 种 原 因 : 一 种 是 水 浴 温 度 不 稳 定, 培 养 时 温 度 波 动 大 ; 另 一 种 原 因 可 能 是 所 测 定 的 温 度, 恰 好 是 测 定 菌 的 临 界 生 长 温 度, 在 这 种 情 况 下, 可 用 提 高 一 度 或 降 低 一 度 的 办 法 肯 定 之 必 须 注 意, 当 测 定 的 试 管 较 多 时, 不 可 将 试 管 捆 成 一 捆 浸 于 水 浴 中, 这 样 捆 着 的 试 管 内 外 温 度 不 一 致, 易 出 现 误 差 最 好 用 特 制 试 管 架 放 试 管, 所 用 温 度 计 应 用 标 准 温 度 计 标 定 过 37 形 成 芽 孢 的 培 养 基 形 成 芽 孢 是 芽 孢 杆 菌 的 关 键 性 特 征, 但 不 是 所 有 的 芽 孢 杆 菌 都 能 在 任 何 条 件 下 形 成 芽 孢 在 鉴 定 细 菌 时, 为 了 确 定 是 否 属 芽 孢 菌, 需 要 对 那 些 在 一 般 条 件 下 不 形 成 芽 孢 的 细 菌, 采 用 生 孢 子 培 养 基, 来 确 定 是 否 能 形 成 芽 孢 第 17 页, 共 19 页

18 38 O/129 的 敏 感 性 试 验 O/129 即 2,4- 二 氨 基 -6,7- 二 异 丙 醇 喋 啶, 为 弧 菌 抑 制 剂 该 试 验 用 于 弧 菌 属 气 单 胞 菌 属 和 假 单 胞 菌 属 的 鉴 定 取 2,4- 二 氨 基 -6,7- 二 异 丙 醇 喋 啶 150mg, 溶 于 10mL1:1 的 乙 醇 : 二 乙 基 乙 醚 中 把 6mm 大 小 的 滤 纸 片 浸 入 该 溶 液 后 取 出, 在 空 气 中 晾 杆, 然 后 放 在 带 菌 的 半 固 体 培 养 基 上 做 扩 散 敏 感 试 验 三 血 清 学 试 验 血 清 学 反 应 是 指 : 相 应 的 抗 原 与 抗 体 在 体 外 一 定 条 件 下 作 用, 可 出 现 肉 眼 可 见 的 沉 淀 凝 集 现 象 在 食 品 微 生 物 检 验 中, 常 用 血 清 学 反 应 来 鉴 定 分 离 到 的 细 菌, 以 最 终 确 认 检 测 结 果 血 清 学 反 应 的 一 般 特 点 : 1) 抗 原 体 的 结 合 具 有 特 异 性, 当 有 共 同 抗 原 体 存 在 时, 会 出 现 交 叉 反 应 2) 抗 原 体 的 结 合 是 分 子 表 面 的 结 合, 这 种 结 合 虽 相 当 稳 定, 但 是 可 逆 的 3) 抗 原 体 的 结 合 是 按 一 定 比 例 进 行 的, 只 有 比 例 适 当 时, 才 能 出 现 可 见 反 应 4) 血 清 学 反 应 大 体 分 为 两 个 阶 段 进 行, 但 其 间 无 严 格 界 限 第 一 阶 段 为 抗 原 体 特 异 性 结 合 阶 段, 反 应 速 度 很 快, 只 需 几 秒 至 几 分 钟 反 应 即 可 完 毕, 但 不 出 现 肉 眼 可 见 现 象 第 二 阶 段 为 抗 原 体 反 应 的 可 见 阶 段, 表 现 为 凝 集 沉 淀 补 体 结 合 反 应 等 反 应 速 度 慢, 需 几 分 几 十 分 以 至 更 长 时 间 而 且, 在 第 二 阶 段 反 应 中, 电 解 质 PH 温 度 等 环 境 因 素 的 变 化, 都 直 接 影 响 血 清 学 反 应 的 结 果 习 惯 上 将 经 典 的 血 清 学 反 应 分 三 种 类 别 : 凝 集 反 应 沉 淀 反 应 和 补 体 结 合 反 应 1 凝 集 反 应 颗 粒 性 抗 原 ( 细 菌 红 细 胞 等 ) 与 相 应 抗 体 结 合, 在 电 解 质 参 与 下 所 形 成 的 肉 眼 可 见 的 凝 集 现 象, 称 为 凝 集 反 应 (Agglutination reaction) 其 中 的 抗 原 称 为 凝 集 原, 抗 体 称 为 凝 集 素 在 该 反 应 中, 因 为 单 位 体 积 抗 体 量 大, 做 定 量 实 验 时, 应 稀 释 抗 体 1) 直 接 凝 集 反 应 颗 粒 性 抗 原 与 相 应 抗 体 直 接 结 合 所 出 现 的 反 应, 称 为 直 接 凝 集 反 应 (Direct agglution reaction) a. 玻 片 凝 集 法 是 一 种 常 规 的 定 性 试 验 方 法 原 理 是 用 已 知 抗 体 来 检 测 未 知 抗 原 常 用 于 鉴 定 菌 种 血 型 如 将 含 有 痢 疾 杆 菌 抗 体 的 血 清 与 待 检 菌 液 各 一 滴, 在 玻 片 上 混 匀, 数 分 种 后 若 出 现 肉 眼 可 见 的 凝 集 块, 即 阳 性 反 应, 证 明 该 菌 是 痢 疾 杆 菌 此 法 快 速 简 便, 但 不 能 进 行 定 量 测 定 第 18 页, 共 19 页

19 b. 试 管 凝 集 法 是 一 种 定 量 试 验 方 法 多 用 已 知 抗 原 来 检 测 血 清 中 有 无 相 应 抗 体 及 其 含 量 常 用 于 协 助 诊 断 某 些 传 染 病 及 进 行 流 行 病 学 调 查 如 肥 达 氏 反 应 就 是 诊 断 伤 寒 付 伤 寒 的 试 管 凝 集 试 验 因 为 要 测 定 抗 体 的 含 量, 故 将 待 检 查 的 血 清 用 等 渗 盐 水 倍 比 稀 释 成 不 同 浓 度, 然 后 加 入 等 量 抗 原,37 或 56,2~4 小 时 观 察, 血 清 最 高 稀 释 度 仍 有 明 显 凝 集 现 象 的, 为 该 抗 血 清 的 凝 集 效 价 2) 间 接 凝 集 反 应 将 可 溶 性 抗 原 ( 抗 体 ) 先 吸 附 在 一 种 与 免 疫 无 关 的, 颗 粒 状 微 球 表 面, 然 后 与 相 应 抗 体 ( 抗 原 ) 作 用, 在 有 电 解 质 存 在 的 条 件 下, 即 可 发 生 凝 集, 称 为 间 接 凝 集 反 应 (Indirect agglutination) 由 于 载 体 增 大 了 可 溶 性 抗 原 的 反 应 面 积 当 载 体 上 有 少 量 抗 原 与 抗 体 结 合 就 出 现 肉 眼 可 见 的 反 应, 敏 感 性 很 高 2 沉 淀 反 应 可 溶 性 抗 原 与 相 应 抗 体 结 合, 在 有 适 量 电 解 质 存 在 下, 经 过 一 定 时 间, 形 成 肉 眼 可 见 的 沉 淀 物, 称 为 沉 淀 反 应 (Precipitation) 反 应 中 的 抗 原 称 为 沉 淀 原, 抗 体 为 沉 淀 素 由 于 在 单 位 体 积 内 抗 原 量 大, 为 了 不 使 抗 原 过 剩, 故 应 稀 释 抗 原, 并 以 抗 原 的 稀 释 度 作 为 沉 淀 反 应 的 效 价 1) 环 状 沉 淀 反 应 : 是 一 种 定 性 试 验 方 法, 可 用 已 知 抗 体 检 测 未 知 抗 原 将 已 知 抗 体 注 入 特 制 小 试 管 中, 然 后 沿 管 壁 徐 徐 加 入 等 量 抗 原, 如 抗 原 与 抗 体 对 应, 则 在 两 液 界 面 出 现 白 色 的 沉 淀 圆 环 2) 絮 状 沉 淀 反 应 : 将 已 知 抗 原 与 抗 体 在 试 管 ( 如 凹 玻 片 ) 内 混 匀, 如 抗 原 抗 体 对 应, 而 又 二 者 比 例 适 当 时, 会 出 现 肉 眼 可 见 的 絮 状 沉 淀, 此 为 阳 性 反 应 3) 琼 脂 扩 散 试 验 : 利 用 可 溶 性 抗 原 抗 体 在 半 固 体 琼 脂 内 扩 散, 若 抗 原 抗 体 对 应, 且 二 者 比 例 合 适, 在 其 扩 散 的 某 一 部 分 就 会 出 现 白 色 的 沉 淀 线 每 对 抗 原 抗 体 可 形 成 一 条 沉 淀 线 有 几 对 抗 原 抗 体, 就 可 分 别 形 成 几 条 沉 淀 线 琼 脂 扩 散 可 分 为 单 向 扩 散 和 双 向 扩 散 两 种 类 型 单 向 扩 散 是 一 种 定 量 试 验 可 用 于 免 疫 蛋 白 含 量 的 测 定 而 双 向 扩 散 多 用 于 定 性 试 验 由 于 方 法 简 便 易 行, 常 用 于 测 定 分 析 和 鉴 定 复 杂 的 抗 原 成 分 3 补 体 结 合 反 应 补 体 结 合 反 应 (Complement fixation reaction) 是 在 补 体 参 与 下, 以 绵 羊 红 细 胞 和 溶 血 素 作 为 指 示 系 统 的 抗 原 抗 体 反 应 补 体 无 特 异 性, 能 与 任 何 一 组 抗 原 抗 体 复 合 物 结 合 而 引 起 反 应 如 果 补 体 与 绵 羊 红 细 胞 溶 血 素 的 复 合 物 结 合, 就 会 出 现 溶 血 现 象, 如 果 与 细 菌 及 相 应 抗 体 复 合 物 结 合, 就 会 出 现 溶 菌 现 象 因 此, 整 个 试 验 需 要 有 补 体 待 检 系 统 ( 已 知 抗 体 或 抗 原 未 知 抗 原 或 抗 体 ) 及 指 示 系 统 ( 绵 羊 细 胞 和 溶 血 素 ) 五 种 成 份 参 加 其 试 验 原 理 是 补 体 不 单 独 和 抗 原 或 抗 体 结 合 如 果 出 现 溶 菌, 是 补 体 与 待 检 系 统 结 合 的 结 果, 说 明 抗 原 抗 体 是 相 对 应 的, 如 果 出 现 溶 血, 说 明 抗 原 抗 体 不 相 对 应 此 反 应 操 作 复 杂, 敏 感 性 高, 特 异 性 强, 能 测 出 少 量 抗 原 和 抗 体, 所 以 应 用 范 围 较 广 第 19 页, 共 19 页