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1 色谱 气相色谱高效液相色谱毛细管电泳

2 色谱法 色谱法 : 根据各物质在流动相与固定相中分配系数 ( 溶解或吸附的能力 ) 的不同而进行分离 分析的方法 各组分被分离后, 可进一步进行定性和定量分析 展开板 展开槽 a 3 a 2 b R f1 a 1 b a 1 展开板

3 色谱分离 淋洗液 慢 中等 快 Temporal course

4 色谱分类 - 按两相的物理状态分类 气相色谱法 (gas chromatography 简称 GC) 液相色谱法 (liquid chromatography 简称 LC) 超临界流体色谱法 (Supercritical Fluid Chromatography 简称 SFC )

5 气相色谱 气相色谱法的分离原理是利用要分离的诸组分在流动相 ( 载气 ) 和固定相两相间的分配有差异 ( 即有不同的分配系数 ), 当两相作相对运动时, 这些组分在两相间的分配反复进行, 从几千次到数百万次, 即使组分的分配系数只有微小的差异, 随着流动相的移动可以有明显的差距, 最后使这些组分得到分离

6 液相色谱 - 分类 吸附色谱法 ( adsorption chromatography ): 分配色谱法 ( partition chromatography ): 根据不同组分在固定相中的溶解能力和在两相间分配系数的差异进行分离的方法 离子交换色谱法 (ion exchange chromatography ): 排阻色谱法 ( size exclusion chromatography ): 亲合色谱法 ( affinity chromatography )

7 分配色谱法 - 键合相色谱 键合相固定相 : 在硅胶的表明用键合反应把官能基团键合到表面上, 解决固定相流失的问题 液相色谱正相色谱 : 流动相极性比固定相极性小反相色谱 : 流动相极性比固定相极性大

8 毛细管电泳 在电解质溶液中, 位于电场中的带电离子在电场力的作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象, 称之为电泳 由于不同离子所带电荷及性质的不同, 迁移速率不同而实现分离

9 毛细管电泳 - 分类 毛细管区带电泳 (CZE) 最普遍 最基本的一种分离模式 毛细管凝胶电泳 (CGE) 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶 其具有多孔性, 类似分子筛的作用, 试样分子按大小分离 能够有效减小组分扩散, 所得峰型尖锐, 分离效率高 可分离测定蛋白质 DNA 等 毛细管胶束电动色谱 (MECC) 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂, 形成一疏水内核 外部带负电的胶束 在电场力的作用下, 胶束在柱中移动 由于电泳流和电渗流的方向相反, 且 ν 电渗流 > ν 电泳, 则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动, 中性试样分子在胶束相和溶液 ( 水相 ) 两相间分配, 疏水性强的组分与胶束结合得较牢, 流出时间长 可用来分离中性物质, 扩展了高效毛细管电泳的应用范围

10 三种色谱法比较 气相色谱分离效率高, 选择性好, 检测灵敏度高 只适用于热稳定性好 易挥发的物质 液相色谱可以分析热稳定性差 难挥发的物质缺乏高灵敏度的通用型检测器 对于大分子物质因其分子扩散系数小 传质阻力大, 使得柱效率大大降低, 以至于难以分离相对分子量大于 2000 的物质 毛细管电泳柱效比高效液相色谱更高, 操作简单 成本低 分离速度快, 尤其适合大分子分离分析 迁移时间重现性 进样准确性 检测灵敏度方面逊于高效液相色谱

11 色谱基本参数及公式 色谱图 : 若干物质的流出曲线, 即在不同时间上的浓度或者响应的大小 保留时间 retention time(tr): 样品注入到色谱峰顶出现的时间 保留体积 retention volume(vr): 从注射样品到色谱峰值出现时, 通过色谱系统的流动相的体积 一般可以用保留时间乘流动相线速度得到 死时间 dead time(tm): 不被保留的样品通过色谱柱的时间 调整保留时间 adjusted retention time(tr ): 保留时间减去死时间等于调整保留时间

12 色谱定性方法 比较保留值定性 利用不同检测方法定性利用保留值经验规律定性 与其他定性的分析仪器联用

13 比较保留值定性 保留值定性法 : 比较保留时间或保留指数 在相同的色谱条件下, 相同组分的保留值是一样的.

14 与其他定性的分析仪器联用 色谱 - 质谱联用 (GC-MS;LC-MS) 色谱 - 傅立叶红外光谱联用 (GC-FTIR)

15 色谱定量方法 归一化法 外标法 内标法

16 归一化法 所谓归一化法就是以样品中被测组分经校正过的峰面积 ( 或峰高 ) 占样品中各组分经校正过的峰面积 ( 或峰高 ) 的总和的比例来表示样品中各组分含量的定量方法 归一化法计算公式 w (i) mi 100% m ' fi Ai f A ' i i m 1 m 100% 2 mi m n 100%

17 归一化法小结 优点 : 简便, 进样量的多少与测定结果无关, 操作条件 ( 如流速, 柱温 ) 的变化对定量结果的影响较小. 缺点 : 校正因子的测定较为麻烦 ; 要求所有组分都能产生可测量的色谱峰

18 外标法 当要求测定复杂混合物中某一组分的精确含量时, 一般使用外标法或内标法 外标法 : 外标法也称为标准曲线法

19 内标法 内标法 : x i ms Ai m A s f s,i 100% 将一定量的纯物质作为内标物加入样品中, 然后进行色谱分析, 测定内标物和某几个组分的峰面积和相对应答值, 就可以求出这几个组分在样品中的含量 m 样品的质量 ; ms 待测样品中加入内标物的量 ; As 待测样品中内标物的峰面积 ; f s,i 组分 i 与内标物的校正因子之比, 称为相对校正因子 ;

20 气相色谱仪 温控系统 载气系统进样系统柱系统检测系统工作站

21 气相色谱工作流程

22 载气系统 包括气源 净化干燥管和气流控制装置 ; 常用的载气有 : 氢气 氮气 氦气 ; 净化干燥管 : 去除载气中的水 有机物等杂质 ( 依次通过分子筛 活性炭等 ); 气流控制装置 : 压力表 流量计 针形稳压阀, 控制载气流速恒定

23 进样系统 进样系统的作用是有效地将样品导人色谱柱进行分离. 包括自动进样器 气体进样阀 各种进样口 ( 如填充柱进样口 分流 / 不分流进样口 冷柱上进样口 程序升温进样口等 ), 以及顶空进样器 吹扫 捕集进样器 裂解进样器等辅助进样装置 微量进样器 进样口 : 将液体试样瞬间气化的装置 :

24 柱系统 现代的色谱仪常用的是毛细管柱, 其材料为熔融石英, 即弹性石英柱 常规毛细管柱内径一般为 mm, 长度 30-50m, 有非极性 弱极性 中等极性和强极性柱这几种, 毛细管柱分离效率高, 分析速度快, 应用范围相当广泛 柱温箱可以快速升温降温, 并能实现多阶升温程序, 使样品获得更好的分离效果

25 氢火焰离子化检测器 氢火焰离子化检测器 (FID): 使从色谱柱流出的载气与氢气混合由喷嘴喷出, 遇到附近的空气后点燃形成火焰, 在与喷嘴水平同轴处有一极化极, 火焰上方是一圆筒形收集极, 两极间施以恒定的电压, 使离子在极化极和收集极之间作定向流动而形成电流 1. 典型的质量型检测器 ; 2. 通用型检测器, 仅对惰性气体 水 H 2 O NH 3 CO CO 2 CS 2 卤代硅烷等无响应. 3. 具有结构简单 稳定性好 灵敏度高 响应迅速等特点 ;

26 液相色谱仪 温控系统 输液泵进样系统柱系统检测系统工作站

27 高效液相色谱仪结构与流程

28 流动相 保持色谱柱的稳定性 化学惰性 适合所用的检测器 对样品有一定的溶解能力 清洗 更换方便 毒性小 沸点 粘度等物理性质合适

29 输液泵 输液泵要求流量平稳, 可以调节的流量范围宽, 耐高压 一般是柱塞往复泵

30 进样系统 进样系统包括手动进样和自动进样, 无论手动进样还是自动进样, 都要通过六通阀 六通阀进样是高压系统的需要, 既不影响系统的正常运行又能够让样品进到系统中去

31 色谱柱和柱温箱 柱系统包括色谱柱和柱温箱反相键合相色谱柱最常用的就是 ODS 柱, 也就是 C18 柱 柱温箱的温度控制要求比较精确, 因为流体的粘度受温度的影响较大

32 液相色谱检测器 测量原理不同分类 : 光学性质检测器 电学和电化学性质检测器 热学性质检测器

33 光学性质检测器 多波长检测器

34 毛细管电泳仪 温控系统 高压电源缓冲溶液样品池毛细管检测器 工作站

35 毛细管电泳仪仪结构与流程

36 缓冲溶液 缓冲溶液的种类 直接影响粒子的迁移和分离, 要求缓冲容量好 检测波长处吸收低 自身淌度低 尽量用酸性缓冲溶液 缓冲溶液的 ph 影响溶质的电荷 :ph 低于溶质的等电时, 溶质带正电荷 ; 反之, 带负电荷 引起电渗的变化 : 在高 ph 下, 电渗很大 缓冲溶液的浓度浓度增加, 离子强度增加, 改善分离浓度增加, 电渗率降低, 迁移时间延长浓度增加, 导电的离子数增加, 焦耳热增加 添加剂 加入添加剂可改善分离效果

37 电压 柱长一定时, 操作电压增加, 粒子迁移加快, 柱内焦耳热增加 在一定范围内柱效随电压的升高而升高, 过了极点后, 焦耳热影响加剧, 柱效反而下降

38 进样系统 进样量 : 毛细管长度的 1%-2%; 纳升级 非常小 流体力学进样方式 (1) 进样端加压 (2) 出口端抽真空 (3) 虹吸进样 电动进样方式毛细管一端插入样品瓶, 加电压 ; 进样不均 : 电歧视现象, 淌度大的离子比淌度大的进样量大 ; 离子丢失 : 淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去 ; 特别适合黏度大的试样 ; 扩散进样试样通过扩散作用进入分离柱端口处

39 色谱柱 毛细管区带电泳 (CZE) 常规毛细管柱 毛细管凝胶电泳 (CGE) 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶 其具有多孔性, 类似分子筛的作用, 试样分子按大小分离

40 检测器 检测器要求 : 具有极高灵敏度, 可柱端检测 ; 类型紫外吸收检测器 : 单波长 多波长 二极管阵列荧光检测器激光诱导荧光检测器电导检测器

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