Rh(D)变异体DVI(IV)型.ppt

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1 中国汉族人群发现一例携带抗 -D 的 Rh(D) 变异体 DVI(IV) 型 孙国栋

2 研究背景

3 Rh 血型系统是人类最复杂的红细胞血型系统, 也是输血医学最重要的血型系统之一 Rh 血型抗原特别是 RhD 抗原 (ISBT ;RH1) 具有很强的免疫原性, 是临床上引致新生儿溶血病 溶血性输血反应的最重要的血型抗原

4 人类 Rh 血型基因位于染色体 1p , 包括 RHD 基因 RHCE 基因和 SMP1 基因 RHD 和 RHCE 基因分别由 10 个外显子组成, 编码 区总长均为 1251bp, 各编码一种由 417 个氨基酸组 成的糖蛋白, 即 RhD 蛋白和 RhCE 蛋白

5 RHD 和 RHCE 基因在座位上方向相反, 两者间距离约为 3 万 bp, 中间的 SMP1 基因与 RHD 方向相同, 含有 7 个外显子 在 RHD 基因两端各有一段 Rhesus 盒子序列, 约为 9000bp, 两个 Rhesus 盒子序列具有高度同源性,RHD 基因阴性单倍体上下游 Rhesus 盒子之间 RHD 基因完全缺失, 形成一个融合的 Rhesus 盒子 (Hybrid Rhesus box)

6 D 抗原位于 RHD 基因编码的 RhD 多肽上, 该多肽带有 6 个细胞外环, 贯穿红细胞膜 12 次, 氨基端和羧基端均位于胞浆内,RhD 多肽分为 3 个区域 : 细胞外区 跨膜区 细胞内区 Rh 血型有着复杂而丰富的遗传多态性 (RHD 和 RHCE 基因座位等位基因 256 个 ),RhD 抗原存在许多变异体, 如 : 部分 D 弱 D Del D 型 D 型等 弱 D 型和部分 D 型为 RhD 抗原弱表现型,Del 为 RhD 抗原极弱表现型

7 弱 D(Weak D) 是由于 RHD 基因编码区发生碱基突变, 使得编码 RhD 蛋白的氨基酸发生替换, 氨基酸替换的部位主要位于胞内区和跨膜区, 表现为抗原位点数减少, 减低 RhD 蛋白插入膜的效率, 但抗原表位 (epitope) 数目基本不变, 影响了 Rh 蛋白在红细胞膜的表达效能 血清学实验表现为盐水介质反应阴性, 间接抗球蛋白试验 (indirect antiglobulin test, IAT) 检测为阳性

8 部分 D(partial D) 的分子形成机制有 3 类, 分别是 RHD/CE 融合等位基因 (hybrid allels) 细胞外环的错义突变 (missense mutations) 和散在的错义突变 (dispersed amino acid substitutions), 形成部分 D(partial D) 的氨基酸变异主要位于胞外区域. 导致一个或多个 D 表位的缺失 RHD/CE 融合等位基因形成的 D 变异体也称为 D 类别 (D category), 是中国人群中观察到的主要的部分 D. 血清学表现为缺失一个或多个 D 抗原表位 (epitope), 多数部分 D 表型个体表现 为 D 弱表现型, 可以被免疫产生针对所缺失抗原表位的抗体

9 Rh 血型研究进展 一 RhD 抗原弱表现型分子遗传机制研究 年, 在 名无偿献血者中, 盐水法初筛和 IAT 检测均阴性者 747 例 ( 表观 apparent Rh 阴性 ), 为 RhD 阴性, 约占供血人群的 0.35% 常规的盐水法初筛 D 抗原阴性, 经 IAT 确认为阳性, 为 D 抗原弱表现型 32 例标本, 约占无偿献血人群 0.015%

10 The gene polymorphism of all samples for RHD and Distribution frequency in population RHD genotype Nucleotide exchanges Haplotype Distribution frequency(%) weak D type12(1) 830G>A DcE weak D type15(18) 845G>A DCe/DcE RHD 1227A(1) 1227G>A(DEL) DCe/DcE D Ⅵ Ⅲ(8) RHD-CE(3-6)-D DCe D Ⅴa (Hus)(1) RHD-CE(5)-D DCe/DcE (DV type 2) nomal RHD gene(3). not detect DcE

11 二 汉族人群 IAT 检测 RhD 阴性个体 RHD 基因多态性分析 118 份标本 ( 表观 apparent Rh-negative) 中观察到 28 例带有 1227A DEL 等位基因个体, 携带完整的 RHD 基因, 但第 9 外显子的最后一位碱基存在 1227G>A 的变异, 为 Del 型, 是弱 D 的一种极端表现形式, 占 IAT 检测 Rh 阴性个体中的 23.7% 90 例真实 RhD 阴性标本 (truly Rh-negative) 中, 有 69 份标本 RHD 基因完全缺失 (76.7%),21 份标本带有不表达 RHD 基因,20 份标本带有不表达的 RHD-CE(2-9)-D2 等位基因, 占真实 RhD 阴性标本的 22.2%, 与国内邵超鹏报道的比例为 10.5% 有较大差异 1 份标本带有不表达的 RHD710delC 等位基因

12 RhCcEe 表型及 RHD 的 SSP-PCR 基因分型结果 RhCcEe 表型 n RHD 基因 完全缺失 RHD-CE(2-9)-D2 RHD710delC DEL( 1227A) ccee CcEe Ccee ccee CCee 3 3 总计 (58.5%) 20 (16.95%) 1 (0.85%) 28(23.7%)

13 三 汉族人群有孕产史的 Rh 阴性及 DEL 型孕妇妊娠 Rh 阳性胎儿同种免 疫状况临床观察 ( Rh 血型胎母同种免疫反应观察小组 (GRAI) 成员 )

14 材料和方法

15 1 研究对象 女, 汉族, 产妇, 曾有两次孕产史, 第一胎足月顺产, 新生儿健康, 产妇产后输血 ( 据该县级医院开始开展 Rh 血型定型工作时间推测当时输注为 RhD 阳性血液 )200ml 第二胎足月顺产, 产后第二天新生儿出现黄疸, 母子样本送我站检测

16 2 试剂 血型血清学试验试剂 : 单克隆 IgG 抗 -D(clone:415 1E4) 和单克隆 IgM 抗 -D(clone:175-2) 混合试剂, 加拿大 DBL 公司 ; 人源抗 -D 血清, 谱细胞上海血液中心 ; IgM(clone:P 3 61) IgM(clone: P B10) IgG(clone:P 3 290) IgG(clone:P 3 35) 混合组成的单克隆抗 -D(RH1), 法国 DIAGAST 公司 ; 单克隆 IgM 抗 -C(MS24) 抗 -c (MS33) 抗 -E(MS80) 抗 -e(ms16), 英国 IMMUCOR; 抗球蛋白试剂, 加拿大 DBL 公司 ;

17 分子生物学试验试剂 : DNA 抽提试剂盒, 美国 G&T 公司 ; Ampli Taq Gold DN 聚合酶, 美国应用生物系统公司 ; Taq DNA 聚合酶, Promega 公司 dntps Promega 公司 ; DNA Marker DL2,000, 大连宝生物工程有限公司 ; 琼脂糖凝胶 Promega 公司

18 溴化乙啶 Promega 公司 RHC RHc RHE Rhe 基因检测试剂盒, 美国 G&T 公司 ; RHD SSP-PCR 基因分型引物, 大连宝生物工程有限公司 ; RHD 基因数目检测引物, 大连宝生物工程有限公司 ; 特异性全长序列分析 PCR 引物 (10 对内含子引物 ) 和测序引物, 大连宝生物工程有限公司 ;

19 3 主要实验仪器及设备 : PE9700 型 PCR 仪 美国 PE 公司 双稳定时电泳仪 北京六一仪器厂 水平电泳槽 北京六一仪器厂 紫外分析仪 北京六一仪器厂 高速离心机 德国希格玛公司 旋涡混合器 北京金北德公司 三用恒温水浴箱 上海医疗器械厂 细胞洗涤离心机日本久保田

20 4 方法与结果

21 血型血清学试验 盐水法初筛为 D 阴性 IAT 检测为 D 阴性 RhD 阴性 RhD 血型鉴定 盐水法初筛为 D 阴性 IAT 检测为 D 阳性 RhD 抗原弱阳型 血清抗体鉴定 RhC c E e 表型检测

22 血型血清学试验结果 一批人源抗血清和两批单克隆 IgG+IgM 混合抗 -D 进行 Rh 血型检测 盐水介质 一批 ( 单克隆 IgG+IgM) 混合抗 -D 试剂 + 受检者细胞呈现 1+ 弱凝集 一批人源血清和另一批 ( 单克隆 IgG+IgM) 混合抗 -D 试剂 + 受检者细胞呈现阴性结果 抗球蛋白介质 人源抗血清 + 受检者细胞呈现阴性结果 两批 ( 单克隆 IgG+IgM) 混合抗 -D 试剂呈现 2+ 阳性结果 血型血清学证实产妇 :A 型 RhD 弱阳性,Rh 小因子 :Ccee, 携有同种抗 -D, 抗 -D 效价为 256, 反应格局见表 1 丈夫和第一个孩子及新生儿 ( 第二胎 ) 血型均为 :A 型 DCcEe

23 血型血清学试验结果 一批人源抗血清和两批单克隆 IgG+IgM 混合抗 -D 进行 Rh 血型检测 盐水介质 一批 ( 单克隆 IgG+IgM) 混合抗 -D 试剂 + 受检者细胞呈现 1+ 弱凝集 一批人源血清和另一批 ( 单克隆 IgG+IgM) 混合抗 -D 试剂 + 受检者细胞呈现阴性结果 抗球蛋白介质 人源抗血清 + 受检者细胞呈现阴性结果 两批 ( 单克隆 IgG+IgM) 混合抗 -D 试剂呈现 2+ 阳性结果 血型血清学证实产妇 :A 型 RhD 弱阳性,Rh 小因子 :Ccee, 携有同种抗 -D, 抗 -D 效价为 256, 反应格局见表 1 丈夫和第一个孩子及新生儿 ( 第二胎 ) 血型均为 :A 型 DCcEe

24 分子生物学试验 1 DNA 制备应用美国 G&T 公司 DNA 抽提试剂盒 采用盐析法, 抽提后将 DNA 溶于 TE 溶液中, 保存待用 2 RHCE 的 PCR-SSP 基因分型采用美国 G&T 公司的试剂盒测定标本的 RHCE 基因 分别特异性的检测 RHCE 基因的第 2 内含子 ( 检测 RHC) 第 2 外显子 ( 检测 RHc) 第 5 外显子 ( 检测 RHE) 第 5 外显子 ( 检测 Rhe 基因 ) 及 RHD 基因的第 10 外显子 以人类生长激素基因特异性引物为内对照, 扩增产物大小为 429bp PCR 产物在 2% 的琼脂糖凝胶 ( 含 0.5μg/ml 溴乙啶 ) 上点样, 同时采用宝生物工程公司的 DNA Marker DL2,000 作为标记,10V/ 厘米电泳 20 分钟 然后在紫外光下观察结果, 拍照记录

25 SSP-PCR 基因分型结果 PCR-SSP 方法检测产妇 RHCE 基因, 结果与血型血清学检测一致, 见如下电泳图

26 3 RHD 基因数目检测 观察该个体是否存在 RHD 基因缺失, 从而分析 RHD 基因数目 一对引物特异性针对融合 Rhesus 盒子, 扩增产物为 2778bp; 另一对引物特异性扩增 RHD 基因第一外显子, 扩增产物为 767bp 扩增人类血小板抗原 (HPA-1) 作为内对照, 产物为 367bp 为提高这两对特异性引物在本实验室的扩增效率, 经反复试验将文献扩增条件修改为 : 95 予变性 10 分钟, 然后依次按以下程序进行 40 个循环 :94 30 秒,65 60 秒,68 5 分钟 40 个循环后,72 延长 5 分钟, 然后降温至 4 保存 PCR 产物在 1.6% 的琼脂糖凝胶 ( 含 0.5μg/ml 溴乙啶 ) 上点样, 电泳 PCR 产物观察

27 RHD 基因数目分析结果 RHD 杂合性试验鉴定证实本例标本为 RHD+/RHD- ( 见下图 ), 根据个例的 RhCcee 表型, 推测其 RH 基因型可能为 DⅥCe/dce RHD( )/RHD( ) RHD(+)/RHD( ) RHD(+)/RHD(+) D M Exon Hyb M Exon Hyb M Exon Hyb RHD 阴性对照该例标本 RHD 阳性对照 The results of heterozygosity identification for RHD

28 4 RHD 基因外显子直接测序 用 10 对内含子引物分别特异性扩增 RHD 基因 10 个外显子, PCR 产物经 Takara DNA Fragment Purification Kit( 大连宝生物公司 ) 纯化, 配成 25-30μl 的 DNA 测序模板, 分别以各外显子的特异性测序引物直接测序 (ABI PRISMTM377XL DNA Sequencer), 结果用相应软件分析比较

29 RHD 基因外显子测序结果 测序 PCR 用 10 对内含子引物分别扩增本例标本 RHD 基因 10 个外显子, 结果见下图 RHD 基因全长编码区序列分析结果显示该标本的 RHD 基因第 3-5 外显子检测为阴性 ; 对第 1 2 外显子和第 外显子进行序列分析, 结果显示, 与 GenBank 记录的 RHD 基因序列相比对无异常. 证实此例标本为携带 RHD-CE(3-5)-D 融合等位基因的部分 D 表型中的 DVI(IV) 型

30 .... C M Ds1 Ds2 Ds3 Ds4 Ds5 Ds6 Ds7 Ds8 Ds9 Ds Amplification results using D-specific intron primers for sequencing the coding region of the RHD gene.

31 讨 论

32 目前, 国际上经 RHD 全基因序列分析鉴定和 GenBank 登录的部分 D 已发现有 6 个 D 类别 (DⅡ--DⅦ),DⅥ 是白种人最重要的部分 D 表现形式 DⅥ 类别包括 DVI(I)- DVI(Ⅳ) 型 : DVI(I): RHD 的第 4-5 外显子被 RHCE 基因替换 ; DVI(Ⅱ): RHD 的第 4-6 外显子被 RHCE 基因替换 ; DVI(Ⅲ): RHD 的第 3-6 外显子被 RHCE 基因替换 ; DVI(Ⅳ): RHD 的第 3-5 外显子被 RHCE 基因替换 ; DⅥ 个体易发生同种免疫反应产生抗体

33

34 目前国内关于部分 DⅥ 的研究报道中, 仅发现有 DVI (Ⅲ) 型的报道, 笔者也曾在 9 例部分 D 标本中发现 8 例 DVI (Ⅲ) 型, 也即中国人群最主要的 部分 D 为 DVI(Ⅲ) DVI(Ⅳ) 型首次被检出于西班牙人群,Rosa 等对西班牙人群中的 17 例 DⅥ 型标本进行研究, DVI(Ⅳ) 型为西班牙人群主要的 DⅥ 型别 TABLE Distribution of DVI types in the Spanish population DVI type 1 DVI type 2 DVI type 3 DVI type % 12% 0% 65% DVI(Ⅳ) 型变异基因存在于 DCe 单倍体上 ( 欧洲西南国家如葡萄牙也发现 )

35 本例研究产妇曾有一次妊娠史和输血史, 第一个孩子现两岁 (RhD 阳 性 ), 生后健康, 因产妇产后贫血输血 200ml, 据其所住医院开展 Rh 血 型定型工作时间推测当时输注为 RhD 阳性血液 两次免疫史使其产生针对其所缺失表位的抗体, 本次生产第二胎因这一抗体患新生儿溶血病 产妇为 RhCcee 表型, 推测其基因型可能为 DⅥCe/dce,DVI(IV) 型变异基因存在于 DCe 单倍体上, 与 Rosa 等文献报道同

36 Li 等 (Vox Sanguinis) 对上海部分 表观 RhD 阴性 (apparent RhD negative), 也即 IAT 确认阴性的标本进行筛查, 发现一例经吸收放散有 1+ 凝集的 DEL 型标本, 测序为 RHD-CE(2 5)-D, 表型为 Ccee 由于 RHD 第二外显子与 RHCE 的 C 基因碱基序列相同, 按照发夹结构理论, RHD- CE(2 5)-D 亦或是 RHD-CE(3 5)-D 仅通过外显子检测不能明确确认 Li 等描述的的血型血清学试验结果为 DEL Rosa 等及本次试验报道均为部分 D

37 正常 D 抗原阳性个体的红细胞表面约有 个抗原分子,D 弱表现型个体抗原 分子数显著减少, 通常为几百至近万个 D 抗原分子不等, 如弱 D4.1 约为 4000 个, 弱 D12 则 低于 100 个分子 部分 D 表型之间抗原密度差异较为明显 Rosa 等试验描述 :DVI(Ⅳ) 抗原密度为为 8000, 低于 DVI(Ⅲ) 型 (11000), 远高于 DVI(I) 型 (500) 和 DVI(II) 型 (2500) 4 类 DVI 型中,DVI(Ⅲ) 型与 DVI(IV) 型密度相对较大, 这可能与两型都有第三外显子 RHCE 基因的替换有关

38 目前国内普遍使用的是高效价抗 -D 初筛试剂, 使得一些高表达 部分 D 初筛时被定为 D 阳性, 没有机会再进一步确认, 故而为临床 输血埋下隐患 针对不同的受检标本制定不同的检测及输血策略非常重要, 对于献血者来说弱表达 D 可以作为阳性供者, 但对于受血者来说, 应该用不能检出 DVI 型的抗 -D 试剂, 使受血者的弱表达 D 型别被检定为阴性, 输血时输用 Rh 阴性血, 以避免免疫反应的发生, 保证临床输血安全

39 THANKS

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