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1 新生儿溶血病的产前实验室诊断 四川大学华西第二医院检验科 凤婧

2 HDN 的发病机理 胎儿 / 新生儿 胎儿 RBC 父源性 Ag 怀孕 / 分娩 IgG 透过胎盘屏障攻击胎儿 / 新生儿 RBC 母亲

3 产前检查的意义 1. 预测母婴血型不合胎儿 / 新生儿发生 HDN 的可能性 2. 为临床及早治疗或干预提供依据, 预防 HDN 的发生, 或减轻其危害 优生优育 提高人口素质

4 产前检查的内容 根据发病机理, 可以从两方面进行实验室检查 ( 一 ) 母体血清中的 IgG 抗体测定抗体效价测定抗体的 IgG 亚类 ( 二 ) 进入母体的胎儿红细胞测定数量测定血型基因

5 实验室检查 ( 一 ) 母体血清中 IgG 抗体检测 ( 二 ) 母体血清中抗体的 IgG 亚类测定 ( 三 ) 胎儿红细胞数量检测 ( 四 ) 胎儿血型基因检测

6 ( 一 ) 母体血清中 IgG 抗体效价检测 1. 常用方法 : 抗球蛋白试验 (1) 经典试管法操作繁琐, 人为因素干扰, 难于标准化 (2) 微柱凝胶法简化了流程

7 2. 检测的意义 : (1) 与胎儿受害程度呈正相关, 预测 HDN 的发生有重要价值 (2) 与 HDN 疾病的严重程度之间的相关程度仍有欠缺 (3) 临床上孕妇的抗体效价低而新生儿溶血程度较高者, 可能与 IgG 亚类有关

8 实验室检查 ( 一 ) 母体血清中 IgG 抗体检测 ( 二 ) 母体血清中抗体的 IgG 亚类测定 ( 三 ) 胎儿红细胞数量检测 ( 四 ) 胎儿血型基因检测

9 ( 二 ) 母体血清中抗体的 IgG 亚类测定 - IgG1 和 IgG3 较易透过胎盘屏障 1. 常用方法 : (1) 酶联免疫吸附实验检测影响因素较多 : 酶标抗体稳定性, 温度, 酸碱度定量检测目前仍处于试验阶段 (2) 流式细胞检测术准确测定致敏红细胞的数量以及红细胞表面结合的 IgG 亚类的数量, 对新生儿溶血程度进行估测 操作复杂 成本高, 应用受限

10 实验室检查 ( 一 ) 母体血清中 IgG 抗体检测 ( 二 ) 母体血清中抗体的 IgG 亚类测定 ( 三 ) 胎儿红细胞数量检测 ( 四 ) 胎儿血型基因检测

11 ( 三 ) 胎儿红细胞数量检测 1. 常用方法 : 酸洗脱试验 (1) 检测孕妇血循环中胎儿红细胞的数量或比例提示胎母出血的程度, 预测 HDN 的发生 (2) 操作繁琐, 难以标准化, 假阳性和中等染色程度细胞 ( 介于成人 RBC 和胎儿 RBC) 偏多, 影响判断

12 实验室检查 ( 一 ) 母体血清中 IgG 抗体检测 ( 二 ) 母体血清中抗体的 IgG 亚类测定 ( 三 ) 胎儿红细胞数量检测 ( 四 ) 胎儿血型基因检测

13 ( 四 ) 胎儿血型基因检测 可从怀孕 16 周的孕妇羊水细胞中检出胎儿血型基因, 预测胎儿血型, 预测 HDN 发生的可能性 目前, 国外文献报道的此项研究多为 Rh 血型系统检测, 而对于 ABO 系统研究罕见报道

14 目前临床广泛应用的 成熟的检测技术 : IgG 抗体效价测定 IgG 抗体? 1. IgG 抗 A 和 IgG 抗 B 抗体 2.ABO 以外的 IgG 抗体 ( 如 :Rh-D )

15 IgG 抗体效价测定 ( 一 ) 检测的对象 1. 有不良孕产史 输血史及新生儿溶血病史的孕前妇女及孕妇 ; 2.Rh 阴性孕前妇女及孕妇 ; 3. 血型为 0 型 配偶血型为非 O 型的孕前妇女及孕妇

16 ( 二 ) 检测的频率 1. 第一次为计划怀孕前 ; 2. 第二次为妊娠第 周, 如果检测到 ABO 以外抗体, 或高效价 IgG 抗 A(B) 抗体, 每月复查一次 ; 3. 第三次为妊娠 周, 以后每隔 2-4 周重复检测, 以了解抗体增加速度 抗体效价上升快, 提示 HDN 发生几率大

17 ( 三 ) 检测的内容 ⒈ 夫妇 ABO Rh(D) 血型鉴定 ; ⒉ 孕妇 / 孕前妇女 IgG 抗 A(B) 抗体效价检测 ; ⒊ 孕妇 / 孕前妇女 ABO 以外抗体检测

18 ( 四 ) 标本要求 ⒈ 第一次检测 : 采集夫妇双方 EDTA 抗凝血各 3~5 毫升 ⒉ 复查检测 : 采集孕妇 EDTA 抗凝血 3~5 毫升

19 ( 五 ) 标本前处理 : 血清学离心机 2379g 离心力离心 5 分钟

20 ( 六 ) 检测的方法 : ⒈ ABO+Rh(D) 血型检测 ; ⒉ IgG 抗 A(B) 抗体效价检测 ; ⒊ ABO 以外抗体检测

21 1.ABO+Rh(D) 血型检测 (1) 孕妇及丈夫 ABO+Rh 血型检测 玻片法试管法微柱凝胶卡法

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25 (2)Rh 阴性病人需做阴性验证试验 试管法微柱凝胶卡法

26 Rh 阴性验证试验 : 试管法 反应物受检管阳性对照阴性对照 5% 受检者红细胞悬液 1 滴 - - 5%Rh 阳性的供者红细胞悬液 - 1 滴 - 5%Rh 阴性的供者红细胞悬液 滴 抗 Rh(D) 血清 IgG/ IgG+ IgM 2 滴 2 滴 2 滴 37 水浴箱孵育 1h 用 NS 洗涤 3 次广谱抗人球蛋白试剂 2 滴细胞洗涤离心机 1000g 离心力离心 15s 观察结果

27 Rh 阴性验证试验 : 微柱凝胶卡法 反应物 受检孔 阳性对照 阴性对照 0.8% 受检者红细胞悬液 50ul %Rh 阳性的供者红细胞悬液 - 50ul - 0.8%Rh 阴性的供者红细胞悬液 ul 抗 Rh(D) 血清 IgG/ IgG+ IgM 25ul 25ul 25ul 37 配套孵育箱孵育 15 分钟 配套卡式离心机离心 10 分钟 判读结果

28 血型卡及抗人球蛋白卡弱 D 结果

29 临床意义 Rh(D) 血型 Rh(D) 阳性 弱 D Rh(D) 阴性 作为供者 Rh(D) 阳性 Rh(D) 阳性 Rh(D) 阴性 作为受者 Rh(D) 阳性 Rh(D) 阴性 Rh(D) 阴性 产生抗 -D 不会 可能 可能

30 ( 六 ) 检测的方法 : ⒈ ABO+Rh(D) 血型检测 ; ⒉ IgG 抗 A(B) 抗体效价检测 ; ⒊ ABO 以外抗体检测

31 2.IgG 抗 A(B) 抗体效价检测 (1) 消除 lgm 类抗体干扰 : 2-Me/DTT 灭活 lgm 类抗体 血型物质中和 lgm 类抗体

32 中和试验 反应物受检管对照管 受检者血浆 200ul 200ul PBS PH ul 0.01M DTT 或 0.1M 2-Me 或血型物质 A/B 37 孵育 30min 200ul -

33 中和效果验证 : 对照管和测试管各吸取 1 滴中和液 1 滴对应血型的 3-5% 试剂红悬 1000g 离心 15s 观察结果 对照管凝集, 测试管不凝集, 继续试验 对照管, 测试管均凝集, 中和不完全

34 (2) 检测 IgG 抗体 : 试管法 NS 倍比稀释中和后的血浆到 1:1024 各稀释度取 100ul 到已标记测试管 相应血型的 3-5% 红悬 50ul 37 水浴箱孵育 1h 用 NS 洗涤 3 次 广谱抗人球蛋白试剂 2 滴 细胞洗涤离心机 1000g 离心力离心 15s 观察结果

35 试管法凝集强度判断

36 (2) 检测 IgG 抗体 : 微柱凝胶卡法 NS 倍比稀释中和后的血浆到 1:1024 相应血型 0.8% 红悬 50ul 各稀释度中和后的血浆 25ul 37 配套孵育箱孵育 15 分钟 配套卡式离心机离心 10 分钟 判读结果

37 微柱凝胶卡法凝集强度判断

38 结果判定 : 试管法 :1+ 凝集强度 微柱凝胶卡法 : 按试剂说明书 ( 通常 2+ 凝集强度 )

39 室内质控 目前国内没有相应质控品 可采用最近的标本 (3 天内 ) 平行测定, 最好涵盖高低值 判定标准 : 结果相差 1 个滴度范围内且不影响阴阳性判定

40 室间质评 国内无相应质评项目 ; 美国 CAP 的 PT:ABT

41 临床意义 -ABO 新生儿溶血病 国内同行共识 1:64 或 1:128 有意义 AABB 认为 1:128 滴度有临床意义 根据 P.L.Mollison 所著教材 临床医学中的输血 (Blood Transfusion in Clinical Medicine), 将 1:512 或更高滴 度作为有临床意义抗体 一般认为卡法应比试管法高一个滴度

42 自制血型物质 : 标本要求 标本采集 : 血型为 A 或 B 型的被检者, 漱口后, 留取自然 流出唾液至少 10ml 于清洁容器内 标本保存 :-20 冰箱冰冻 3 天, 去除唾液中粘液

43 血型物质的制备 唾液标本自然融化 1000g 离心 10min 吸取上清液沸水浴 10min 1000g 离心 10min 留取上清液, 待验证

44 血型物质的验证 抗血清的标化 测定抗 A 抗 B 血清的效价 选择与红细胞凝集在 的稀释度 ; 按此稀释倍数稀释抗血清待用

45 血型物质的验证 反应物检测管阳性对照阴性对照 制备好的血型物质 1 滴 - - 与受检者 ABO 血型相同的最适稀释度抗血清 1 滴 - 1 滴 生理盐水 1 滴 1 滴 1 滴 混匀, 置室温中和 30 分钟 与受检者 ABO 血型相同的 3% 红细胞 1 滴 1 滴 1 滴 混匀, 1000g 离心力离心 15s, 观察结果 非分泌型 分泌型

46 分装保存 : 将血型物质按 2ml/ 支分装好后, -20 C 冰箱冰冻保存, 有效期为一年

47 ( 六 ) 检测的方法 : ⒈ ABO+Rh(D) 血型检测 ; ⒉ IgG 抗 A(B) 抗体效价检测 ; ⒊ ABO 以外抗体检测

48 3.ABO 以外抗体检测 (1) 抗体筛查 (2) 抗体鉴定 (3) 效价检测

49 (1) 抗体筛查 0.8%Ⅰ Ⅱ Ⅲ 抗筛细胞 50ul 病人血浆 25ul 37 配套孵育箱孵育 15 分钟 配套卡式离心机离心 10 分钟 判读结果

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52 (2) Sichuan 抗体鉴定 University : 试管法 各谱细胞管及自身对照管各加入患者血浆 2 滴 3-5% 谱细胞 / 自身细胞 1 滴 1000g 离心 15 秒 观察结果 37 水浴箱孵育 1h 1000g 离心 15 秒 观察结果 用 NS 洗涤 3 次 广谱抗人球蛋白试剂 2 滴 1000g 离心 15 秒 观察结果

53 (2) 抗体鉴定 : 微柱凝胶卡法 0.8% 谱细胞 / 自身细胞 50ul 病人血浆 25ul 37 配套孵育箱孵育 15 分钟 配套卡式离心机离心 10 分钟 判读结果

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58 结果解释 : 37 反应抗体为温抗体, 有临床意义 ; 4 及室温反应抗体为冷抗体, 临床意义不大 ; 谱细胞阳性, 自身对照阴性, 存在不规则抗体 ; 谱细胞, 自身对照均阳性, 存在自身抗体 / 不规则抗体 ;

59 室内质控 目前国内没有相应质控品 可结合 RBC 分型有无相应抗原来应证

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64 室间质评 国内无相应质评项目 ; 美国 CAP 的 PT:J,ETME

65 (3) 效价检测 : 试管法 NS 倍比稀释病人血浆到 1:1024 各稀释度取 100ul 到已标记测试管 含相应抗原的 3-5% 红悬 50ul 37 水浴箱孵育 1h 用 NS 洗涤 3 次 广谱抗人球蛋白试剂 2 滴 细胞洗涤离心机 1000g 离心力离心 15s 观察结果

66 (3) 效价检测 : 微柱凝胶卡法 NS 倍比稀释病人血浆到 1:1024 含相应抗原的 0.8% 红悬 50ul 各稀释度的血浆 25ul 37 配套孵育箱孵育 15 分钟 配套卡式离心机离心 10 分钟 判读结果

67 结果判定 : 试管法 :1+ 凝集强度微柱凝胶卡法 : 按试剂说明书 ( 通常 2+ 凝集强度 )

68 室内质控 目前国内没有相应质控品 可采用最近的标本 (3 天内 ) 平行测定, 最好涵盖高低值 判定标准 : 结果相差 1 个滴度范围内且不影响阴阳性判定

69 室间质评 国内无相应质评项目 ; 美国 CAP 的 PT: ABT,J,ETME

70 临床意义 -ABO 外新生儿溶血病 国内同行共识关键抗 -D 效价 1:16 或 1:32 其它不规则抗体的关键效价有待研究 一般认为卡法应比试管法高一个滴度

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