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1 312 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr 2016,37(4) 实时荧光定量 PCR 技术在男性不育患者 Y 染色体微缺失检查中的应用段晋燕, 侯迪, 薛丹丹, 冯晓倩, 刘培培, 李兴翠, 李绵洋, 王成彬解放军总医院临床检验科, 北京摘要 : 目的探索实时荧光定量 PCR 技术在检测男性不育患者 Y 染色体微缺失中应用的可行性方法利用实时荧光定量 PCR 技术对 2015 年 3-10 月于我院就诊的 443 例男性不育患者的 Y 染色体长臂 AZFa AZFb AZFc 和 AZFd 4 个区域的 8 个位点进行检测, 并用多重 PCR 方法对检测出的存在 Y 染色体微缺失的标本进行验证结果共检测出 3 例男性不育患者发生 Y 染色体微缺, 并通过多重 PCR 方法得到验证 3 例 Y 染色体微缺病例均发生于非梗阻性无精症患者, 其中 2 例为 AZFc+d 区缺失,1 例为 AZFb+c+d 区缺失, 占非梗阻性无精症的 10.3% 结论实时荧光定量 PCR 技术可用于 Y 染色体微缺失的检测, 且对筛查不育症患者具临床价值关键词 :Y 染色体微缺失 ; 实时荧光定量 PCR 技术 ; 男性不孕不育中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) DOI : /j.issn 网络出版时间 : :02 网络出版地址 : Application of real-time PCR in Y chromosome microdeletions in male infertility DUAN Jinyan, HOU Di, XUE Dandan, FENG Xiaoqian, LIU Peipei, LI Xingcui, LI Mianyang, WANG Chengbin Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing , China Corresponding author: LI Mianyang. limianyang301@163.com; WANG Chengbin. wangcb301@126.com Abstract: Objective To evaluate the feasibility of application of real-time PCR (RT-PCR) method in Y chromosome microdeletions in male infertility. Methods A total of 443 male infertility patients in our hospital from March to October in 2015 were recruited in this study. Eight sequence tagged sites (STS) in 4 regions (AZFa, AZFb, AZFc and AZFd) of Y chromosome were detected by RT-PCR. Moreover, samples with Y chromosome microdeletions were confirmed by multiplex PCR-electrophoresis. Results Three cases of Y chromosome microdeletions were identified and confirmed by RT-PCR. They had defections as following: 2 AZFc+d and 1 AZFb+c+d, totally accounting for 10.3% of non-obstructive azoospermia cases. Conclusion Real-time PCR method allows a rapid and simple screening for Y chromosome microdeletions in male infertility, which is of clinical value for screening patients with infertility. Keywords: Y chromosome microdeletions; real-time PCR; male infertility 不孕不育是全球重要的生殖健康问题, 全球大约 15% 的夫妇遭遇生育困难或者无法生育的困境, 其中 30% ~ 50% 是由于男性原因引起 [1] 40% ~ 50% 的男性不育患者存在精子数量少存活率低以及形态异常等问题 [2] Y 染色体上的基因组成是决定男性性别以及生成正常精子的重要因素, 染色体结构上或基因数量上的异常均会引起无精症或少精症 [3] Y 染色体长臂上的无精子因子区 (azoospermia factor,azf) 的微缺失是目前最常见的与 Y 染色体异常相关的不孕不育原因之一 [4] AZF 区可分为 3 个区域, 分别称为 AZFa AZFb AZFc 区, 该区域不同程度的缺失会导致精子生成能力的收稿日期 : 基金项目 : 国家重大科学仪器专项 (2012YQ030261) Supported by the National Major Scientific Equipment Special(2012YQ ) 作者简介 : 段晋燕, 女, 博士, 主管技师研究方向 : 临床检验 cathyduanjinyan@126.com 通信作者 : 李绵洋, 男, 博士, 副教授, 副主任 limianyang 301@163.com ; 王成彬, 男, 博士, 教授, 主任降低 [5] 近年来, 也有专家认为在 AZFb 和 AZFc 之间还存在一个新的区域, 称为 AZFd 区, 可能与精子的生成有关 [6] 在无精症或严重少精症的男性中,AZF 区微缺失所占的比例高于 1% [7] 本研究采用实时荧光定量 PCR 技术 (real-time quantitative polymerase chain reaction,rt-pcr) 对 443 例男性不育患者进行 Y 染色体微缺失检测, 并进一步分析缺失类型在男性不育症中的发生率对象和方法 1 对象 2015 年 3-10 月于本院男科就诊的男性不育患者 443 例, 平均年龄 (30.6±5.2) 岁按第 5 版 WHO 精液常规分析标准, 其中非梗阻性无精症患者 29 例 ( 精液中未发现精子 ), 严重少精症患者 6 例 ( 精子密度 < /ml), 少精症患者 21 例 ( 精子密度 < /ml) 2 仪器与试剂 CFX96 TM Real-Time PCR 仪 (Bio- Rad 公司, 美国 ),TProfessional Thermocycler PCR 仪 (Biometra 公司, 德国 ),DYY-7C 型电泳仪 ( 六一

2 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr 2016,37(4) 仪器厂, 中国 ),ChemiDoc TM XRS + 凝胶成像仪 (Bio-Rad 公司, 德国 ) 北京爱普益生物科技有限公司的人 Y 染色体 AZF 微缺失核酸检测试剂盒多重 PCR 方法所使用的引物由英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有限公司合成, 引物信息见表 1 表 2 RT-PCR 扩增循环步骤 Tab. 2 RT-PCR amplification process Step Temperature ( ) Time Cycle number min s s 72 1 min s 56 1 min 3 人外周血基因组 DNA 的提取使用 EDTA K 2 真空采血管采集患者 1 ~ 1.5 ml 静脉血, 取 200μl 置入 1.5 ml 灭菌离心管中, 提取 DNA 过程按照试剂盒说明书操作 4 RT-PCR 法检测 Y 染色体微缺失待测样本 DNA 正常女性 DNA 和正常男性 DNA 均分别与 4 种 PCR 反应液混合每种 PCR 反应液 (22.75μl) 与 Taq 酶 (0.25μl) 混合, 加入 2μl DNA 溶液使用正常女性 DNA 和正常男性 DNA 作为对照加样混匀, 离心, 放入 PCR 仪中, 按表 2 程序循环扩增, 收集 FAM VIC Cy5 信号 ( 表 3) sy127 sy34 sy152 sy254 sy255 位点缺失的判断值为 Ct 值 > 24 ;sy84 sy86 和 sy145 位点缺失的判断值为 Ct 值 > 28 5 多重 PCR 电泳法检测 Y 染色体微缺失待测样本 DNA 正常女性 DNA 和正常男性 DNA 分别与 A B C 3 种 PCR 反应液 ( 表 4) 进行混合, 比例 2 23, 总体积 25µl 加样混匀, 离心, 放入 PCR 仪中, 按表 5 程序循环扩增使用 2% 的琼脂糖凝胶将 5 ml 扩增产物与 1 ml 6 上样缓冲液混合上样, bp 的 DNA ladder 作为标记物电压 150 V, 时间 40 min 使用凝胶成像仪, 分析电泳结果表 3 各管中通道与检测位点 Tab. 3 Information of the sequence tagged sites and fluorescence in each tube FAM VIC Cy5 Tube 1 sy86 sy84 β-actin Tube 2 sy127 sy152 SRY Tube 3 sy254 sy134 SRY Tube 4 sy145 sy255 SRY 表 4 各反应液检测的目的基因 Tab. 4 Information of the sequence tagged sites in each tube Tube Sequence tagged site Tube A sy86 sy127 sy254 ZFY SRY Tube B sy84 sy134 sy255 ZFY SRY Tube C sy145 sy15 / ZFY SRY 表 5 多重 PCR 扩增循环步骤 Tab. 5 Multiplex PCR amplification process Step Temperature ( ) Time Cycle number min min s s 72 1 min min 1 结 1 RT-PCR 法检测 Y 染色体微缺失 443 例标本中, 检测出 AZF 缺失的标本 3 例, 其中 2 例为 AZFc+d 区缺失 (sy152,sy254,sy255 位点缺失 ), 1 例 AZFb+c+d 区缺失 (sy127,sy134,sy152, sy254,sy255 位点缺失 ), 其他样本未检测出 AZF 区域缺失 AZF 缺失标本和正常男性女性 DNA 的 RT-PCR 扩增曲线见图 1 ~ 图 4 2 多重 PCR 法验证 Y 染色体微缺失标本使用多果表 1 多重 PCR 方法使用的引物信息 Tab. 1 Sequence tagged sites and their primer sequences Gene Forward and reverse primer Length (bp) AFY F: ACCRCTGTACTGACTGTGATTACAC; R: GCACYTCTTTGGTATCYGAGAAAGT SRY F: GAATAT TCCCGCTCTCCGGA; R: GCTGGTGCTCCATTCTTGAG sy84 F: AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT; R: GCCTACTACCTGGAGGCTTC 326 sy86 F: GTGACACACAGACTATGCTTC; R: ACACACAGAGGGACAACCCT 318 sy127 F: GGCTCACAAACGAAAAGAAA; R: CTGCAGGCAGTAATAAGGGA 274 sy134 F: GTCTGCCTCACCATAAAACG; R: ACCACTGCCAAAACTTTCAA 301 sy145 F: CAACACAAAAACACTCATATACTCG; R: TTGAGAATAATTGTATGTTACGGG 143 sy152 F: AAGACAGTCTGCCATGTTTCA; R: ACAGGAGGGTACTTAGCAGT 125 sy254 F: GGGTGTTACCAGAAGGCAAA; R: GAACCGTATCTACCAAAGCAGC 380 sy255 F: GTTACAGGATTCGGCGTGAT; R: CTCGTCATGTGCAGCCAC 123

3 314 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr 2016,37(4) 重 PCR 法检测上述 3 例 AZF 缺失标本, 缺失位点均与 RT-PCR 法检测结果一致 AZFb+c+d 区缺失 (sy127 sy134 sy152 sy254 sy255 位点缺失 ) 和 AZFc+d 区缺失 (sy152,sy254,sy255 位点缺失 ) 标本的多重 PCR 结果见图 5 讨论精子的正常生成由 Y 染色体和常染色上的数个基因共同调控相对于正常人群而言, 无精子症或者少精症伴随染色体异常的概率较大 Y 染色体 AZF 区的微缺失已是目前公认的导致男性不育的原因之一研究显示,Y 染色体 AZF 微缺失与多种男性不育有关, 如精液质量低下精索静脉曲张和生殖激素异常等男性不育患者中均查出不同程度的 AZF 微缺失使用常规的精液分析或者 Y 染色体核型分析都无法对此进行检测因此, 对于散发性的非梗阻性原因引起的男性不育症,Y 染色体微缺失分析在辅助生殖过程中起着非常重要图 1 RT-PCR 方法检测正常男性 DNA 标本的扩增曲线图 Fig. 1 Amplification curve of normal male DNA detected by RT-PCR curve: SRY;C:blue curve: sy254;green curve: sy134;purple curve: SRY;D:blue curve: sy145;green curve: sy255; purple curve: SRY 图 2 RT-PCR 方法检测正常女性 DNA 标本的扩增曲线图 Fig. 2 Amplification curve of normal female DNA detected by RT-PCR A: blue curve: sy86;green curve: sy84;purple curve: β-actin;b: blue curve: sy127;green curve: sy152;purple curve: SRY;C: blue curve: sy254;green curve: sy134;purple curve: SRY;D: blue curve: sy145;green curve: sy255;purple curve: SRY

4 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr 2016,37(4) 图 3 RT-PCR 方法检测 AZFb+c+d 区缺失 (sy127 sy134 sy152 sy254 sy255 位点缺失 ) 样本的扩增曲线图 Fig. 3 DNA with AZFb+c+d deletions detected by RT-PCR (sy127, sy134, sy152, sy254, sy255 deletion) curve: SRY;C:blue curve: sy254;green curve: sy134;purple curve: SRY;D:blue curve: sy145;green curve: sy255; purple curve: SRY 图 4 RT-PCR 方法检测 AZFc+d 区缺失 (sy152,sy254, sy255 位点缺失 ) 样本的扩增曲线图 Fig. 4 DNA with AZFc+d deletions detected by RT-PCR (sy152, sy254, sy255 deletion) curve: SRY;C:blue curve: sy254;green curve: sy134;purple curve: SRY;D:blue curve: sy145;green curve: sy255;purple curve: SRY 的作用欧洲男科协会 (European Academy of Andrology, EAA) 和欧洲分子遗传质量协作网 (European Molecular Genetics Quality Network,EMQN) 发布的 Y 染色体微缺失的检测指南, 推荐检测分别位于 AZFa AZFb 和 AZFc 3 个区域的 sy84 sy86 sy127 sy134 sy254 和 sy255 6 个试序列标签位点 (sequence tagged site,sts), 即每个区域 2 个 STS 位点 [8] 随着研究的深入,AZFd 区也逐渐纳入到了检测范围中 [9-10] 因此, 本研究在上述 6 个 STS 位点的基础上, 增加了 sy152 和 sy145 这两个位于 AZFd 区的 STS 位点本研究检测出的 3 例 Y 染色体微缺失的男性, 均有 AZFd 区的位点缺失, 也证明了检测该区域的重要性此 3 例样本均为多区域缺失样本,2 例 AZFc+d 区缺失,1 例 AZFb+c+d 缺失, 这也与其他实验室统计的多区域缺失概率相吻合 [11] 本次统计显示,Y 染色体微缺失的比例约占非

5 316 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Apr 2016,37(4) 图 5 多重 PCR 法检测 AZF 缺失样本的电泳图 Fig. 5 Results from multiplex polymerase chain reaction analysis 1, 2, 3 line: DNA with AZFc+d deletions (sy152, sy254, sy255 deletion) amplification in tube A, B and C, respectively; 4, 5, 6 line: DNA with AZFb+c+d deletions (sy127, sy134, sy152, sy254, sy255 deletion) amplification in tube A, B and C, respectively; 7, 8, 9 line: Normal male DNA amplification in tube A, B and C, respectively; 10, 11, 12 line: Normal female DNA amplification in tube A, B and C, respectively; M: 50bp DNA ladder 梗阻性无精症的 10.3%, 占无精症严重少精症和少精症总数的 5.3% 关于 Y 染色体微缺失的比例, 不同的研究小组研究结论差异很大, 可能是由于样本量大小不同, 或者使用的 STS 位点和数量不一致, 但大多数报道普遍为 15% 的发生率 [7,11-12] 目前, 国内多数实验室使用多重 PCR 方法对目的片段进行扩增, 然后通过琼脂糖电泳或者毛 [13-15] 细电泳对产物进行分离该方法也是中国人 Y 染色体微缺失分子诊断指南 ( 草案 ) 推荐使用的方法报道使用 RT-PCR 方法检测 Y 染色体微缺失的实验室数量有限虽然多重 PCR 方法对仪器设备要求不高, 仅需普通 PCR 仪和琼脂糖凝胶电泳设备即可实现 STS 位点的检测, 但该方法多为人工操作, 自动化程度低, 无法实现高通量检测同时, 对产物进行分析时所使用的核酸染料也具有潜在的致癌可能, 对实验人员的安全防护以及实验室安全要求较高基于 RT-PCR 方法进行 STS 位点检测, 避免了 PCR 扩增后的分离检测的过程, 减少了实验时间和费用同时, 检测和分析过程自动化程度高, 减少了人工操作产生的误差和交叉污染, 可实现大规模筛查目前已有实验室使用 RT-PCR 进行 Y 染色体微缺失的检测, 但相关报道仍十分有限 [16-17] 本实验采取 RT-PCR 方法对 Y 染色体微缺失进行检测将 8 种基因分为 4 组, 每组 2 个 STS 位点, 分别为 1 ~ 4 号管 1 号管使用 β-actin 作内标, 其余 3 管使用性别决定基因 (SRY 基因 ) 作内标, 同时, 每批检测均有正常女性基因和正常男性基因作为对照既保证了每管内检测结果的可靠性, 也确保了每批实验结果的准确度和可信度在实验过程中, 本实验小组使用多重 PCR 方法对 Y 染色体微缺失标本正常女性 DNA 和正常男性 DNA 进行验证, 两者结果一致随着选择性辅助生殖技术的发展, 越来越多不育男性选择卵泡浆内单精子显微注射技术或体外受精联合胚胎移植技术等试管婴儿方法来孕育下一代这也潜在地影响精子生成基因传递到下一代因此, 不育的男性在辅助生殖之前, 进行充分的基因缺陷相关检测, 对于避免缺陷基因的遗传具有重要意义参考文献 1 Naasse Y,Charoute H,El Houate B,et al. Chromosomal abnormalities and Y chromosome microdeletions in infertile men from Morocco[J]. BMC Urol,2015,15 :95. 2 Ferlin A,Arredi B,Foresta C. Genetic causes of male infertility[j]. Reprod Toxicol,2006,22(2): Ambulkar P,Chuadhary A,Waghmare J,et al. Prevalence of Y chromosome microdeletions in idiopathic azoospermia cases in central Indian men[j]. J Clin Diagn Res,2015,9(9):GC01-GC04. 4 Krausz C,Degl innocenti S. Y chromosome and male infertility : Update,2006[J]. Frontiers in Bioscience,2006,11 : Rozen S,Skaletsky H,Marszalek JD,et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes[j]. Nature,2003,423(6942): Zaimy MA,Kalantar SM,Sheikhha MH,et al. The frequency of Yq microdeletion in azoospermic and oligospermic Iranian infertile men [J]. Iran J Reprod Med,2013,11(6): Hadjkacem-Loukil L,Ayadi I,Bahloul A,et al. Tag STS in the AZF region associated with azoospermia in a Tunisian population[j]. J Androl,2007,28(5): Simoni M,Bakker E,Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004[J]. Int J Androl,2004,27(4): Muslumanoglu MH,Turgut M,Cilingir O,et al. Role of the AZFd locus in spermatogenesis[j]. Fertil Steril,2005,84(2): Küçükaslan AŞ,Çetintaş VB,Altıntaş R,et al. Identification of Y chromosome microdeletions in infertile Turkish men[j]. Turk J Urol,2013,39(3): Al-Achkar W,Wafa A,Moassass F. Cytogenetic abnormalities and Y-chromosome microdeletions in infertile Syrian males[j]. Biomed Rep,2013,1(2): Fu L,Xiong DK,Ding XP,et al. Genetic screening for chromosomal abnormalities and Y chromosome microdeletions in Chinese infertile men[j]. J Assist Reprod Genet,2012,29(6): 李明昭, 施文浩, 李伟, 等. 无精子症和重度少精子症不育患者 Y 染色体微缺失率的临床研究 [J]. 生殖医学杂志,2015, 24(2): 刘春玲, 吴晓云, 邱惠麒, 等. 无精子症和严重少精子症患者 Y 染色体微缺失染色体核型和性激素结果分析 [J]. 中华男科学杂志,2013,19(10): 欧妙玲, 陈志华, 刘丽雅, 等.Y 染色体无精子症因子微缺失的筛查与临床探讨 [J]. 检验医学与临床,2015,12(3): 崔瑾, 程伟, 张阳丽, 等.Real-timePCR 技术筛查男性不育患者的 Y 染色体微缺失 [J]. 重庆医科大学学报,2015,40(6): Segat L,Padovan L,Doc D,et al. A Real-Time polymerase chain Reaction-Based protocol for low/medium-throughput Y-Chromosome microdeletions analysis[j]. Genet Test Mol Biomarkers,2012,16 (12):

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Microsoft Word _new_.doc HEREDITAS (Beijing) 2011 8, 33(8): 895 900 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告 DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00895 QF-PCR 在染色体异常男性不育症诊断中的应用齐漫龙, 张媛媛, 刘晓亮, 何蓉, 赵彦艳, 110004 为评估定量荧光 PCR (QF-PCR) 方法在男性不育遗传学诊断中的应用价值,