标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

境霍
7 years ago
Views:

1 第 21 卷第 3 期草地学报 2013 年 5 月 Vo.21 No.3 ACTA AGRESTIA SINICA My 2013 do: /j.n.1007g 紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究周冀琼 1, 邓波 1, 马晓彤 2, 张英俊 1, 周可 1 1. 中国农业大学动物科技学院草业科学系, 北京 ;2. 中国农业科学院土肥所, 北京 ) 摘要 : 以苜蓿根瘤菌 Snohzobummo)ACCC17631 和 ACCC17676 为供试菌株, 采用单因素碳氮源利用试验和正交设计试验, 确定最佳碳源氮源及培养基配方. 结果表明 :2 株供试菌株最佳碳源为蔗糖, 最佳氮源分别为大豆粉和酵母粉. 根瘤菌 ACCC17631ACCC17676) 的最佳培养基配方 g L -1 ) 为 : 蔗糖 20, 大豆粉酵母粉 )2.4, K2HPO40.25,KH2PO40.25,MgSO4 7H2O0.2,NC0.1,pH 为 6.8~7.0. 关键词 : 紫花苜蓿 ; 根瘤菌 ; 培养基 ; 优化中图分类号 :S 文献标识码 :A 文章编号 :1007G )03G0607G05 OpmzonoARhzobum Mdum ZHOUJGqong 1,DENGBo 1,MA XoGong 2,ZHANG YngGjun 1,ZHOU K 1 1.DpmnoGndSn,CogoAnmSn& Thnoogy,ChnAguuUnvy, Bjng100193,Chn;2.SondzInu,ChnAdmyoAguuSn,Bjng100081,Chn) Ab:Tpmum mdndomuopnvnsnohzobum mo ACCC17631 ndaccc17676wonmdbyngobonndnognuzonxpmn ndogondgnxpmn.ruwdhpmumbonwuo,ndh opmumnogn wyxndoybn m.tpmum mdum omuo ACG CC17631 ACCC17676)wg L -1 ):uo20 + oybnmyx)2.4+k2hpo KH2PO40.25+MgSO4 7H2O0.2+NC0.1,ndpH6.8~7.0. Kywod:A;Rhzobum;Mdum;Opmzon 紫花苜蓿 Mdgov L.) 作为世界上栽培面积最大的豆科牧草, 素有牧草之王的美称, 营养丰富蛋白质含量高适口性好, 可解决养殖业中 [1] 蛋白质饲料不足的问题. 研究表明, 播种前对苜蓿进行根瘤菌接种, 可增加苜蓿的出苗率抗病虫害 [2] 能力, 明显提高牧草产量以及营养价值. 接种根瘤菌剂已成为世界各国豆科作物增产的一项技术措 [3] 施, 在许多国家都有大规模的商品菌剂生产和出 [4] 售, 应用面积不断扩大. 为了适应中国苜蓿根瘤菌肥生产的需求, 本研究通过单因素试验和正交试验优化筛选最适合苜蓿根瘤菌 Snohzobum mg o) 生长的碳源氮源及培养基配方, 由于不同的根瘤菌对其培养基中的最佳碳氮源的选择存在差异, 故选择 2 株苜蓿根瘤菌 ACCC17631 和 ACCC17676 作 [5] 为供试菌株进行对比, 以期为苜蓿根瘤菌今后的研究与菌肥生产提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 材料菌株及其特性 : 快生型苜蓿根瘤菌 ACCC17631 和 ACCC17676, 由中国农业微生物菌种保藏中心提供.2 株菌均属于苜蓿中华根瘤菌, 菌体小杆状, 在根瘤菌培养基上菌落为圆型乳白色半透明, 边缘整齐, 有粘质, 在 B.T.B 反应中产酸, 在石蕊牛奶中均凝结.2 株根瘤菌在 ph4.0~9.0 范围内均能生长. 根瘤菌 ACCC17631 在含盐量为 4.0% NC 的 YMA 培养基中生长正常,ACCC17676 耐盐性略差, 在含盐收稿日期 :2012G12G13; 修回日期 :2013G03G11 基金项目 : 国家牧草产业技术体系 CARSG35); 公益性行业农业 ) 科研专项 ); 十二五农村领域国家科技支撑计划课题 2012BAD13B07) 资助作者简介 : 周冀琼 1987G), 女, 甘肃武威人, 硕士研究生, 研究方向为草地资源生态与管理,EGm:qongqonghh221@163.om; 通信作者 Auoopondn,EGm:dngbo67@u.du.n

2 ６０８草地量３５ NC的 YMA 培养基中生长正常, 株菌均适合华北东北西北等盐碱土地区接种使用 [６]. : 培养基:YMA 液体培养基甘露醇１０, g L ) KHPO４５,KHPO４５,MgSO４７HO,酵１母粉蒸馏水１８,NC １, ０００mL, ８~７０. ph６试验方法菌种活化:在斜面培养基上８培养４８h 后, 接种到 YMA 液体培养基中,８, １５０ m n １转速的摇床中震荡培养４８h 制成接种液. 培养基碳源的筛选:YMA 培养基中分别用等量蔗糖葡萄糖甘露醇及麦芽糖作为碳源,培养基其他部分保持不变.将活化菌液按１ V/V)接种量接入装有５０ ml 液体培养基的１００ ml 三角瓶中, ８,１５０ m n １震荡培养. 培养期间用分光光度计每６h 测定菌液 OD６００nm 吸光度值,连续测学第１卷报图所示.不同碳源对苜蓿根瘤菌 ACCC１７６３１和 ACCC１７６７６生长具有不同的影响. 根瘤菌 ACＧ CC１７６３１在蔗糖和甘露醇为碳源的培养基中生长较好,且蔗糖略优于甘露醇,生长６０h 后,其 OD６００值最高分别达到８８４和８１９.在葡萄糖为碳源的培养基中生长缓慢,对数生长时间短,其 OD６００值最高达到０３,在以麦芽糖为碳源的培养基中生长最差,其 OD６００值最高仅达到７４５.根瘤菌 ACＧ CC１７６７６在蔗糖为碳源的培养基中生长最好,其 OD６００值高达９０,在甘露醇中生长次之, ６０h 后 OD６００值为５６３,在以葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基中生长较差.由于甘露醇在生产成本上远高于蔗糖,所以选择蔗糖作为 ACCC１７６３１和 ACＧ CC１７６７６根瘤菌培养基进一步优化的碳源. 定６０h,分别绘制苜蓿根瘤菌 ACCC１７６３１和 ACＧ CC１７６７６在不同碳源下的生长曲线并选出各自的最佳碳源 [７],每处理均重复４次. 培养基氮源的筛选:YMA 培养基中分别用等量酵母粉蛋白胨大豆粉作为氮源进行试验,培养基其他成分不变.将活化菌液按１ V/V)接种量接入装有５０ ml 液体培养基的１００ ml 三角瓶中, ８, １５０ m n １震荡培养.用分光光度计测定 OD６００nm 值,绘制苜蓿根瘤菌 ACCC１７６３１和 ACCC１７６７６在不同氮源下的生长曲线并选出最佳氮源. 正交试验:根据上述单因子试验得出结果,对选定的碳源氮源磷源以及 MgSO４７HO 这４种主要成分进行 L９３４ )正交试验,培养４８h 后,用分图１不同碳源对根瘤菌 ACCC１７６３１生长的影响１ E o d n bon g on hg ow naccc１７６３１光光度计测定 OD６００nm 值,分析４种物质对苜蓿根瘤菌的影响度及最佳剂量组合 [８Ｇ９]. 验证试验:用已筛选得到的最佳培养基与试验中 OD６００nm 值最高的培养基进行比较,验证正交试验的结果. 结果与分析１培养基中的不同碳源对苜蓿根瘤菌生长的影响碳源是根瘤菌培养基中必不可少的组成成分, 是构成根瘤菌细胞和代谢产物中碳架来源的重要营养物质,因此对根瘤菌培养基中碳源进行筛选对根瘤菌生长有至关重要的作用 [１０]. 蔗糖葡萄糖甘露醇以及麦芽糖４种常见碳源对苜蓿根瘤菌 ACＧ CC１７６３１和 ACCC１７６７６生长的影响结果如图１和图不同碳源对根瘤菌 ACCC１７６７６生长的影响 o d n bon on g E hg ow naccc１７６７６培养基中的不同氮源对苜蓿根瘤菌生长的影响氮源对比试验结果如图３和图４所示.根瘤菌 ACCC１７６３１在大豆粉为氮源的培养基中的生长速度远快于在其他氮源中的生长速度, ６０h 后,ACＧ CC１７６３１在大豆粉中的 OD６００值达到１９,在蛋白

3 第３期６０９周冀琼等:紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究胨中却仅为１６４. 由图４可知,根瘤菌 ACCCＧ１７６７６在以酵母粉为氮源的培养基中生长效果最３培养基优化试验分析在筛选培养基碳源氮源的基础上,对培养基的好, OD６００最高达到０７９,大豆粉次之,其 OD６００最高达到９０５５,蛋白胨的利用效果最差.故选择大主要成分:蔗糖大豆粉酵母粉 ) KHPO４/ KHPO４和 MgSO４７HO 做正交设计试验,进一步优化确定最佳组合剂量.正交设计方案及结构如豆粉作为根瘤菌 ACCC１７６３１培养基进一步优化的氮源,而选酵母粉作为根瘤菌 ACCC１７６７６培养基中的最优氮源. 表１所示.结果表明: ACCC１７６３１在３号配方的培养基中生长速度最快,其次为６号培养基表 ;由表所示方差分析结果表明:大豆粉 KHPO４/ KHPO４和 MgSO４７HO 对根瘤菌 ACCC１７６３１的活菌数影响极显著０;蔗糖对其影响不显著０５ ). 表３所示极差分析结果表明:ACＧ CC１７６３１在优化培养基中培养时, ４种营养成分对其生长速度影响顺序是:酵母粉 B) MgSO４７HO D) KHPO４/KHPO４ C) 葡萄糖 A),最佳表现组合为 A３B３C１D３,即蔗糖０ g,大豆粉４ g, KHPO４５g, KHPO４５g, MgSO４７HO g;accc１７６７６在８号配方的培养基中生长速度最图３不同氮源对根瘤菌 ACCC１７６３１生长的影响快,其次是６号培养基表.表４所示方差分析结 o d n n ogn on g ３ E 果表明:蔗糖大豆粉 KHPO４/KHPO４以及 Mg Ｇ SO４７HO 对根瘤菌 ACCC１７６７６的活菌数影响均 hg ow naccc１７６３１极显著０.而表３所示极差分析结果表明: ACCC１７６７６在优化培养基中培养时, ４种营养成分对其生长速度影响的顺序是: MgSO４７HO D) 酵母粉 B) 葡萄糖 A) KHPO４/KHPO４ C),最佳表现组合为 A３B３C１D３,即蔗糖０g,酵母粉４ g, KHPO４５g,KHPO４５g,MgSO４７HO g. ４优化培养基的验证试验对正交试验得出的优化培养基与它们的常规培图４不同氮源对根瘤菌 ACCC１７６７６生长的影响 o d n n ogn on g ４ E 养基及株供试菌株在正交试验中生长速度最快的 hg ow naccc１７６７６表１正交设计与试验结果 Tb １ O gon d mn u gnndxp 试验号 Cod １３４５６７８９蔗糖 /g 因素 o １７６３１:大豆粉 Soyb nm Su o A) １７６７６:酵母粉 Y x B) ０) ０) ０) KHPO４ KHPO４ C) MgSO４７HO ５ D) ５ ) ４４５５５５４ ) ) 试验结果 R u OD６００) １７６３１１７６７６８０１０７８０６９８１７６３７７７９６３５９３６８０５８７３８４９７１５０７１４６８４４５６９５４４７

4 610 草地学报第 21 卷表 2 根瘤菌 ACCC17631 正交试验方差分析表 Tb2 AnyovnonACCC17631byogonx 变异系数 Vonon SS D MS 显著性 Sgnn 蔗糖 Suo 大豆粉 Soybnm K2HPO4/KH2PO MgSO4 7H2O 试验误差 Expmno 注 No): P<0.01 表 3 L93 4 ) 培养基优化试验结果的极差分析表 Tb3 Ruongnybyogonx A B C D k k k R 最优水平 Opmzdv A3 A3 B3 B3 C1 C1 D3 D3 因素主次顺序 Odoo 17631:B>D>C>A 17676:D>B>A>C 表 4 根瘤菌 ACCC17676 正交试验方差分析表 Tb4 AnyovnonACCC17631byogonx 变异系数 Vonon SS D MS 显著性 Sgnn 蔗糖 Suo 酵母粉 Yx K2HPO4/KH2PO MgSO4 7H2O 试验误差 Expmno 注 No): P<0.01 3,8,6 号培养基进行验证, 结果如图 5 和图 6 所示. 根瘤菌 ACCC17631 培养 60h 后在优化培养基和 3 号培养基中的生长速度相近,OD600 值分别为和 2.092, 在 6 号培养基中的 OD600 值为 1.99, 均高于常规培养基 YMA 中的 1.438; 同样根瘤菌 ACG CC17676 培养 60h 后测定的优化培养基和正交试验 8 号培养基的 OD600 值分别为和 2 002, 而对照 YMA 只有 1.694, 根瘤菌 ACCC17631 和 ACG CC17676 的生长曲线图 5 和图 6) 更进一步说明筛选出来的优化培养基优于常规 YMA 培养基. 3 讨论与结论图 5 不同培养基中根瘤菌 ACCC17631 的生长曲线目前, 国内外关于根瘤菌培养基优化的研究主要集中于大豆 Gynmx) 花生 AhhyG pog) 等经济作物, 对豆科牧草, 特别是紫花苜蓿的研究鲜见报道 [11]. 苜蓿根瘤菌的常规培养基是 YMA 培养基, 但由于 YMA 培养基是 g.5 GowhuvonACCC17631 ndnuumd 半合成培养基, 用于大规模发酵生产时, 成本较 [12] 高. 本研究在 YMA 培养基的基础上针对碳源氮源以及培养基的其他主要成分做出了优化. 碳

5 第 3 期周冀琼等 : 紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究 611 根瘤菌种子包衣, 根瘤菌仍存在存活时间短菌种活性不易保存的问题, 如何保持菌肥或包衣中长期高效的活菌数还有待于进一步的研究. 参考文献 [1] 韦革宏, 朱毓华, 万晓红, 等. 紫花苜蓿根瘤菌种子处理剂的研究 [J]. 草地学报,2005,134):287G290 [2] SphnJH G,RkH M.InnpoduonndomuG on[j].dcoprh,2000,652/3):249g258 [3] DkR,RghyRJ,KnndyIR.LgumdnG onhnoogy:avw[j].soboogyndbohmy, 图 6 不同培养基中根瘤菌 ACCC17676 的生长曲线 g.6 GowhuvonACCC17676 ndnuumd 源氮源的利用试验表明, 蔗糖和甘露醇是 2 株供试菌株比较理想的碳源, 但是蔗糖价格相对较低, 故选蔗糖作为碳源更加经济高效. 而大豆粉和酵母粉分别是根瘤菌 ACCC17631 和 ACCC17676 最佳的氮源选择. 正交试验以及优化培养基的验证试验得出根瘤菌 ACCC17631ACCC17676) 的最佳培养基配方 g L -1 ): 蔗糖 20,K2HPO4 0.25,KH2PO4 0 25,MgSO4 7H2O 0.2, 大豆粉酵母粉 )2.4, NC0.1,pH6.8~7.0. 另外, 通过 2 株供试菌株的对比试验证明, 苜蓿根瘤菌对培养基中碳氮源的选择虽存在差异, 但差异并不显著, 仅在苜蓿根瘤菌对培养基中氮源的选择上存在差异, 说明优化出的培养基比常规根瘤菌培养基更加普遍适用于快生型苜蓿根瘤菌的培养. 选择优化高活菌数的培养基是生产优质苜蓿根瘤菌肥的第一步, 目前, 无论是进行根瘤菌拌种或是 2004,368):1275G1288 [4] BmbS,NdkdmP A.EoRhzobumnnG on,mnd moybdnumonnognxononodud Puvug L.[J].AnJno Moboogy Rh,2010,49):682G696 [5] 陈海荣, 郭照辉, 刘前刚, 等. 紫云英根瘤菌培养基的选择与优化 [J]. 湖南农业科学,20111):13G15 [6] 马晓彤. 苜蓿根瘤菌与苜蓿品种共生匹配优良组合筛选的研究 [D]. 北京 : 中国农业科学院,2009:47G48 [7] 吴红慧, 周俊初. 根瘤菌培养基的优化和剂型的比较研究 [J]. 微生物学通报,2004,312):14G19 [8] 管宇, 黄必恒, 吴志松, 等. 关于正交试验设计的重复试验问题 [J]. 浙江林学院学报,2003,204):413G418 [9] 尚军红, 康丽华, 罗玉萍, 等. 相思根瘤菌和解磷菌培养基优化及解磷能力研究 [J]. 林业科学研究,2005,182):177G182 [10] 迟玉成, 樊堂群, 禹山林, 等. 慢生型花生根瘤菌培养基优化研究 [J]. 花生学报,2007,364):25G28 [11] 肖亦农, 徐琼. 大豆根瘤菌 HH103 菌株培养基的筛选与优化 [J]. 微生物学杂志,2011,316):92G95 [12] 刘保平, 周俊初. 根瘤菌菌剂研究 [J]. 湖北农业科学,2006,45 1):57G61 责任编辑刘云霞 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析