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1 第 六 章 临 床 生 化 诊 断 试 剂 盒 的 选 择 与 评 价 随 着 自 动 生 化 分 析 仪 的 研 制 成 功 和 普 遍 使 用, 推 动 了 体 外 诊 断 试 剂 商 品 化 的 进 程, 商 品 试 剂 与 标 准 液 按 检 测 项 目 组 合 成 一 套 放 在 一 个 包 装 盒 内 叫 试 剂 盒 (reagen kit), 或 叫 试 剂 组 合 (reagen set) 与 自 动 化 分 析 仪 匹 配 的 试 剂 盒 的 研 制 生 产 和 供 应 走 向 产 业 化 的 道 路, 它 无 疑 是 临 床 生 化 发 展 史 上 一 个 巨 大 的 技 术 进 步 但 是, 试 剂 盒 的 质 量, 将 严 重 影 响 测 定 结 果 的 正 确 性 为 了 增 强 识 别 试 剂 质 量 的 能 力, 提 高 拒 用 劣 质 试 剂 的 自 觉 性, 掌 握 有 关 试 剂 盒 的 质 量 标 准 和 质 量 评 价 是 十 分 有 益 的 第 一 节 试 剂 盒 的 分 类 和 特 点 临 床 生 化 诊 断 试 剂 种 类 繁 多, 有 液 体 型 粉 剂 型 片 剂 型, 有 单 一 试 剂 双 试 剂 干 试 剂 多 试 剂 等 生 产 厂 供 应 商 也 很 多 纵 观 近 20 多 年 来 的 发 展, 临 床 生 化 体 外 诊 断 试 剂 盒 的 分 类 和 发 展 历 史 可 用 下 图 6-1 表 示 图 6-1 临 床 生 化 诊 断 试 剂 盒 分 类 和 发 展 史 一 液 体 型 试 剂 和 粉 ( 片 ) 剂 型 试 剂 ( 一 ) 液 体 型 试 剂 无 论 是 单 试 剂 还 是 双 试 剂 型 试 剂, 目 前 乃 至 今 后 仍 以 液 体 型 为 主 要 剂 型 其 优 点 是 液 体 型 试 剂 的 试 剂 组 分 高 度 均 一, 瓶 间 差 异 小, 测 定 重 复 性 好 和 使 用 方 便 ; 它 也 无 需 加 入 任 何 辅 助 试 剂 及 蒸 馏 水, 避 免 了 外 源 性 水 质 对 试 剂 的 影 响, 性 能 较 稳 定, 测 定 结 果 较 为 准 确 缺 点 是 液 体 型 试 剂 ( 尤 其 是 酶 试 剂 ) 保 存 时 间 较 短, 不 便 于 运 输 1. 液 体 单 试 剂 所 谓 液 体 单 试 剂 就 是 将 某 种 生 化 检 验 项 目 所 用 到 的 试 剂 科 学 地 混 合 在 一 起, 组 成 为 一 种 试 剂 应 用 时, 只 须 将 标 本 和 试 剂 按 一 定 比 例 混 合, 即 可 进 行 相 应 的 生 化 反 应, 然 后 用 适 当 的 方 法 检 测 结 果 应 用 十 分 方 便 为 了 简 化 测 定 操 作 程 序, 提 高 工 作 效 率, 一 度 大 多 数 试 剂 厂 家 都 生 产 单 试 剂, 以 满 足 用 户 的 需 要 如 测 定 葡 萄 糖 和 胆 固 醇 的 酶 法 试 剂 等 这 些 试 剂 的 广 泛 使 用, 1

2 充 分 显 示 出 酶 法 试 剂 无 毒 性 操 作 简 便 快 速 测 定 结 果 可 靠 等 优 点 但 对 有 些 生 化 检 验 项 目 来 说, 单 试 剂 存 在 抗 干 扰 能 力 差 的 缺 点, 给 测 定 结 果 带 来 相 当 大 的 分 析 误 差 例 如, 甘 油 三 酯 测 定 的 一 步 法 试 剂, 由 于 未 消 除 样 品 中 的 游 离 甘 油, 使 测 定 结 果 中 包 括 了 内 源 性 甘 油 ( 平 均 约 为 0.11mmol/L), 会 给 甘 油 三 酯 的 测 定 值 带 来 较 大 的 误 差 类 似 的 情 况 还 见 于 维 生 素 C 和 尿 酸 及 胆 红 素 对 Trinder + 反 应 的 干 扰, 内 外 源 性 NH 4 对 尿 素 酶 法 测 定 的 干 扰, 以 及 内 源 性 丙 酮 酸 对 ALT AST 测 定 的 干 扰 等 选 用 时 值 得 注 意 2. 液 体 双 试 剂 所 谓 液 体 双 试 剂 就 是 将 某 些 生 化 检 测 项 目 所 用 到 的 试 剂, 按 用 途 科 学 地 分 成 两 类, 分 别 配 成 两 种 试 剂, 通 常 第 一 试 剂 加 入 后 可 起 到 全 部 或 部 分 消 除 某 些 内 源 性 干 扰 的 作 用, 第 二 试 剂 为 启 动 被 检 测 物 质 反 应 的 试 剂, 两 种 试 剂 混 合 后 才 共 同 完 成 被 检 项 目 的 生 化 反 应 然 后 用 适 当 的 方 法 检 测 结 果 双 试 剂 型 试 剂 盒, 它 保 持 了 单 试 剂 的 优 点, 增 强 了 抗 干 扰 能 力 和 试 剂 的 稳 定 性, 提 高 了 测 定 的 准 确 性, 代 表 了 诊 断 试 剂 盒 剂 型 研 制 的 主 要 发 展 方 向 ( 二 ) 粉 ( 片 ) 剂 型 试 剂 所 谓 粉 剂 型 及 片 剂 型 试 剂, 即 是 将 试 剂 的 各 组 分 用 球 磨 技 术 粉 碎 成 粉 剂 或 混 合 后 压 成 片 剂, 使 用 前 再 加 入 指 定 的 溶 液 复 溶 成 液 体 试 剂 干 粉 试 剂 如 果 在 冻 干 分 装 前 是 液 体 型 的, 则 其 各 组 分 是 相 当 均 匀 的 ; 但 如 果 用 固 体 原 料 研 磨 后 制 成 粉 剂 或 片 剂, 则 存 在 许 多 问 题 :1 要 使 试 剂 各 组 分 混 合 得 非 常 均 匀, 技 术 难 度 很 大 ;2 分 装 过 程 中 的 称 量 误 差 及 复 溶 时 加 水 量 的 准 确 性 影 响 试 剂 的 瓶 间 差 ; 3 水 质 优 劣 对 试 剂 的 稳 定 性 和 测 定 的 可 靠 性 有 相 当 大 的 影 响 二 其 它 类 型 试 剂 为 了 适 应 生 化 分 析 仪 和 测 定 方 法 学 的 进 步, 近 年 来 研 究 了 许 多 新 型 的 试 剂 盒, 主 要 有 以 下 几 种 ( 一 ) 快 速 反 应 试 剂 盒 快 速 反 应 试 剂 盒 主 要 是 为 了 适 应 生 化 分 析 的 技 术 进 步, 缩 短 反 应 时 间, 提 高 工 作 效 率 如 血 液 葡 萄 糖 快 速 测 定 试 剂 盒 其 试 剂 成 分 及 浓 度 为 磷 酸 盐 缓 冲 液 100mmol/ L,pH7.4±0.1, 葡 萄 糖 氧 化 酶 > 40u / ml, 变 旋 酶 > 0.2u / ml, 过 氧 化 物 酶 > 2.5u / ml,4- 氨 基 安 替 比 林 0.5 mmol/ L, 4- 羟 基 苯 甲 酸 4 mmol/l, 亚 铁 氰 化 钾 1mg / L, 叠 氮 钠 0.4g / L 同 一 般 葡 萄 糖 氧 化 酶 法 试 剂 相 比 是 明 显 增 加 了 葡 萄 糖 氧 化 酶 及 过 氧 化 物 酶 用 量, 更 主 要 是 增 加 了 变 旋 酶, 可 使 反 应 加 快,3~4 分 钟 后 即 生 成 最 终 颜 色 再 如 快 速 胆 固 醇 试 剂 盒, 用 的 是 ph6.6±0.2,250mmol/ L 磷 酸 盐 缓 冲 液, 胆 固 醇 酯 酶 为 250u / L, 胆 固 醇 氧 化 酶 250 u/l, 过 氧 化 物 酶 4000u / L,4- 氨 基 安 替 比 林 0.3mg / L,DHBS 8mmol/ L 样 品 与 试 剂 比 例 是 1: 反 应 2 分 钟 即 可 完 成 反 应 可 以 明 显 看 出 是 加 大 胆 固 醇 酯 酶 和 胆 固 醇 氧 化 酶 等 效 应 酶 用 量, 从 而 使 反 应 加 速 目 前 要 求 这 种 快 速 反 应 的 试 剂 用 户 还 不 多, 但 它 是 一 种 发 展 趋 势 2

3 ( 二 ) 一 步 法 试 剂 盒 这 是 随 着 方 法 学 的 改 进, 特 别 是 免 疫 技 术 的 进 步, 利 用 特 异 性 抗 体 参 与 反 应 的 新 型 试 剂 如 高 密 度 脂 蛋 白 (HDL) 测 定 以 往 多 采 用 超 速 离 心 法 和 沉 淀 法 使 HDL 从 其 他 脂 蛋 白 中 分 离 后 再 测 定 HDL 中 胆 固 醇, 沉 淀 法 操 作 繁 琐, 必 须 预 先 处 理 才 能 用 生 化 分 析 仪 分 析 近 年 来 采 用 抗 低 密 度 脂 蛋 白 和 极 低 密 度 脂 蛋 白 血 清 预 先 抑 制 LDL 及 VLDL, 然 后 再 测 定 HDL, 这 样 就 减 少 沉 淀 预 处 理, 直 接 测 定 出 高 密 度 胆 固 醇 类 似 的 试 剂 盒 还 有 肌 酸 激 酶 (CK) 及 其 同 工 酶 CK-MB 的 测 定 ( 三 ) 多 项 同 测 组 合 试 剂 盒 这 类 型 试 剂 主 要 是 用 于 三 点 双 项 同 测 终 点 法 三 点 双 项 同 测 连 续 监 测 法 和 三 点 双 项 同 测 终 点 速 率 法 测 定 的 试 剂 盒 很 明 显 这 类 试 剂 同 以 往 单 试 剂 和 双 试 剂 有 明 显 不 同 随 着 双 试 剂 的 应 用, 临 床 生 化 分 析 仪 的 分 析 方 法 也 相 应 发 展, 其 中 有 一 种 分 析 方 法 是 在 同 一 比 色 杯 中, 先 后 加 入 两 种 试 剂 与 检 品 中 的 两 种 被 检 物 发 生 反 应, 在 各 反 应 达 到 平 衡 期 时 分 别 测 定, 整 个 测 定 过 程 进 行 三 次 比 色, 测 定 两 个 项 目, 称 为 三 点 双 项 同 测 终 点 法 例 如 甘 油 三 脂 胆 固 醇 同 时 测 定 法 该 法 的 第 一 试 剂 为 Tris 缓 冲 液, 含 胆 固 醇 酯 酶 ATP MgCl 2 过 氧 化 物 酶 磷 酸 甘 油 氧 化 酶 甘 油 激 酶 脂 肪 酶 4- 氨 基 安 替 吡 啉 2- 羟 3.5- 氯 苯 磺 酸 钠 Triton-X 等, 第 二 试 剂 为 Tris 缓 冲 液, 其 中 含 胆 固 醇 氧 化 酶 当 血 清 或 标 准 液 ( 包 括 甘 油 三 酯 和 胆 固 醇 ) 与 第 一 试 剂 混 合 后 立 即 进 行 第 一 次 比 色 (510nm) 得 空 白 吸 光 度 37 作 用 5 分 钟 后 进 行 第 二 次 比 色, 为 甘 油 三 酯 与 酶 试 剂 反 应 终 点 的 吸 光 度, 又 是 胆 固 醇 测 定 的 空 白 吸 光 度 然 后 加 入 第 二 试 剂,37 作 用 5~10 分 钟, 进 行 第 三 次 比 色, 为 胆 固 醇 与 酶 试 剂 反 应 终 点 的 吸 光 度 甘 油 三 酯 浓 度 =[A 2( 样 品 )-A B( 样 品 )]/[A 2(TG 标 准 )-A B(TG 标 准 )] 甘 油 三 酯 标 准 的 浓 度 总 胆 固 醇 浓 度 =[A 3( 样 品 )-A 2( 样 品 )]/[A 3(TC 标 准 )-A 2(TC 标 准 )] 胆 固 醇 标 准 的 浓 度 ( 四 ) 卡 式 试 剂 盒 试 剂 首 先 装 入 试 剂 瓶, 瓶 上 充 分 使 用 编 码 技 术, 而 后 根 据 编 码 启 动 调 配 使 用 及 更 换 储 存 其 特 点 是 :1 卡 式 试 剂 瓶 上 条 码 令 使 用 者 可 快 捷 准 确 地 输 入 试 剂 数 据, 如 测 试 数 量 批 号 有 效 期, 保 证 正 确 识 别 试 剂 2 试 剂 装 载 后 能 自 动 调 配, 可 消 除 潜 在 误 差, 并 节 省 操 作 时 间 3 持 续 不 断 地 监 察 仪 器 上 已 装 载 的 试 剂 存 量, 并 在 供 应 量 不 足 时 通 知 使 用 者 试 剂 装 载 使 用 时 间 可 长 达 一 个 月 4 所 有 卡 式 试 剂 盒 大 小 划 一, 有 利 储 存 卡 式 试 剂 设 计 较 独 特, 可 防 止 试 剂 蒸 发 及 降 解, 能 确 保 试 剂 装 载 后 的 稳 定 性 更 长, 从 而 节 省 成 本 5 标 签 根 据 测 试 类 别 以 颜 色 编 码, 便 于 使 用 者 识 别 ( 五 ) 浓 缩 试 剂 盒 上 述 卡 式 试 剂 盒 就 是 采 用 的 浓 缩 试 剂, 使 用 时 自 动 完 成 稀 释, 而 后 用 于 测 定 浓 缩 试 剂 便 于 工 作 储 存 运 输 装 载 等 优 越 性 是 很 明 显 的, 浓 缩 试 剂 便 于 监 控 减 少 校 正 次 数 提 高 工 作 质 量 在 浓 缩 试 剂 基 础 上 又 组 成 双 试 剂 及 多 项 同 测 组 合 试 剂, 又 体 现 出 它 们 所 具 有 的 特 点 及 优 越 性 以 后 3

4 这 种 浓 缩 试 剂 及 其 各 种 组 合, 将 成 为 一 种 时 尚, 将 成 为 人 们 乐 于 使 用 的 新 型 试 剂 盒 三 液 体 双 试 剂 盒 的 特 点 液 体 双 试 剂 与 其 它 类 型 试 剂 比 较 具 有 液 体 试 剂 和 双 试 剂 的 优 点 ( 一 ) 提 高 了 抗 干 扰 反 应 的 能 力 在 临 床 生 化 测 定 过 程 中, 血 标 本 除 了 含 有 待 测 物 质 外, 还 含 有 各 种 酶 有 机 物 无 机 盐 等 物 质, 这 些 物 质 都 会 干 扰 或 参 与 测 试 反 应, 引 起 非 特 异 性 反 应 干 扰, 而 双 试 剂 型 试 剂 盒 设 计 的 一 个 主 要 目 的 就 是 为 了 克 服 这 种 干 扰 反 应 在 测 定 过 程 中, 首 先 让 试 剂 Ⅰ 与 标 本 中 的 干 扰 物 质 反 应, 反 应 5 分 钟 后, 再 用 试 剂 Ⅱ 启 动 真 正 的 测 试 反 应, 从 而 使 测 定 结 果 更 加 准 确 例 如 : 尿 素 氮 的 酶 法 测 定 此 测 定 通 过 二 步 化 学 反 应 来 完 成 脲 酶 尿 素 + H 2O NH4 + CO2 GLDH NH 4 + α 酮 戊 二 酸 + NADH 谷 氨 酸 + NAD + + CO2 在 340nm 下 监 测 吸 光 度 值 的 变 化, 与 同 样 处 理 的 尿 素 标 准 液 比 较, 计 算 出 样 品 尿 素 含 量 这 一 反 应 的 第 一 步 特 异 性 高, 脲 酶 只 对 样 品 中 的 尿 素 起 催 化 作 用, 但 第 二 步 反 应 就 存 在 一 些 干 扰 : 样 品 中 ( 如 血 清 尿 液 ) 含 有 NH 4,( 内 源 性 NH 4 ) 会 消 耗 NADH, 使 测 定 结 果 偏 高 ; 复 溶 试 剂 时 所 用 蒸 馏 水 如 果 含 有 NH 4 或 者 所 用 器 材 不 够 清 洁 被 NH 4 污 染 ( 外 源 性 NH 4 ) 也 会 消 耗 NADH, 使 测 定 结 果 偏 高 ; 当 样 品 中 ( 如 血 清 ) 含 有 较 高 的 丙 酮 酸 时, 血 清 中 的 乳 酸 脱 氢 酶 会 催 化 下 列 反 应 : LDH NADH + 丙 酮 酸 + H + 乳 酸 + NAD + H2O 也 会 消 耗 NADH, 使 测 定 结 果 偏 高 也 就 是 说, 用 单 一 试 剂 型 试 剂 测 定 尿 素 时 存 在 内 源 性 NH 4 外 源 性 NH 4 和 内 源 性 丙 酮 酸 的 干 扰, 使 测 定 结 果 产 生 正 误 差 测 定 尿 素 的 酶 法 双 试 剂 ( 液 体 型 ) 试 剂 盒 有 两 个 试 剂, 均 为 液 体, 不 必 复 溶 第 一 试 剂 含 α 酮 戊 二 酸 NADH 谷 氨 酸 脱 氢 酶 及 维 持 ph 的 缓 冲 物 质 第 二 试 剂 含 脲 酶 NADH α 酮 戊 二 酸 当 被 检 样 品 加 入 第 一 试 剂 在 37 作 用 5 分 钟, 将 内 源 NH 4 外 源 性 NH 4 及 内 源 性 丙 酮 酸 消 耗 掉 接 着 加 入 第 二 试 剂 使 样 品 中 的 尿 素 被 脲 酶 水 解 成 NH 4, 再 进 行 第 二 步 反 应, GLDH NH 4 + α 酮 戊 二 酸 + NADH 谷 氨 酸 + NAD + + CO2 4, 消 耗 NADH 量 与 尿 素 量 成 正 比, 这 就 保 证 了 尿 素 测 定 的 准 确 性 再 如 : 目 前 在 临 床 化 学 检 测 中 用 的 较 为 普 遍 的 指 示 反 应 Trinder 反 应 ( 主 要 用 于 代 谢 产 物 的 测 定, 如 葡 萄 糖 尿 酸 甘 油 三 脂 胆 固 醇 HDL), 此 指 示 反 应 的 特 异 性 较 差, 受 到 血 标 本 中 的 胆 红 素 抗 坏 血 酸 的 干 扰, 导 致 结 果 的 阴 性 偏 差 其 中 为 了 克 服 胆 红 素 的 干 扰, 国 内 外 部 分 试 剂 已 通 过 加 入 铁 氰 化 钾 调 整 显 色 剂 改 变 测 定 波 长 来 排 除 胆 红 素 的 干 扰, 而 抗 坏 血 酸 的 影 响 和 干 扰 一 直 较 难 克 服, 从 面 影 响 了 测 定 结 果 液 体 双 试 剂 ( 包 括 甘 油 三 脂 胆 固 醇 HDL 尿 酸 肌 酐 ) 在 试 剂 I 中 加 入 了 抗 坏 血 酸 氧 化 酶, 当 标 本 和 试 剂 I 先 反 应, 便 可 克 服 标 本 抗 坏 血 酸 的 干 扰, 当 抗 干 扰 反 应 完 毕 后, 再 加 入 试 剂 Ⅱ 启 动 反 应, 从 而 使 得 整 个 反 应 的 特 异 性 大 大 提 高, 准 确 度 也 相 应 提 高

5 另 外, 最 常 见 的 干 扰 是 黄 疸 有 的 测 定 试 剂 中 加 有 胆 红 素 氧 化 酶, 先 作 用 黄 疸 血 清 使 其 氧 化 无 色, 而 后 再 加 反 应 试 剂 完 成 反 应 测 定, 消 除 黄 疸 的 影 响 ( 二 ) 使 测 定 更 科 学 合 理 由 于 液 体 双 试 剂 的 使 用, 使 测 定 更 加 科 学 合 理 如 甘 油 三 脂 LP 甘 油 + 游 离 脂 肪 酸 GK 甘 油 + ATP 甘 油 3 磷 酸 GPO 甘 油 3 磷 酸 + O2 磷 酸 二 羟 丙 酮 + H2O2 POD H2 O2 + 4 AAP + DHBS 醌 亚 胺 + H2O 目 前 国 内 临 床 生 化 检 验 使 用 的 生 化 试 剂 绝 大 多 数 都 是 单 一 试 剂, 在 甘 油 三 脂 测 定 中 测 得 甘 油 三 脂 的 含 量 实 际 上 是 标 本 中 甘 油 三 脂 与 游 离 甘 油 的 总 含 量, 尽 管 临 床 上 可 以 通 过 减 去 标 本 中 平 均 游 离 甘 油 的 含 量 和 修 改 正 常 范 围 加 以 弥 补, 但 是, 由 于 临 床 标 本 的 个 体 差 异, 使 得 血 标 本 中 游 离 甘 油 的 含 量 不 可 能 都 一 样 而 液 体 双 试 剂 可 先 让 标 本 与 试 剂 I 反 应 ( 试 剂 I 中 包 括 甘 油 激 酶 抗 坏 血 酸 氧 化 酶 甘 油 3 磷 酸 氧 化 酶 过 氧 化 物 酶 ), 从 而 彻 底 消 耗 标 本 中 游 离 甘 油, 排 除 抗 坏 血 酸 的 干 扰, 然 后 再 用 试 剂 Ⅱ 含 有 LP 和 发 色 团 启 动 反 应, 使 得 测 得 的 结 果 真 正 反 映 标 本 中 甘 油 三 脂 的 含 量 ( 三 ) 稳 定 性 能 优 良 目 前 临 床 化 学 检 定 的 许 多 项 目 都 已 用 酶 法 进 行 测 定, 这 些 酶 法 测 定 与 以 往 化 学 测 定 法 相 比 具 有 无 可 比 拟 的 优 越 性 :1 特 异 性 高 ;2 试 剂 单 一, 操 作 步 骤 简 单, 可 自 动 操 作 ;3 反 应 温 和, 无 污 染 等 但 是 酶 法 生 化 商 品 试 剂 生 产 的 最 大 技 术 障 碍 便 是 试 剂 的 稳 定 性 问 题, 为 此 许 多 试 剂 生 产 厂 家 推 出 了 冻 干 干 粉 片 剂 的 酶 法 试 剂, 从 而 解 决 了 成 品 贮 存 与 运 输 问 题, 然 而 在 使 用 过 程 中 仍 然 受 到 了 复 溶 后 稳 定 性 的 影 响, 各 实 验 室 在 使 用 中 如 果 包 装 太 大, 复 溶 后 稳 定 期 过 后 便 会 造 成 浪 费, 如 果 包 装 太 小, 本 身 价 格 太 高, 造 成 日 常 化 验 成 本 居 高 不 下 全 液 体 酶 法 试 剂 从 分 配 上 解 决 了 这 一 矛 盾 : 1 用 户 可 根 据 每 次 标 本 量 多 少 按 一 定 比 例 配 制 适 量 工 作 液, 当 天 配 制 当 天 用 完, 这 样 便 可 减 少 试 剂 损 失 2 如 果 用 户 使 用 的 自 动 生 化 分 析 仪 有 双 试 剂 测 定 功 能, 那 么, 就 不 必 把 双 试 剂 混 合 成 工 作 试 剂 进 行 测 定, 试 剂 的 有 效 期 一 年 便 是 工 作 液 的 有 效 期 对 于 干 粉 片 剂 型 等 需 复 溶 的 生 化 试 剂, 水 质 的 好 与 坏 直 接 影 响 了 复 溶 后 工 作 液 的 稳 定 性 和 测 定 重 复 性 目 前 除 了 一 些 大 城 市 的 三 级 医 院 有 自 制 的 试 剂 级 的 蒸 馏 水 外, 别 的 医 院 很 难 获 得 符 合 试 剂 级 要 求 的 水, 这 就 对 干 粉 片 剂 试 剂 的 实 际 使 用 造 成 了 一 定 影 响 目 前 临 床 化 学 检 测 中 许 多 项 目 已 经 开 始 用 酶 法 进 行 分 析 测 定, 而 试 剂 中 许 多 酶 在 水 溶 液 中 是 比 较 脆 弱 的, 许 多 杂 质 都 会 影 响 酶 活 力, 如 1 水 中 F 会 引 起 某 些 酶 失 活 ;2 水 中 的 重 金 属 离 子 会 影 响 酶 活 力 ;3 水 中 某 些 微 生 物 会 引 起 酶 失 活, 除 了 水 中 某 些 杂 质 会 引 起 试 剂 中 酶 失 活 部 分 失 活 而 导 致 稳 定 性 重 复 性 下 降 外, 有 些 杂 质 会 直 接 影 响 测 定 结 查, 如 水 中 含 有 NH 4 便 会 直 接 影 响 尿 素 氮 测 定 的 准 确 度 全 液 体 型 生 化 试 剂, 在 使 用 过 程 无 需 任 何 辅 助 试 剂 及 蒸 馏 水, 这 就 保 证 避 免 了 外 源 水 质 而 引 起 的 对 试 剂 的 影 响, 保 证 了 试 剂 在 有 效 期 内 的 稳 定 和 测 定 结 果 的 可 靠 5

6 ( 四 ) 试 剂 组 分 高 度 均 一 试 剂 中 每 一 组 分 均 一 性 是 影 响 试 剂 测 定 重 复 性 的 一 个 重 要 因 素 在 干 粉 片 剂 与 冻 干 生 化 试 剂 生 产 过 程 要 使 每 一 试 剂 中 十 几 种 组 分 ( 有 的 组 分 含 量 相 当 微 量 ) 分 布 相 对 均 匀 也 是 一 个 技 术 难 度 较 高 的 课 题 在 每 一 种 试 剂 生 产 过 程 中 必 须 解 决 :1 原 料 干 粉 生 产 过 程 中 每 一 组 分 的 均 匀 性 ( 冻 干 生 化 试 剂 在 冻 干 分 装 前 由 于 是 液 体 的, 每 个 组 分 是 相 当 均 匀 ) 2 在 分 装 过 程 中 由 于 加 样 误 差 引 起 的 均 匀 性 问 题 ( 这 一 问 题 在 冻 干 分 装 过 程 中 同 样 存 在 : 在 片 剂 生 产 过 程 中 体 现 为 每 一 片 剂 重 量 误 差 ) 3 在 使 用 过 程 中, 由 于 需 加 入 复 溶 水, 复 溶 水 的 加 样 误 差 也 会 造 成 瓶 与 瓶 之 间 同 一 组 分 浓 度 不 尽 一 样 上 述 三 个 原 因 或 其 中 一 个 原 因 都 会 造 成 实 际 测 定 过 程 中 的 瓶 间 误 差, 从 而 引 起 测 定 重 复 性 下 降 液 体 型 的 生 化 试 剂 从 生 产 到 使 用 全 是 液 态, 这 就 保 证 了 每 一 个 组 分 相 对 均 匀, 哪 怕 是 十 分 微 量 的 组 分, 这 就 避 免 了 实 际 操 作 中 的 误 差, 能 提 高 试 剂 测 定 的 重 复 性 第 二 节 临 床 生 化 诊 断 试 剂 的 制 备 诊 断 试 剂 ( 包 括 标 准 品 ) 的 质 量 是 影 响 分 析 质 量 的 一 个 主 要 因 素, 因 而 在 试 剂 研 制 生 产 过 程 中 推 行 标 准 化 的 要 求 是 保 证 试 剂 质 量 的 关 键 所 在 一 标 准 品 的 制 备 ( 一 ) 标 准 物 质 应 具 备 的 条 件 1. 必 备 的 主 要 条 件 1 纯 度 高 ;2 定 值 准 确 可 靠 ;3 稳 定 性 好, 在 保 管 使 用 有 效 期 内 其 示 值 误 差 不 超 出 证 书 的 许 可 范 围 ;4 均 一 性 好, 任 何 一 份 分 装 的 小 样 品 都 具 备 整 个 标 准 物 质 的 特 性 指 标 2. 附 加 条 件 1 摩 尔 质 量 尽 可 能 大 ;2 具 有 符 合 使 用 目 的 之 反 应 特 性 ;3 制 造 简 便, 价 格 低 廉, 购 买 方 便 ;4 标 准 物 质 的 组 成 若 发 生 变 化 ( 如 吸 潮 ) 时, 可 采 用 重 新 干 燥 ( 恒 重 ) 等 措 施 使 其 复 原 美 国 国 家 标 准 局 (NBS,1998 年 改 名 为 国 家 标 准 和 技 术 研 究 院 ) 批 准 的 多 种 供 医 学 检 验 用 的 一 级 标 准 物 质 见 表 6-1 表 6-1 NBS 用 于 临 床 化 学 的 部 分 标 准 物 质 编 号 参 考 物 质 SRM909a 冻 干 人 血 清, 含 钙 氯 胆 固 醇 肌 酐 葡 萄 糖 锂 镁 钾 钠 尿 素 和 尿 酸 SRM910 丙 酮 酸 钠 (98.7%) SRM911b 胆 固 醇 (99.8%) SRM912a 尿 素 (99.97%) 6

7 SRM913 尿 酸 (99.7%) SRM914a 肌 酐 (99.7%) SRM915 碳 酸 钙 (99.9%) SRM916a 胆 红 素 (98.3%) SRM917a D- 葡 萄 糖 (99.7%) SRM918 氯 化 钾 (99.9%) SRM919a 氯 化 钠 (99.89%) SRM920 D- 甘 露 醇 (99.8%) SRM921 皮 质 醇 ( 氢 化 可 的 松 )(98.9%) SRM922 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (99.99%)(pH 标 准 ) SRM923 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 盐 酸 盐 (99.69%)(pH 标 准 ) SRM924 碳 酸 锂 (100.0%) SRM 羟 基 -3- 甲 氨 基 -DL- 苯 乙 醇 酸 (VMA)(99.4%) SRM926 冻 干 牛 血 清 白 蛋 白 (99.4%) SRM927 牛 血 清 白 蛋 白 溶 液 (70.48±0.50g/L)(99.4%) SRM929 二 水 葡 萄 糖 酸 镁 ( 镁 5.403%) SRM935 结 晶 重 铬 酸 钾 吸 收 比 SRM936 二 水 合 硫 酸 奎 宁 荧 光 光 谱 标 准 SRM 硝 基 苯 酚 ( 规 定 吸 收 波 长 为 401nm) SRM956 用 于 选 择 电 极 法 的 人 血 清 中 电 解 质 水 平, 钠 mmol/L, 钾 及 2.05mmol/L) SRM968a 人 血 中 脂 溶 性 维 生 素 ( 维 生 素 A,SRM922, 维 生 素 E 及 β- 胡 萝 卜 素 SRM998 人 血 管 紧 张 素 Ⅰ(94.1%) SRM1598 人 血 清 中 无 机 组 份 ( 铜 0.72μg/g, 铁 2.55μg/g, 镁 20.0μg/g, 钾 196μg/g, 铷 0.17μg/g, 锌 0.89μg/g, 铝 3.7ng/g, 镉 ng/g, 钴 1.24 μg/g, 锰 3.78 ng/g, 钼 11.5 ng/g, 硒 42.4 ng/g) SRM1599 抗 痉 挛 药 物 测 试 标 准,3 种 浓 度 (Valproic 酸 14.5,69.1 及 142.5mg/ml, 卡 马 西 平 及 19.4 mg/ml) SRM1703a 二 氧 化 碳 5%, 氧 7%- 血 气 标 准 ( 单 一 审 批 ) SRM1951 冰 冻 人 血 中 胆 固 醇 (5.440,6.266 及 7.292mmol/L) SRM8430 天 冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶 (AST) 从 人 红 细 胞 提 取 (96.1U/L) ( 二 ) 标 准 液 的 配 制 1. 标 准 液 配 制 的 依 据 供 临 床 生 化 常 规 测 定 用 的 标 准 液 属 于 二 级 标 准 物 质, 其 示 值 的 准 确 性 对 检 验 质 量 有 重 大 影 响, 必 须 在 标 准 物 质 选 择 恒 重 方 法 程 序 基 质 ( 包 括 水 ) 的 质 量 最 优 化 的 配 方 和 制 备 工 艺 上 都 要 严 格 按 照 我 国 卫 生 部 医 政 司 主 持 编 写 修 订 的 全 国 临 床 检 验 操 作 规 程 (1997 年 5 月, 第 二 版 ) 的 要 求 进 行 2. 标 准 液 的 质 量 鉴 定 不 论 是 实 验 室 自 行 配 制 或 厂 家 生 产 的 标 准 液, 都 需 要 认 真 地 按 照 国 家 卫 生 部 的 规 定 做 好 质 量 检 定 提 出 的 规 范 化 的 要 求 和 质 量 检 定 标 准, 并 在 标 准 液 制 备 过 程 中 应 该 严 格 检 定 程 序, 使 其 达 到 质 量 标 准 ( 三 ) 标 准 液 的 正 确 使 用 1. 应 采 购 诊 断 试 剂 正 规 生 产 厂 家 生 产 的 商 品 标 准 液, 尤 其 有 国 家 卫 生 部 生 产 文 号 的 产 品 7

8 2. 一 瓶 标 准 液 只 能 使 用 一 次, 避 免 反 复 冻 融 反 复 使 用, 尤 其 是 标 准 物 质 稳 定 性 较 差 的 标 准 液 ( 如 尿 素 葡 萄 糖 胆 红 素 白 蛋 白 等 ) 以 及 标 准 液 的 基 质 易 挥 发 的 标 准 液 ( 如 用 无 水 乙 醇 配 制 的 胆 固 醇 标 准 液 等 ) 更 应 注 意 3. 定 值 质 控 血 清 只 能 用 于 临 床 生 化 室 内 质 量 控 制 及 室 间 质 量 评 价, 不 能 用 作 常 规 分 析 的 标 准 物 质, 也 不 能 用 于 相 应 物 质 含 量 的 标 化 或 仪 器 分 析 性 能 准 确 性 的 评 价 4. 按 照 各 种 标 准 液 不 同 保 存 条 件 妥 善 保 管, 并 在 其 有 效 期 内 使 用 二 试 剂 中 常 用 工 具 酶 的 质 量 保 证 ( 一 ) 工 具 酶 的 概 念 工 具 酶 是 指 作 为 诊 断 试 剂 来 测 定 化 合 物 浓 度 或 酶 活 性 的 一 类 酶 它 是 酶 试 剂 的 核 心, 它 的 质 量 是 酶 试 剂 质 量 的 决 定 性 因 素 在 临 床 生 化 领 域 里, 目 前 已 设 计 出 几 百 种 酶 试 剂 系 统 和 测 定 方 法, 用 于 200 多 个 临 床 生 化 检 验 项 目, 使 酶 试 剂 方 法 成 为 最 有 发 展 前 途 的 分 析 方 法 可 以 预 见, 在 不 远 的 将 来, 现 有 的 临 床 生 化 分 析 方 法 将 基 本 上 被 酶 试 剂 方 法 所 取 代 ( 二 ) 工 具 酶 的 来 源 和 理 化 特 性 临 床 生 化 酶 试 剂 中 的 工 具 酶 主 要 来 自 动 植 物 组 织 提 取 及 微 生 物 发 酵 工 程 在 早 期, 酶 多 由 含 酶 丰 富 的 动 植 物 组 织 提 取 ; 在 当 代, 除 了 脲 酶 过 氧 化 物 酶 乳 酸 脱 氢 酶 等 分 别 由 豆 类 种 子 辣 根 和 心 肌 中 提 取 外, 工 具 酶 主 要 依 赖 微 生 物 发 酵 工 程 获 得 微 生 物 发 酵 工 程 包 括 高 产 酶 菌 种 的 筛 选 放 大 培 养 和 酶 提 取 纯 化 三 个 部 分 不 同 来 源 的 同 一 种 工 具 酶 有 不 同 的 理 化 特 性 为 了 更 有 效 地 发 挥 工 具 酶 的 催 化 效 能, 形 成 最 佳 的 酶 试 剂 配 方, 必 须 确 切 地 掌 握 该 酶 对 底 物 的 专 一 性 分 子 量 等 电 点 Km 最 适 ph 最 适 温 度 等 理 化 特 性 参 数, 并 熟 悉 辅 助 因 子 激 活 剂 和 抑 制 剂 对 酶 活 性 的 影 响 ( 三 ) 工 具 酶 的 纯 度 要 求 不 同 的 酶 试 剂 系 统 对 工 具 酶 的 纯 度 有 不 同 的 要 求 以 NADH 的 生 成 或 减 少 作 为 指 示 反 应 的 测 定 系 统 中, 由 于 组 织 匀 浆 中 往 往 含 有 NADH- 细 胞 色 素 C 还 原 酶, 它 将 消 耗 NADH 而 出 现 干 扰 反 应, 因 此 要 求 该 测 定 系 统 的 工 具 酶 有 较 高 的 纯 度 而 在 Trinder 反 应 中, 由 于 人 体 液 中 氧 化 酶 较 少, 产 生 副 反 应 的 机 会 较 少, 因 此 对 测 定 系 统 中 工 具 酶 的 纯 度 要 求 相 对 低 一 些 衡 量 工 具 酶 纯 度 的 要 求 指 标 是 : 1. 酶 的 比 活 性 酶 的 比 活 性 是 评 价 酶 纯 度 的 最 好 标 准, 即 每 毫 克 ( 酶 ) 蛋 白 所 具 有 的 酶 活 性 (U/mg) 酶 的 比 活 性 越 高, 酶 的 纯 度 越 高 一 般 要 用 推 荐 的 酶 活 性 测 定 方 法 测 定 2. 杂 酶 含 量 为 了 兼 顾 工 具 酶 的 较 低 生 产 成 本 和 保 证 酶 试 剂 质 量, 对 工 具 酶 中 容 易 引 起 副 反 应 的 其 他 酶 ( 即 所 谓 杂 酶 ) 含 量 提 出 了 允 许 限 度 的 要 求 ( 见 表 6-2), 但 是 目 前 尚 未 有 国 家 卫 8

9 生 部 或 中 华 医 学 检 验 学 会 的 推 荐 标 准 ( 一 ) 缓 冲 液 的 组 成 三 缓 冲 液 的 配 制 缓 冲 液 是 临 床 生 化 诊 断 试 剂 的 重 要 组 成 部 分 由 于 它 对 外 来 的 H + 和 OH - 有 双 向 调 节 作 用, 因 而 能 为 酶 试 剂 中 的 待 测 物 质 反 应 提 供 最 适 ph, 以 利 于 这 些 酶 最 大 限 度 地 发 挥 其 催 化 效 能 ; 也 为 以 酸 碱 指 示 染 料 作 为 显 色 剂 的 试 剂 提 供 稳 定 的 ph 环 境, 以 保 证 这 些 试 剂 和 方 法 有 准 确 可 靠 的 测 定 结 果 一 般 的 缓 冲 剂 都 由 一 共 轭 酸 及 一 共 轭 碱 组 成 酸 性 缓 冲 液 含 有 一 弱 酸 及 其 盐 ( 共 轭 碱 ); 碱 性 缓 冲 液 含 有 弱 碱 及 其 盐 ( 共 轭 酸 ) 共 轭 酸 和 共 轭 碱 一 起 可 阻 止 溶 液 ph 发 生 剧 烈 的 变 化 当 向 溶 液 中 加 入 H + 时, 共 轭 碱 可 与 之 部 分 地 结 合 而 生 成 共 轭 酸,H + 不 再 成 游 离 状 态 存 在 ; 当 加 入 OH - 时, 则 共 轭 酸 与 之 结 合 生 成 水 及 共 轭 碱, 使 OH - 不 再 以 游 离 状 态 存 在 而 影 响 溶 液 的 酸 碱 度 ( 二 ) 缓 冲 液 的 缓 冲 容 量 缓 冲 液 维 持 ph 恒 定 的 效 力 取 决 于 其 缓 冲 容 量 的 大 小 缓 冲 容 量 是 指 使 1L 溶 液 的 ph 改 变 个 1pH 单 位 所 需 要 的 酸 或 碱 量 (mol) 缓 冲 容 量 决 定 于 盐 与 酸 ( 或 碱 ) 的 真 实 浓 度 及 两 者 的 比 值 缓 冲 液 的 浓 度 越 高, 缓 冲 容 量 越 大 一 般 的 缓 冲 液 总 浓 度 在 0.05~0.2mol/L 之 间 当 总 浓 度 固 定 时, 盐 与 酸 ( 或 碱 ) 的 比 值 为 1 时, 其 缓 冲 容 量 最 大 ; 如 果 两 者 比 值 相 差 10 倍 以 上 时, 则 缓 冲 容 量 将 大 为 减 小 在 实 际 工 作 中, 不 能 无 限 制 地 加 大 缓 冲 液 的 浓 度 来 增 加 其 缓 冲 容 量, 因 为 盐 类 浓 度 过 高 将 抑 制 酶 的 活 性, 对 电 泳 分 离 也 有 不 利 的 影 响 应 补 充 说 明 的 是, 缓 冲 液 在 表 6-2 常 用 工 具 酶 的 理 化 特 性 及 质 量 要 求 名 称 来 源 分 子 量 等 电 点 比 活 性 要 求 (U/mg) 杂 酶 的 允 许 限 度 葡 萄 糖 氧 化 酶 A.nigen >20 蔗 糖 酶 含 量 <0.01%, 过 氧 化 (GOD) P.notatom 氢 酶 <10U/mg 蛋 白 已 糖 激 酶 (HK) 酵 母 ~4.80 >140 磷 酸 葡 萄 糖 异 构 酶 <0.01% 9 G-6-PDH<0.01% 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 酵 母 >140 CK 磷 酸 葡 萄 糖 异 构 酶 <0.02% 脱 氢 酶 (G-6-PDH) 过 氧 化 物 酶 (POD) 辣 根 >50 不 含 胺 氧 化 酶 及 过 氧 化 氢 酶 脲 酶 巨 豆 ~100 天 冬 氨 酸 酶 0.02%, 精 氨 酸 酶 0.002%,NH μg/U, 谷 氨 酸 脱 氢 酶 变 形 杆 菌 醇 脱 氢 酶 LDH MDH<0.01% (GLDH) 乳 酸 脱 氢 酶 心 ~ ALT<0.01%,PK 醛 缩 酶 <0.001% (LDH) 脂 蛋 白 脂 肪 酶 心 50394( 人 ) >100 ATP 酶 < %,NADH 氧

10 (LPL) 假 单 胞 菌 属 ± 化 酶 <0.001%,COD<0.002%, 过 氧 化 氢 酶 <0.02% 甘 油 激 酶 嗜 热 脂 肪 NADH 氧 化 酶 <0.001%, (GK) 芽 孢 杆 菌 HK<0.02% 磷 酸 -3- 甘 油 足 球 菌 ±0.1 >40 乳 酸 氧 化 酶 0.001% 氧 化 酶 胆 固 醇 酯 酶 假 单 胞 菌 >25 ATP 酶 < %,GOD< (CEH) %,NADH 氧 化 酶 < 0.001%, 尿 酸 酶 < %, 过 氧 化 氢 酶 <1U/mg 胆 固 醇 氧 化 酶 链 霉 菌 ~5.4 >25 CEH<0.005%,GOD< %, (CHOD) 尿 酸 酶 <0.0004%,NADH 氧 化 酶 <0.0007% 胆 红 素 氧 化 酶 疣 胞 漆 斑 菌 >0.2 (BOD) 尿 酸 酶 肝 过 氧 化 氢 酶 <1.0% 丙 酮 酸 氧 化 酶 ATP 酶 0.05%,ALT AST 0.05% 被 稀 释 或 加 入 中 性 盐 时, 其 ph 能 基 本 维 持 恒 定 在 一 般 情 况 下, 将 缓 冲 液 稀 释 1 倍, 其 ph 值 只 改 变 一 个 ph 单 位 的 百 分 之 几 ; 加 入 0.1mol/L 中 性 盐 溶 液, 只 使 ph 值 大 约 改 变 0.1 但 是 温 度 的 改 变 不 可 忽 视, 如 0.025mol/L 混 合 磷 酸 盐 缓 冲 液 ( 用 GR 磷 酸 二 氢 钾 3.4g,GR 磷 酸 氢 二 钠 3.55g, 溶 解 于 双 蒸 馏 水 至 1000ml), 在 5 时 ph 为 6.95,15 时 为 6.90,25 时 为 6.86,35 时 为 6.84 故 对 ph 要 求 精 密 时 必 须 注 意 做 温 度 补 偿, 以 消 除 由 于 不 同 温 度 所 产 生 的 测 定 误 差 ( 三 ) 配 制 缓 冲 液 的 注 意 事 项 1. 所 有 试 剂 最 好 选 用 分 析 纯 或 优 级 纯, 并 必 须 恒 重 后 方 能 配 制 具 体 的 恒 重 方 法 因 试 剂 种 类 而 有 不 同, 如 :1 琥 珀 酸 甘 氨 酸 巴 比 妥 及 其 钠 盐 放 在 氯 化 钙 干 燥 器 中 至 恒 重 ;2 用 柠 檬 酸 钠 ( 含 2H 2O) 及 柠 檬 酸 ( 含 H 2O) 不 需 恒 重 直 接 配 制 其 溶 液 ;3 无 水 醋 酸 钠, 在 100 下 干 燥 3h 4 醋 酸 溶 液 用 分 析 纯 冰 醋 酸 直 接 配 制, 然 后 再 用 氢 氧 化 钠 标 准 液 进 行 标 定 2. 所 用 仪 器 必 须 清 洁, 容 量 仪 器 最 好 经 过 校 正, 以 保 证 准 确 3. 配 好 的 缓 冲 液 必 须 用 酸 度 计 校 正 其 ph 值 ( 准 确 至 小 数 点 后 两 位 ) 如 对 其 浓 度 有 怀 疑 时, 则 应 用 滴 定 法 检 查 其 浓 度 第 三 节 临 床 生 化 诊 断 试 剂 盒 的 选 择 ( 一 ) 准 确 度 一 试 剂 盒 的 性 能 指 标 10

11 通 常 以 回 收 率 定 值 血 清 的 靶 值 范 围 对 照 试 验 及 干 扰 试 验 的 结 果 来 分 析 判 断 1. 回 收 试 验 回 收 率 越 接 近 100%, 准 确 率 越 高, 一 般 以 100%±5% 为 合 格 2. 定 值 血 清 的 测 定 对 于 某 些 无 法 准 确 加 入 标 准 物 的 试 剂 盒, 可 用 低 中 高 浓 度 的 定 值 血 清 进 行 测 定, 测 得 值 符 合 定 值 血 清 的 靶 值 范 围 ( X ±2S) 为 合 格 3. 对 照 试 验 将 被 检 试 剂 盒 与 公 认 的 参 考 方 法 同 时 测 定 若 干 样 本 ( 一 般 要 求 100 份, 最 少 需 30 份 ), 计 算 两 组 结 果 的 相 关 系 数 和 直 线 回 归 方 程 相 关 系 数 γ 越 接 近 1.0 斜 率 b 越 接 近 1.0, 截 距 a 越 接 近 0, 则 准 确 度 越 高 相 关 系 数 要 求 在 0.9~1.0 之 间,γ 值 符 合 要 求 不 等 于 准 确 度 都 符 合 要 求 b 表 示 比 例 偏 差,a 表 示 恒 定 偏 差 (1-b) 100% 表 示 比 例 偏 差 的 大 小 (a 值 / 样 品 含 量 ) 100% 表 示 恒 定 偏 差 的 大 小 4. 非 特 异 性 与 干 扰 试 验 对 维 生 素 C 黄 疸 溶 血 乳 糜 等 因 素 的 耐 受 程 度, 干 扰 值 越 小 越 好 ( 二 ) 精 密 度 试 剂 的 瓶 间 差 异 批 内 精 密 度 和 批 间 差 异 三 组 测 定 的 平 均 值 之 间 应 无 显 著 差 异, 否 则, 试 剂 盒 的 均 一 性 不 符 合 要 求 1. 瓶 间 差 异 同 一 试 剂 盒, 取 10 瓶 试 剂 复 溶, 测 定 同 一 样 品 的 含 量, 求 平 均 值 标 准 差 变 异 系 数 2. 批 内 精 密 度 同 一 样 品 用 同 一 瓶 试 剂 测 定 10 次, 求 平 均 值 标 准 差 变 异 系 数 3. 批 间 差 异 同 一 样 品, 用 不 同 批 号 的 10 瓶 试 剂 测 定, 求 平 均 值 标 准 差 变 异 系 数 ( 三 ) 线 性 范 围 指 该 试 剂 盒 按 其 说 明 使 用 时 可 准 确 测 量 的 范 围 被 检 样 品 的 含 量 超 出 测 定 线 性 范 围, 必 须 改 变 样 品 与 试 剂 体 积 的 比 例, 重 新 测 定 才 能 得 到 准 确 结 果 试 剂 盒 的 测 定 线 性 范 围 是 衡 量 试 剂 盒 质 量 的 一 个 指 标, 也 是 正 确 使 用 该 试 剂 盒 的 关 键 之 一 试 剂 盒 测 定 线 性 范 围 要 求 能 覆 盖 该 项 测 定 的 常 见 医 学 决 定 水 平 测 定 线 性 范 围 太 窄 时, 常 规 工 作 中 需 调 整 标 本 量, 重 做 的 标 本 多, 造 成 人 力 物 力 财 力 和 时 间 的 浪 费 测 定 线 性 范 围 也 不 必 过 大, 否 则, 成 本 高, 价 格 贵, 原 材 料 浪 费 观 察 试 剂 盒 的 测 定 线 性 范 围 时, 应 用 真 实 标 本 如 定 值 血 清 或 标 准 液 操 作, 高 浓 度 标 本 含 量 应 超 过 说 明 书 上 规 定 线 性 上 限 的 20%, 整 个 线 性 需 要 五 组 不 同 的 浓 度, 每 组 均 需 测 定 三 次, 并 求 平 均 值 ( 四 ) 抗 干 扰 作 用 双 试 剂 型 试 剂 盒 主 要 优 点 是 抗 干 扰 作 用 如 ALT 双 试 剂 盒 的 第 一 试 剂 能 排 除 内 源 性 丙 酮 酸 干 扰 此 种 试 剂 盒 的 第 一 试 剂 加 入 被 检 血 清 后,37 5 分 钟 内 显 示 NADH 被 消 耗 340nm 吸 光 度 值 下 降 的 曲 线, 当 内 源 性 丙 酮 酸 被 消 耗 完, 吸 光 度 曲 线 平 坦, 加 入 第 二 试 剂 后,340nm 吸 光 度 立 即 上 升, 当 ALT 酶 促 反 应 发 生 后 又 下 降 这 种 反 应 曲 线 显 示 了 ALT 双 试 剂 具 抗 干 扰 作 用 甘 油 三 脂 11

12 测 定 双 试 剂 的 排 除 游 离 甘 油 的 作 用, 可 加 入 甘 油 标 准 液 后 进 行 试 验, 以 证 实 排 除 游 离 甘 油 的 能 力 ( 五 ) 灵 敏 度 在 终 点 法 灵 敏 度 以 特 定 波 长 下 1cm 光 径 时 单 位 浓 度 的 吸 光 度 值 表 示, 如 胆 固 醇 酶 法 测 定 试 剂 盒 要 求 其 灵 敏 度 A 500nm 时 的 胆 固 醇 浓 度 相 当 于 0.08mmol/L 连 续 监 测 法 以 特 定 波 长 下 1cm 光 径 单 位 酶 活 性 的 吸 光 度 值 表 示, 试 剂 盒 质 量 合 格 时, 其 灵 敏 度 值 与 理 论 计 算 的 ΔA/min 因 数 值 一 致 试 剂 盒 的 质 量 与 灵 敏 度 密 切 相 关, 灵 敏 度 达 不 到 要 求 的 试 剂 盒 不 宜 使 用 ( 六 ) 稳 定 性 试 剂 盒 稳 定 性 是 指 试 剂 盒 在 规 定 条 件 下 储 存 仍 保 持 其 性 能 指 标 的 期 限 该 期 限 应 符 合 规 定 的 储 存 期 方 法 有 以 下 三 种 1. 原 包 装 试 剂 的 稳 定 性 按 说 明 书 的 保 存 方 法 储 藏, 于 不 同 时 期 取 出 一 瓶 复 溶, 测 定 试 剂 吸 光 度 值 标 准 品 含 量 定 值 血 清 含 量 线 性 范 围 酶 促 反 应 时 间 曲 线 或 化 学 反 应 速 度 时 间 曲 线 及 其 他 性 能 指 标, 直 到 这 些 指 标 变 化 超 出 规 定 值 的 10% 以 上 的 期 限, 为 原 包 装 试 剂 的 稳 定 期 2. 复 溶 后 试 剂 的 稳 定 性 将 复 溶 试 剂 分 别 放 在 4 25 保 存, 逐 日 与 新 复 溶 试 剂 对 比, 观 察 上 述 指 标 ( 见 原 包 装 试 剂 稳 定 性 ), 直 到 测 定 结 果 与 新 复 溶 试 剂 的 差 值 >10% 以 上, 这 一 期 限 为 复 溶 后 试 剂 的 稳 定 期 3. 不 同 温 度 下 的 保 存 期 将 原 包 装 试 剂 盒 置 保 存, 以 出 现 说 明 试 剂 变 质 的 指 标 来 确 定 在 不 同 温 度 下 的 保 存 期 二 选 购 试 剂 盒 的 要 求 和 注 意 事 项 ( 一 ) 选 购 试 剂 盒 的 一 般 要 求 1. 所 采 用 的 测 定 方 法 特 异 性 好, 灵 敏 度 准 确 度 精 密 度 符 合 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 IFCC WHO 等 推 荐 的 方 法 性 能 2. 试 剂 盒 的 储 存 期 至 少 为 1 年 3. 水 溶 性 低 粘 性 无 腐 蚀 无 毒 害 不 爆 炸 不 易 燃 不 污 染 环 境 4. 所 用 标 准 品 或 标 准 参 考 物 符 合 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 IFCC WHO 推 荐 的 标 准 和 要 求 ( 二 ) 选 购 试 剂 盒 的 注 意 事 项 1. 首 先 要 仔 细 阅 读 试 剂 盒 的 说 明 书, 对 试 剂 盒 选 用 方 法 有 所 了 解, 科 学 研 究 工 作 时 应 选 择 参 考 方 法 试 剂 盒, 医 疗 预 防 工 作 应 选 择 推 荐 的 常 规 方 法 试 剂 盒, 或 选 择 公 认 的 测 定 方 法 试 剂 盒 此 外, 对 试 剂 盒 的 组 成 方 法 性 能 指 标 加 以 分 析, 是 用 于 手 工 操 作, 还 是 用 于 自 动 分 析 仪 属 于 后 者, 其 实 验 参 数 是 否 与 本 单 位 自 动 分 析 仪 的 实 验 参 数 相 符 2. 有 无 卫 生 部 的 批 准 文 号 凡 已 列 入 卫 生 部 临 床 检 验 体 外 诊 断 试 剂 审 批 管 理 范 围 的 试 剂 盒, 12

13 没 有 生 产 批 准 文 号 的, 不 应 使 用 对 有 生 产 批 准 文 号 者, 也 需 考 察 生 产 厂 家 的 信 誉 3. 对 试 剂 盒 的 包 装 理 学 性 能 方 法 学 性 能 指 标 进 行 考 察 和 检 测, 并 经 实 际 应 用 符 合 说 明 书 规 定 及 本 室 实 验 要 求 者 方 可 选 购 4. 根 据 本 单 位 的 日 工 作 量 分 析 仪 试 剂 用 量 试 剂 复 溶 后 4 稳 定 期 等 因 素 综 合 分 析, 应 选 购 合 适 包 装, 近 期 出 厂 的 产 品 5. 注 意 季 节 对 试 剂 质 量 的 影 响 一 般 在 气 温 较 低 的 季 节 购 买 试 剂, 防 止 试 剂 盒 在 运 输 途 中 变 质 6. 在 确 保 试 剂 盒 质 量 前 提 下, 应 选 购 价 格 低 的 产 品 第 四 节 试 剂 盒 的 性 能 评 价 方 法 为 了 确 保 诊 断 试 剂 盒 的 质 量, 国 家 卫 生 部 于 1992 年 开 始 颁 发 了 38 种 临 床 生 化 诊 断 试 剂 质 量 检 定 暂 行 标 准, 使 诊 断 试 剂 的 生 产 检 定 和 销 售 走 上 了 规 范 化 道 路 一 说 明 书 审 查 说 明 书 是 用 户 了 解 和 正 确 使 用 试 剂 盒 的 指 南 审 查 内 容 包 括 :1 试 剂 名 称 ;2 用 途 ;3 测 定 原 理 和 技 术 要 求 ;4 试 剂 盒 内 的 包 装 内 容 ;5 适 用 仪 器 ;6 标 本 要 求 ;7 测 定 步 骤 及 注 意 事 项 ;8 贮 存 的 条 件 及 有 效 期 ;9 性 能 特 征, 包 括 准 确 度 精 确 度 特 异 性 受 干 扰 的 程 度 线 性 范 围 参 考 范 围 ;10 生 产 单 位 名 称 地 址 邮 编 及 电 话 二 理 学 检 验 与 评 价 理 学 检 验 的 内 容 有 :1 外 包 装 应 完 整 牢 固, 封 口 严 密, 标 签 清 晰 ;2 有 详 细 的 用 户 说 明 书, 卫 生 部 批 准 的 生 产 文 号, 生 产 日 期, 有 效 期 和 保 存 条 件 ;3 粉 剂 型 应 均 匀 无 凝 块, 不 粘 附 瓶 壁 ;4 液 体 型 试 剂 应 无 沉 淀, 无 混 浊, 无 渗 漏 ;5 复 溶 后 或 液 体 试 剂 的 ph 应 符 合 标 准 规 定 三 性 能 指 标 的 检 验 与 评 价 ( 一 ) 线 性 范 围 的 测 定 试 剂 盒 的 线 性 范 围, 既 是 衡 量 其 质 量 的 重 要 指 标, 也 是 保 证 正 确 使 用 和 鉴 定 试 剂 盒 的 关 键 指 标 之 一 一 般 试 剂 盒 的 线 性 范 围 应 能 覆 盖 临 床 上 的 参 考 值 范 围 和 常 见 疾 病 的 医 学 决 定 水 平, 以 减 少 样 品 稀 释 重 测 的 机 会 一 旦 线 性 范 围 变 窄 即 应 废 弃 造 成 线 性 范 围 变 窄 的 原 因 常 见 的 有 :1 生 产 中 组 13

14 份 投 料 量 不 足 ;2 生 产 后 组 分 稳 定 性 差 ;3 运 输 和 贮 存 不 当 等 ( 检 验 方 法 见 第 六 章 方 法 学 线 性 评 价 ) ( 二 ) 观 察 时 间 反 应 曲 线 酶 活 性 测 定 时 用 中 等 酶 活 性 的 定 值 血 清, 代 谢 产 物 测 定 时 用 稍 高 于 参 考 值 上 限 的 标 准 液 或 定 值 血 清, 按 说 明 书 规 定 对 样 品 进 行 测 定, 每 2s~10s 记 录 一 次 吸 光 度, 连 续 监 测 15min 同 时 用 蒸 馏 水 代 替 样 品 做 试 剂 空 白 的 时 间 反 应 曲 线 ) 以 吸 光 度 为 纵 坐 标, 反 应 时 间 为 横 坐 标 作 图, 观 察 动 态 期 ( 包 括 延 迟 期 线 性 期 混 合 期 ) 和 平 衡 期 出 现 持 续 和 终 止 的 时 间, 分 析 有 关 的 性 能 指 标 1. 终 点 法 1 试 剂 空 白 的 吸 光 度 是 否 符 合 规 定 标 准, 否 则 会 影 响 测 定 的 精 密 度 和 准 确 度 ;2 试 剂 空 白 的 时 间 反 应 曲 线 应 平 坦, 且 无 明 显 波 动, 否 则, 说 明 试 剂 本 身 不 稳 定, 会 导 致 测 定 偏 差 ;3 反 应 能 否 在 规 定 的 时 间 内 达 到 平 衡, 达 到 平 衡 的 时 间 应 在 终 点 法 读 取 测 定 吸 光 度 的 时 间 之 前 反 应 速 度 慢 的 原 因, 常 为 试 剂 中 酶 量 不 足 或 酶 质 量 不 好, 或 反 应 条 件 不 是 最 适 条 件 ;4 反 应 达 到 平 衡 后, 吸 光 度 最 大 并 维 持 不 变, 这 一 期 间 为 反 应 平 衡 期, 终 点 法 测 定 应 在 这 一 期 间 读 取 吸 光 度 2. 连 续 监 测 法 1 试 剂 空 白 值 是 否 符 合 规 定, 吸 光 度 下 降 型 的 反 应, 试 剂 空 白 吸 光 度 应 在 1.5 左 右, 吸 光 度 上 升 型 的 试 剂 空 白 吸 光 度 越 低 越 好, 不 符 合 说 明 书 中 规 定 值 者 不 宜 使 用 ;2 试 剂 空 白 的 时 间 反 应 曲 线 应 平 坦, 吸 光 度 变 化 ( A/min) 应 0.001, 若 大 于 此 值, 表 明 试 剂 本 身 分 解 变 化, 会 使 测 定 结 果 产 生 误 差 ;3 延 迟 期 线 性 反 应 期 与 设 定 的 实 验 参 数 是 否 相 符, 若 不 相 符 应 予 修 改 ; 4 观 察 时 间 反 应 曲 线 的 斜 率, 通 过 定 值 血 清, 分 析 试 剂 盒 的 灵 敏 度 当 试 剂 盒 中 底 物 浓 度 不 足, 辅 助 酶 或 指 示 酶 的 酶 量 不 足 或 质 量 不 好, 反 应 条 件 不 是 最 适 条 件 等 情 况 时, 时 间 反 应 曲 线 斜 率 下 降, 灵 敏 度 低, 测 定 结 果 有 严 重 比 例 误 差, 这 种 试 剂 盒 无 法 纠 正, 不 能 使 用 ( 三 ) 稳 定 性 试 验 稳 定 性 是 指 试 剂 在 不 同 状 态 和 不 同 条 件 贮 存 后 保 持 其 测 定 准 确 性 的 能 力 大 多 数 试 剂 盒 具 有 原 包 装 形 式 和 使 用 时 的 工 作 液 两 种 形 式, 少 数 试 剂 盒 的 原 包 装 即 为 工 作 液 评 估 试 剂 盒 的 稳 定 性 应 包 括 原 包 装 和 工 作 液 在 试 剂 盒 指 定 条 件 下 的 稳 定 性 ( 试 验 方 法 见 诊 断 试 剂 盒 的 选 择 ) 试 剂 盒 的 稳 定 性 与 贮 存 条 件 密 切 相 关, 工 作 液 的 稳 定 性 还 和 使 用 中 污 染 与 否 有 关, 在 评 估 时, 须 保 持 指 定 贮 存 条 件 并 要 严 防 污 染 其 他 还 需 做 准 确 度 试 验 精 密 度 试 验 和 抗 干 扰 试 验, 具 体 做 法 请 参 照 方 法 学 评 价 一 章 相 关 内 容 和 本 章 试 剂 盒 的 性 能 指 标 四 试 剂 盒 性 能 检 测 的 要 求 进 行 上 述 各 项 性 能 指 标 检 测 时, 要 求 操 作 正 规, 使 用 的 容 器 均 经 过 校 准, 自 动 分 析 仪 或 分 光 光 度 计 的 波 长 灵 敏 度 稳 定 性 均 符 合 要 求, 温 度 准 确 蒸 馏 水 合 格, 标 准 参 考 物 含 量 或 定 值 血 清 的 14

15 靶 值 均 经 验 证 因 为 测 定 值 是 否 准 确 可 靠, 除 与 试 剂 有 关 外, 上 述 这 些 条 件 都 是 影 响 因 素, 如 果 上 述 因 素 控 制 不 好, 试 剂 盒 质 量 好, 测 定 的 结 果 也 会 出 现 较 大 误 差 因 此, 在 分 析 试 剂 盒 性 能 检 测 结 果 时, 要 全 面 分 析, 排 除 了 试 剂 盒 以 外 的 影 响 因 素 之 后, 才 能 说 明 是 试 剂 盒 本 身 的 影 响, 切 不 可 简 单 从 事 当 然, 用 公 认 的 高 质 量 同 种 试 剂 盒 做 对 照, 同 样 条 件 下 与 被 检 试 剂 盒 同 时 测 定 相 同 样 品, 比 较 两 种 试 剂 盒 测 定 结 果 的 差 异, 有 利 于 区 别 上 述 因 素 的 影 响, 所 以, 设 立 此 种 对 照, 对 评 估 试 剂 盒 的 性 能 是 很 必 要 的 教 学 目 标 和 要 求 掌 握 临 床 生 化 诊 断 试 剂 盒 的 性 能 指 标 及 质 量 评 价 方 法, 能 正 确 地 选 择 和 评 价 试 剂 盒 熟 悉 诊 断 试 剂 盒 的 分 类 和 特 点 了 解 诊 断 试 剂 盒 的 发 展 史 以 及 与 方 法 学 的 关 系, 诊 断 试 剂 盒 的 制 备 及 其 组 成 成 分 的 质 量 要 求 ( 郑 铁 生 ) 15