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1 细 胞 培 养 基 本 技 术

2 细 胞 培 养 的 甚 本 概 念 传 代 : 细 胞 在 培 养 器 皿 中 生 长 一 定 时 间 后, 被 分 开 接 种 到 新 的 培 养 器 皿 中 原 代 培 养 取 自 体 内 新 鲜 组 织 并 置 于 体 外 条 件 下 生 长 的 细 胞 在 传 代 之 前 称 为 原 代 培 养

3 细 胞 培 养 : 使 用 单 个 细 胞 悬 液 组 织 培 养 : 使 用 组 织 块 (O.5~1 立 方 毫 米 ) 或 薄 片 ( 厚 0.2 毫 米 ) 器 官 培 养 : 使 用 器 官 原 基 或 器 官 的 一 部 分 或 整 个 器 宫

4 原 代 培 养 细 胞 的 生 命 归 宿 原 代 培 养 期 传 代 期 衰 退 期

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6 有 限 细 胞 系, 无 限 细 胞 系 细 胞 系 cell line 细 胞 株 cell strain

7 培 养 细 胞 的 特 性 培 养 细 胞 的 生 长 方 式 贴 附 生 长 : 必 须 贴 附 于 支 持 物 表 面 才 能 生 长 见 于 各 种 实 体 瘤 细 胞 悬 浮 生 长 : 于 悬 浮 状 态 下 即 可 生 长, 不 需 要 贴 附 于 支 持 物 表 面 见 于 各 种 造 血 系 统 肿 瘤 细 胞

8 每 代 贴 附 生 长 细 胞 的 生 长 过 程 游 离 期 贴 壁 期 潜 伏 期 对 数 生 长 期 停 止 期 ( 平 台 期 )

9 游 离 期 : 细 胞 接 种 后 在 培 养 液 中 呈 悬 浮 状 态. 也 称 悬 浮 期 此 时 细 胞 质 回 缩, 胞 体 呈 圆 球 形 10 分 钟 一 4 小 时

10 贴 壁 期 : 细 胞 附 着 于 底 物 上, 游 离 期 结 束 细 胞 株 平 均 在 10 分 钟 一 4 小 时 贴 壁 底 物 : 胶 原 玻 璃 塑 料 其 它 细 胞 等 血 清 中 有 促 使 细 胞 贴 壁 的 冷 析 球 蛋 白 和 纤 粘 素 胶 原 等 糖 蛋 白 ( 生 长 基 质 ), 这 些 带 正 电 荷 的 糖 蛋 白 的 促 贴 壁 因 子 先 吸 附 于 底 物 上, 悬 浮 细 胞 再 与 吸 附 有 促 贴 壁 因 子 的 附 着 进 口 塑 料 培 养 瓶 涂 有 生 长 基 质 ( 化 学 合 成 的 功 能 基 团 )

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13 潜 伏 期 此 时 细 胞 有 生 长 话 动, 而 无 细 胞 分 裂 细 胞 株 潜 伏 期 一 般 为 6~24 小 时

14 对 数 生 长 期 : 细 胞 数 随 时 间 变 化 成 倍 增 长, 活 力 最 佳, 最 适 合 进 行 实 验 研 究

15 停 止 期 ( 平 台 期 ): 细 胞 长 满 瓶 壁 后, 细 胞 虽 有 活 力 但 不 再 分 裂 机 制 : 接 触 抑 制 密 度 依 赖 性

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17 培 养 细 胞 生 长 的 条 件 1 细 胞 的 营 养 需 要 2 细 胞 的 生 存 环 境 温 度 : 37 O 2 CO 2 : 5% CO 2 +H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO3 - ph: 渗 透 压 3 无 污 染 4 无 毒

18 实 验 用 品 : 实 验 准 备 超 净 工 作 台, 压 力 蒸 汽 消 毒 器, 电 热 干 燥 箱, 滤 器, 酸 缸 CO 2 培 养 箱 倒 置 显 微 镜 酶 标 仪 微 孔 板 震 荡 器 液 氮 罐 自 动 双 重 纯 水 蒸 馏 器, 纯 水 仪 耗 材 : 培 养 瓶, 吸 管, 电 动 吸 引 器, 培 养 板, 冻 存 管

19 压 力 蒸 汽 消 毒 器 : 湿 热 消 毒, 用 途 广 电 热 干 燥 箱 : 干 热 消 毒 (160,2 小 时 ) 主 要 用 干 玻 璃 器 皿 消 毒 滤 器 : 过 滤 除 菌 : 大 多 数 培 养 用 液, 如 人 工 合 成 培 养 基 血 清 酶 液 等 均 采 用 滤 过 法 除 菌 超 净 工 作 台 : 为 细 胞 操 作 提 供 无 菌 环 境 紫 外 灯 : 紫 外 线 消 毒 主 要 用 于 培 养 室 空 气 操 作 台 塑 料 培 养 皿 和 培 养 板 等 表 面 消 毒

20 超 净 台 超 净 工 作 台 的 工 作 原 理 是 利 用 鼓 风 机 驱 动 空 气 遁 过 高 效 滤 器 除 去 空 气 中 的 尘 埃 颗 粒, 使 空 气 得 到 净 化 净 化 空 气 徐 徐 通 过 工 作 台 面, 使 工 作 台 内 构 成 无 菌 环 境

21 滤 器

22

23 CO2 培 养 箱 CO2 培 养 箱 设 定 的 条 件 为 37,5% CO 2 使 用 CO2 培 养 箱 培 养 细 胞 时 应 注 意 的 问 题 : 1 用 螺 旋 口 瓶 培 养 细 胞 时, 需 将 瓶 盖 微 松, 以 保 证 通 气 2 保 持 培 养 箱 内 空 气 干 净 定 期 消 毒 (90,14 h) 3 箱 内 火 菌 蒸 馏 水 3000 毫 升 蒸 馏 水 槽 中 以 保 持 箱 内 湿 度, 避 兔 培 养 液 蒸 发

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25 自 动 双 重 纯 水 蒸 馏 器 纯 水 仪

26 酶 标 仪 微 孔 板 震 荡 器

27 培 养 板

28 培 养 瓶

29 常 用 玻 璃 器 皿 清 洗 浸 泡 ( 自 来 水 ) 刷 洗 ( 洗 衣 粉 ) 酸 泡 (24 小 时 ) 流 水 冲 洗 蒸 溜 水 浸 泡 和 冲 洗 50 烘 干

30 清 洁 液 的 配 制

31 细 胞 培 养 用 液 的 配 制 水 : 新 鲜 配 置 的 三 蒸 水 或 去 离 子 水 平 衡 盐 溶 液 : 无 Ca 2+ Mg 2+ 的 缓 冲 液 PBS:NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na 2 HPO 4.H 2 O 1.56 g KH 2 PO 加 水 至 1000 ml

32 消 化 液 : 胰 蛋 白 酶 作 用 于 与 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 相 连 接 的 肽 健, 除 去 细 胞 间 粘 蛋 白 及 糖 蛋 白, 影 响 细 胞 骨 架, 从 而 使 细 胞 分 离 胰 蛋 白 酶 液 浓 度 越 高, 作 用 越 强, 但 超 过 一 定 限 度 会 损 伤 细 胞 胰 蛋 白 酶 是 一 种 黄 白 色 粉 末, 用 无 Ca2+ Mg2+ 的 PBS 缓 冲 液 配 制 常 用 的 胰 蛋 白 酶 液 浓 度 是 0.25% 用 滤 器 过 滤 除 菌 胰 蛋 白 酶 液 消 化 时 间 :2-10 分 钟 用 含 血 清 培 养 液 终 止 其 对 细 胞 的 消 化 作 用

33 培 养 基 培 养 基 ( 培 养 液 ) 是 维 持 体 外 细 胞 生 存 和 生 长 的 溶 液, 分 天 然 培 养 基 和 合 成 培 养 基 天 然 培 养 基 : 天 然 培 养 基 有 血 清 血 浆 和 组 织 提 取 液 ( 如 鸡 胚 和 牛 胚 浸 液 ) 优 点 : 营 养 成 分 丰 富, 培 养 效 果 好 缺 点 : 来 源 受 限 成 分 复 杂, 影 响 对 某 些 实 验 产 物 的 提 取 和 实 验 结 果 的 分 析 易 发 生 支 原 体 污 染

34 合 成 培 养 基 : 合 成 培 养 基 是 根 据 细 胞 生 存 所 需 物 质 的 种 类 和 数 量, 用 人 工 方 法 模 拟 合 成 的 目 前 已 设 计 出 许 多 种 培 养 基, 如 TC199 MEM RPMI-1640 DMEM 等 合 成 培 养 基 主 要 成 分 是 氨 基 酸 维 生 素 碳 水 化 合 物 无 机 盐 和 其 它 一 些 辅 助 物 质 优 点 : 标 准 化 生 产, 组 分 和 含 量 相 对 固 定 成 本 低 缺 点 : 缺 少 某 些 成 分, 不 能 完 全 满 足 体 外 细 胞 生 长 需 要

35 人 工 合 成 培 养 基 只 能 维 持 细 胞 生 存, 要 想 使 细 胞 生 长 和 繁 殖, 还 需 补 充 一 定 量 的 天 然 培 养 基 ( 如 血 清 )

36 血 清 中 含 有 : 1 多 种 蛋 白 质 ( 白 蛋 白 球 蛋 白 铁 蛋 白 等 ) 2 多 种 金 属 离 子 ; 3 激 素 ; 4 促 贴 附 物 质, 如 纤 粘 蛋 白 冷 析 球 蛋 白 胶 原 等 5 各 种 生 长 因 子 6 转 移 蛋 白 7 不 明 成 分

37 一 般 说 来. 含 5% 小 牛 血 清 的 培 养 基 对 大 多 数 细 胞 可 以 维 持 细 胞 不 死. 但 支 持 细 胞 生 长 一 般 需 加 10% 血 清. 对 于 血 清 支 持 细 因 生 长 的 生 物 学 效 应 已 得 到 证 明, 但 对 血 清 中 的 复 杂 成 分 至 今 尚 未 完 全 清 楚. 血 清 中 不 仅 存 在 促 细 胞 生 长 因 子, 同 对 也 存 在 细 胞 生 长 抑 制 因 子 或 毒 性 因 子, 因 此 在 含 血 清 培 养 基 中 培 养 的 细 胞 所 反 映 的 生 物 学 特 性 是 细 胞 和 复 杂 血 清 因 子 的 综 合 反 应 在 生 长 因 子 蛋 白 质 工 程 基 因 表 达 调 控 等 研 究 领 域, 迫 切 需 要 用 无 血 清 培 养 基 培 养 细 胞.

38 无 血 清 培 养 基 的 主 要 研 制 策 略 : 在 基 础 培 养 基 中 补 充 各 种 必 需 因 子, 如 激 素 生 长 因 子 结 合 蛋 白 贴 壁 和 扩 展 因 子 等 无 血 清 培 养 基 由 基 础 培 养 基 和 替 代 血 清 的 补 充 成 分 组 成 1975 年,Sato 首 次 成 功 地 用 无 血 清 培 养 基 培 养 了 垂 体 细 胞 株, 近 20 多 年 来 已 报 道 了 几 十 种 细 胞 系 在 无 血 清 培 养 基 中 成 功 地 生 长 和 增 殖 无 血 清 细 胞 培 养 基 的 使 用 保 证 了 实 验 结 果 的 准 确 性 可 重 复 性 和 稳 定 性,, 减 少 了 细 胞 污 染, 简 化 了 提 纯 和 鉴 定 各 种 细 胞 产 物 的 程 序

39 向 无 清 培 养 液 中 能 促 进 细 胞 系 生 长 的 补 加 物 都 是 独 特 的 适 用 于 某 种 细 胞 株 的 培 养 液, 很 可 能 不 适 合 另 一 种 细 胞 株 的 生 长 即 使 同 源 组 织 的 不 同 细 胞 株, 所 需 补 加 物 也 不 同 无 血 清 培 养 基 尚 处 于 研 究 阶 段, 难 以 推 广 目 前, 绝 大 多 数 人 工 合 成 培 养 基 使 用 时 还 需 添 加 血 清

40 血 清 质 量 好 坏 是 实 验 成 败 的 关 键 常 用 血 清 有 胎 牛 血 洁 新 生 牛 血 清 小 牛 血 情 兔 血 清 马 血 清 等, 其 中 以 胎 牛 血 清 质 量 最 好 优 质 血 清 的 标 准 : 透 明, 淡 黄 色, 无 沉 淀 物, 无 细 菌 支 原 体 病 毒 污 染 血 清 的 灭 活 ( 消 除 补 体 活 性 ):56,30 分 钟 血 清 的 消 毒 : 过 滤 除 菌

41 抗 菌 素 的 使 用 : 在 培 养 液 配 制 后, 培 养 液 内 常 加 适 量 抗 菌 素, 以 抑 制 可 能 存 在 的 细 菌 的 生 长 通 常 是 青 霉 素 和 链 霉 素 联 合 使 用 培 养 基 内 青 霉 素 链 霉 素 最 终 使 用 浓 度 为 每 毫 升 100 单 位 庆 大 霉 素 : 每 毫 升 100 单 位 方 便 广 谱 稳 定

42 完 全 培 养 基 的 组 成 基 础 培 养 基 80% 一 95% 血 清 5% 一 20% 碳 酸 氢 钠 2.0 g/l 青 链 霉 素 各 100 卑 位 / 毫 升

43 培 养 基 的 配 制 RPMI-1640 培 养 粉 1 袋 碳 酸 氢 钠 2.0 g 青 链 霉 素 各 100 单 位 / 毫 升 加 三 蒸 水 至 1000ml, 过 滤 除 菌 调 节 ph 值 至 7.2 加 血 清 ( 终 浓 度 10%)

44 细 胞 传 代 方 法 根 据 细 胞 生 长 的 恃 点, 传 代 方 法 有 3 种 1. 悬 浮 生 长 细 胞 传 代 离 心 法 传 代 : 离 心 (1000 转 / 分 ) 去 上 清, 沉 淀 物 加 新 培 养 液 后 再 混 匀 传 代 直 接 传 代 法 : 悬 浮 细 胞 沉 淀 在 瓶 壁 时, 将 上 清 培 养 液 去 除 1/2 一 2/3, 然 后 用 吸 管 直 接 吹 打 形 成 细 胞 悬 液 再 传 代 2 半 悬 浮 生 长 细 胞 传 代 (Hela 细 胞 ) 此 类 细 胞 部 分 呈 现 贴 壁 生 长 现 象, 但 贴 壁 不 牢, 可 用 直 接 吹 打 法 使 纫 胞 从 瓶 壁 脱 落 下 来, 进 行 传 代 3 贴 壁 生 长 细 胞 传 代 采 用 酶 消 化 法 传 代 常 用 的 消 化 液 有 0.25% 的 胰 蛋 白 酶 液

45 贴 壁 生 长 细 胞 传 代 方 法 : 1. 吸 光 培 养 瓶 中 的 培 养 液 2. 加 入 1-2 ml 0.25% 的 胰 蛋 白 酶 液 ( 以 消 化 液 能 覆 盖 整 个 瓶 底 为 准 ) 静 置 2-10 min( 显 微 镜 下 动 态 监 测 ) 3. 吸 去 胰 蛋 白 酶 液, 加 入 培 养 液 4. 用 吸 管 吸 取 瓶 内 培 养 液, 反 复 吹 打 瓶 壁 细 胞, 形 成 细 胞 悬 液 5. 吸 取 1/10 1/40 细 胞 悬 液, 接 种 于 新 的 培 养 瓶 内 6. 加 适 量 新 鲜 培 养 液 于 接 种 了 细 胞 悬 液 的 新 培 养 瓶 内 7. 将 后 者 放 入 培 养 箱 中 培 养

46 细 胞 计 数 血 细 胞 计 数 器 : 手 工 计 数 细 胞 Coulter 计 数 仪 : 人 工 计 数

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48 培 养 细 胞 活 力 测 定 细 胞 活 力 测 定 是 肿 瘤 体 外 研 究 中 应 用 最 广 的 技 术 手 段 之 一 任 何 培 养 瓶 内 生 长 的 细 胞 都 由 死 细 胞 和 活 细 胞 组 成, 从 形 态 上 区 别 死 活 细 胞 是 困 难 的 1. 细 胞 克 隆 形 成 率 实 验 : 单 个 细 胞 在 体 外 增 殖 6 代 以 上, 其 后 代 所 组 成 的 细 胞 群 体 形 成 肉 眼 可 见 的 克 隆 克 隆 形 成 卒 用 来 表 示 细 胞 的 增 殖 能 力 克 隆 形 成 率 比 = 克 隆 形 成 数 / 接 种 细 胞 数 缺 点 : 操 作 繁 琐 优 点 : 精 确 可 靠

49 2. 台 盼 蓝 法 活 细 胞 不 被 染 色, 死 细 胞 染 成 蓝 色, 用 活 细 胞 占 细 胞 中 的 百 分 比 表 示 细 胞 恬 力 已 淘 汰

50 3. 四 唑 盐 (MTT) 比 色 法 四 唑 盐 (MTT) 商 品 名 为 噻 唑 蓝, 四 唑 盐 比 色 法 的 原 理 : 活 细 胞 中 脱 氢 酶 能 将 四 唑 盐 还 原 成 不 溶 干 水 的 蓝 紫 色 产 物 (formazan), 并 沉 淀 在 细 胞 中, 而 死 细 胞 没 有 这 种 功 能 二 甲 亚 砜 (DMSO) 能 溶 解 沉 积 在 细 胞 中 蓝 紫 色 结 晶 物, 溶 液 颜 色 深 浅 与 所 含 的 formazan 量 成 正 比 再 用 酶 标 仪 测 定 OD 值 MTT 法 简 单 快 速 准 确, 广 泛 应 用 于 新 药 筛 选 细 胞 毒 牲 试 验 肿 瘤 放 射 敏 感 性 实 验 等

51 操 作 步 骤 (1) 单 细 胞 悬 液 接 种 于 96 孔 培 养 板 ; 细 胞 / 孔, 每 孔 培 养 基 总 量 200 微 升 (96 孔 培 养 板 每 孔 容 积 370 微 升 ),37 5% CO 2 培 养 箱 中 培 养 一 段 时 间 ( 根 据 实 验 目 的 决 定 培 养 时 间 ) (2) 加 入 2 毫 克 / 毫 升 的 MTT 液 (50 微 升 / 孔 ); 继 续 培 养 3 小 时 (3) 吸 出 孔 内 培 养 液 后, 加 入 DMSO 液 (150 微 升 / 孔 ), 将 培 养 板 置 于 微 孔 板 扳 荡 器 上 振 荡 10 分 钟, 使 结 晶 物 溶 解 (4) 酶 标 仪 检 测 各 孔 OD 值 ( 检 测 波 长 570 纳 米 ) 记 录 结 果, 绘 制

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53 细 胞 冻 存 和 复 苏 细 胞 低 温 冷 冻 贮 存 是 细 胞 室 的 常 规 工 作 细 胞 冻 存 与 细 胞 传 代 保 存 相 比 可 以 减 少 入 力 经 费, 减 少 污 染, 减 少 细 胞 生 物 学 特 性 变 化

54 冻 存 和 复 苏 的 原 则 : 慢 冻 快 融 当 细 胞 冷 到 零 度 以 下, 可 以 产 生 以 下 变 化 : 细 胞 器 脱 水, 细 胞 中 可 溶 性 物 质 浓 度 升 高, 并 在 细 胞 内 形 成 冰 晶 如 果 缓 慢 冷 冻, 可 使 细 胞 逐 步 脱 水, 细 胞 内 不 致 产 生 大 的 冰 晶 ; 相 反. 结 晶 就 大, 大 结 晶 会 造 成 细 胞 膜 纲 胞 器 的 损 伤 和 破 裂 复 苏 过 程 应 快 融, 目 的 是 防 止 小 冰 晶 形 成 大 冰 晶, 即 冰 晶 的 重 结 晶

55 慢 冻 程 序 标 准 程 序 : 当 温 度 在 -25 以 上 时, 1~2 /min 当 温 度 达 -25 以 下 时, 5~10 /min 当 温 度 达 -100 时, 可 迅 速 放 入 液 氮 中 细 胞 冻 存 器 简 易 程 序 : 将 冷 冻 管 ( 管 口 要 朝 上 ) 放 入 纱 布 袋 内, 纱 布 袋 系 以 线 绳, 通 过 线 绳 将 纱 布 袋 固 定 于 液 氮 罐 罐 口, 按 每 分 钟 温 度 下 降 1~2 的 速 度, 在 40 分 钟 内 降 至 液 氮 表 面, 停 30 分 钟 后, 直 接 投 人 液 氮 中

56 低 温 保 护 剂 的 应 用 在 细 胞 冻 存 时 加 入 温 保 护 剂, 能 大 大 提 高 冻 存 效 果 常 用 的 低 温 保 护 剂 是 DMSO, 它 是 一 种 渗 透 性 保 护 剂, 可 迅 速 透 入 细 胞, 提 高 胞 膜 对 水 的 通 透 性, 降 低 冰 点, 延 缓 冻 结 过 程, 能 使 细 胞 内 水 分 在 冻 结 前 透 出 细 胞 外, 在 胞 外 形 成 冰 晶, 减 少 胞 内 冰 晶, 从 而 减 少 冰 晶 对 细 胞 的 损 伤

57 细 胞 冻 存 方 法 1 预 先 配 制 冻 存 液 : 含 20% 血 清 培 养 基 10% DMSO 2 取 对 数 生 长 期 细 胞, 经 胰 酶 消 化 后, 加 入 适 量 冻 存 液, 用 吸 管 吹 打 制 成 细 胞 悬 液 ( ~ 细 胞 /ml) 3 加 入 1ml 细 胞 于 冻 存 管 中, 密 封 后 标 记 冷 冻 细 胞 名 称 和 冷 冻 日 期 4 年 后, 存 洁 率 可 达 80% 一 叽 % DMSO 液 用 培 养 液 配 好, 避 免 因 临 时 配 制 产 热 而 伤 害 细 胞 对 人 造 血 干 细 胞 的 研 究 证

58 细 胞 复 苏 方 法 (l) 从 液 氮 中 取 出 冷 冻 管, 迅 速 投 入 37~~38 水 浴 中, 使 其 融 化 (1 分 钟 左 右 ) (2)5 分 钟 内 用 培 养 液 稀 释 至 原 体 积 的 10 倍 以 上 (3) 低 速 离 心 10 分 钟 (4) 去 上 清, 加 新 鲜 培 养 液 培 养 刚 复 苏 的 细 胞

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