青霉素生产使用手册

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1 湖 南 师 范 大 学 化 学 化 工 虚 拟 仿 真 实 验 系 列 青 霉 素 生 产 工 艺 仿 真 实 验 讲 义 湖 南 师 范 大 学 化 学 化 工 学 院 编

2 目 录 1 概 述 工 艺 流 程 简 述 发 酵 工 艺 流 程 菌 种 介 绍 菌 种 的 保 藏 孢 子 的 制 备 种 子 的 制 备 发 酵 培 养 基 配 制 灭 菌 发 酵 提 炼 工 艺 流 程 发 酵 液 预 处 理 提 取 精 制 成 品 鉴 定 成 品 分 装 操 作 规 程 发 酵 工 艺 操 作 规 程 正 常 发 酵 ( 过 程 ) 出 料 发 酵 过 程 中 PH 值 低 发 酵 过 程 中 PH 值 高 发 酵 过 程 中 溶 解 氧 低 残 糖 浓 度 低 发 酵 过 程 中 温 度 高 泡 沫 高 提 炼 工 艺 操 作 规 程 预 处 理 操 作 一 次 BA 萃 取 操 作 一 次 反 萃 取 操 作 二 次 BA 萃 取 操 作 脱 色 罐 操 作 结 晶 罐 及 抽 滤 干 燥 操 作 I

3 1 概 述 青 霉 素 (Benzylpenicillin / Penicillin) 又 被 称 为 青 霉 素 G peillin G 盘 尼 西 林 配 尼 西 林 青 霉 素 钠 苄 青 霉 素 钠 青 霉 素 钾 苄 青 霉 素 钾, 是 第 一 种 能 够 治 疗 人 类 疾 病 的 抗 生 素, 它 的 研 制 成 功 大 大 增 强 了 人 类 抵 抗 细 菌 性 感 染 的 能 力, 带 动 了 抗 生 素 家 族 的 诞 生 青 霉 素 的 生 产 可 分 为 天 然 青 霉 素 的 生 产 和 半 合 成 青 霉 素 的 生 产, 两 者 的 生 产 工 艺 完 全 不 同 本 实 验 是 针 对 天 然 青 霉 素 生 产 工 艺 进 行 仿 真, 该 工 艺 包 含 发 酵 工 艺 和 提 炼 工 艺 两 部 分 工 艺 流 程 图 1 天 然 青 霉 素 生 产 工 艺 流 程 图 1

4 2 工 艺 流 程 简 述 2.1 发 酵 工 艺 流 程 菌 种 介 绍 青 霉 是 产 生 青 霉 素 的 重 要 菌 种 广 泛 分 布 于 空 气 土 壤 和 各 种 物 上, 常 生 长 在 腐 烂 的 柑 桔 皮 上 呈 青 绿 色 目 前 已 发 现 几 百 种, 其 中 产 黄 青 霉 (Penicillum chrysogenum) 点 青 霉 (Penicillum nototum) 等 都 能 大 量 产 生 青 霉 素 青 霉 素 的 发 现 和 大 规 模 地 生 产 应 用, 不 仅 对 抗 生 素 工 业 的 发 展 起 了 巨 大 的 推 动 作 用, 而 且 加 上 其 他 抗 生 素 的 广 泛 使 用, 比 如 像 磺 胺 药 物, 使 人 类 的 平 均 寿 命, 再 次 延 长 了 四 岁 此 外, 有 的 青 霉 菌 还 用 于 生 产 灰 黄 霉 素 及 磷 酸 二 酯 酶 纤 维 素 酶 等 酶 制 剂 和 有 机 酸 1981 年 报 导, 疠 孢 青 霉 是 纤 维 素 酶 的 新 来 源, 它 能 分 解 棉 花 纤 维 菌 种 的 保 藏 图 2 菌 种 介 绍 界 面 菌 种 的 保 藏 方 法 有 : 斜 面 菌 种 低 温 保 藏 法 砂 土 管 保 藏 法 2

5 甘 油 封 藏 法 真 空 冷 冻 干 燥 法 斜 面 菌 种 低 温 保 藏 法 利 用 低 温 对 微 生 物 生 命 活 动 有 抑 制 作 用 的 原 理 进 行 保 藏 把 斜 面 菌 种 固 体 穿 刺 培 养 物 或 菌 悬 液 等, 直 接 放 入 4~5 冰 箱 中 保 藏 时 间 一 般 不 超 过 3 个 月, 到 时 必 须 进 行 移 接 传 代, 再 放 回 冰 箱 砂 土 管 保 藏 法 将 干 燥 砂 粒 与 细 土 混 合 后 灭 菌 制 成 砂 土 管, 然 后 接 种 保 藏 若 把 砂 土 管 放 在 低 温 或 抽 气 后 密 封, 效 果 更 佳 此 法 适 用 于 产 孢 子 及 芽 孢 菌 种 的 保 藏 保 藏 期 1~10 年 甘 油 封 藏 法 向 培 养 好 的 菌 种 斜 面 上, 加 入 灭 菌 甘 油, 高 出 斜 面 1cm, 然 后 蜡 封 管 口, 放 入 冰 箱 该 法 既 可 防 止 培 养 基 水 分 蒸 发, 又 能 使 菌 种 与 空 气 隔 绝 保 藏 期 1~2 年 真 空 冷 冻 干 燥 法 目 前 比 较 理 想 的 一 种 方 法 在 低 于 -15 下, 快 速 将 细 胞 冻 结, 并 保 持 细 胞 完 整, 然 后 在 真 空 中 使 水 分 升 华 致 干 在 此 环 境 中, 微 生 物 的 生 长 和 代 谢 都 暂 时 停 止, 不 易 发 生 变 异, 故 可 长 时 间 保 存, 一 般 为 5~10 年, 最 多 可 达 15 年 之 久 此 法 兼 备 了 低 温 干 燥 及 缺 氧 几 方 面 条 件, 使 微 生 物 可 以 保 存 较 长 时 间, 但 过 程 较 麻 烦, 需 要 一 定 的 设 备 孢 子 的 制 备 这 是 发 酵 工 序 的 开 端, 是 一 个 重 要 环 节 抗 生 素 产 量 和 成 品 质 量 同 菌 种 性 能 以 及 同 孢 子 和 种 子 的 情 况 有 密 切 关 系 生 产 用 的 孢 子 需 经 过 纯 种 和 生 产 能 力 的 检 验, 符 合 规 定 的 才 能 用 来 制 备 种 3

6 子 保 藏 在 砂 土 管 或 冷 冻 干 燥 管 仲 的 菌 种 经 无 菌 手 续 接 入 适 合 于 孢 子 发 芽 或 菌 丝 生 长 的 斜 面 培 养 基 中, 经 培 养 成 熟 后 挑 选 菌 落 正 常 的 孢 子 可 再 一 次 接 入 试 管 斜 面 对 于 产 孢 子 能 力 强 的 及 孢 子 发 芽 生 长 繁 殖 快 的 菌 种 可 以 采 用 固 体 培 养 基 孢 子, 孢 子 可 直 接 作 为 种 子 罐 的 种 子 图 3 孢 子 制 备 介 绍 界 面 种 子 的 制 备 种 子 制 备 是 指 孢 子 接 入 种 子 罐 后, 在 罐 中 繁 殖 成 大 量 菌 丝 的 过 程, 其 目 的 是 使 孢 子 发 芽 繁 殖 和 获 得 足 够 数 量 的 菌 丝, 以 便 接 种 到 发 酵 罐 当 中 去 种 子 制 备 所 使 用 的 培 养 基 及 其 它 工 艺 条 件, 都 要 有 利 于 孢 子 发 芽 和 菌 丝 繁 殖 种 子 罐 级 数 是 在 指 制 备 种 子 需 逐 级 扩 大 培 养 的 次 数, 一 般 根 据 种 子 的 生 长 特 性 孢 子 发 芽 及 菌 体 繁 殖 速 度, 以 及 发 酵 罐 的 容 积 而 定 青 霉 素 种 子 制 备 一 般 为 二 级 种 子 罐 扩 大 培 养 4

7 图 4 种 子 制 备 介 绍 界 面 发 酵 培 养 基 配 制 培 养 基 是 供 微 生 物 生 长 繁 殖 和 合 成 各 种 代 谢 产 物 所 需 要 的 按 一 定 比 例 配 制 的 多 种 营 养 物 质 的 混 合 物 培 养 基 的 组 成 和 比 例 是 否 恰 当, 直 接 影 响 微 生 物 的 生 长 生 产 和 工 艺 选 择 产 品 质 量 和 产 量 等 青 霉 素 的 发 酵 培 养 基 由 碳 源 氮 源 无 机 盐 及 金 属 离 子 添 加 前 体 消 沫 剂 五 部 分 组 成 图 5 发 酵 培 养 基 介 绍 界 面 5

8 碳 源 碳 源 的 主 要 作 用 是 为 微 生 物 菌 种 的 生 长 繁 殖 提 供 能 源 和 合 成 菌 体 所 必 需 的 碳 成 分, 为 合 成 目 的 产 物 提 供 所 需 的 碳 成 分 青 霉 素 发 酵 中 常 用 乳 酸 或 葡 萄 糖, 也 可 采 用 葡 萄 糖 母 液 糖 蜜 等 其 中 乳 糖 最 为 便 宜, 但 因 货 源 较 少, 很 多 国 家 采 用 葡 萄 糖 代 替 但 当 葡 萄 糖 浓 度 超 过 一 定 限 度 时, 会 过 分 加 速 菌 体 的 呼 吸, 以 至 培 养 基 中 的 溶 解 氧 不 能 满 足 需 要, 使 一 些 中 间 代 谢 物 不 能 完 全 氧 化 而 积 累 在 菌 体 或 培 养 基 中, 导 致 ph 下 降, 影 响 某 些 酶 的 活 性, 从 而 抑 制 微 生 物 的 生 长 和 产 物 的 合 成 氮 源 氮 源 的 作 用 是 供 应 菌 体 合 成 氨 基 酸 和 三 肽 的 原 料, 以 进 一 步 合 成 青 霉 素 主 要 有 机 氮 源 为 玉 米 浆 棉 籽 饼 粉 花 生 饼 粉 酵 母 粉 蛋 白 胨 等 玉 米 浆 为 较 理 想 的 氮 源, 含 固 体 量 少, 有 利 于 通 气 及 氧 的 传 递, 因 而 利 用 率 较 高 固 体 有 机 氮 源 原 料 一 般 需 粉 碎 至 200 目 以 下 的 细 度 有 机 氮 源 还 可 以 提 供 一 部 分 有 机 磷, 供 菌 体 生 长 无 机 氮 如 硝 酸 盐 尿 素 硫 酸 铵 等 可 适 量 使 用 无 机 盐 及 金 属 离 子 碳 酸 钙 用 来 中 和 发 酵 过 程 中 产 生 的 杂 酸, 并 控 制 发 酵 液 的 ph 值, 为 菌 体 提 供 营 养 的 无 机 磷 源 一 般 采 用 磷 酸 二 氢 钾 另 外 加 入 硫 代 硫 酸 钠 或 硫 酸 钠 以 提 供 青 霉 素 分 子 中 所 需 的 硫 由 于 现 在 还 有 一 些 工 厂 采 用 铁 罐 发 酵, 在 发 酵 过 程 中 铁 离 子 便 逐 渐 进 入 发 酵 液 发 酵 时 间 愈 长, 则 铁 离 子 愈 多 铁 离 子 在 50µg/ml 以 上 便 会 影 响 青 霉 素 的 合 成 采 用 铁 络 合 剂 以 抑 制 铁 离 子 的 影 响, 但 实 际 对 青 霉 素 产 量 并 无 改 进 所 以 青 霉 素 的 发 酵 罐 采 用 不 锈 钢 制 造 为 宜, 其 他 重 金 属 离 子 如 铜 汞 锌 等 能 催 化 青 6

9 霉 素 的 分 解 反 应 前 体 添 加 苯 乙 酸 或 者 苯 乙 酰 胺, 可 以 借 酰 基 转 移 的 作 用, 将 苯 乙 酸 转 入 青 霉 素 分 子, 提 高 青 霉 素 G 的 生 产 强 度, 添 加 苯 氧 乙 酸 则 产 生 青 霉 素 V 因 此 前 体 的 加 入 成 为 青 霉 素 发 酵 的 关 键 问 题 之 一 但 苯 乙 酸 对 发 酵 有 影 响, 一 般 以 苯 乙 酰 胺 较 好 也 有 人 采 用 苯 乙 酸 月 桂 醇 酯, 其 优 点 是 在 发 酵 中 月 桂 醇 酯 水 解, 苯 乙 酸 结 合 进 青 霉 素 成 品 而 月 桂 酸 作 为 细 菌 营 养 剂 及 发 酵 液 消 沫 剂, 且 其 毒 性 比 苯 乙 酸 小, 但 价 格 较 贵 前 体 要 在 发 酵 开 始 20 小 时 后 加 入, 并 在 整 个 发 酵 过 程 中 控 制 在 50µg/ml 左 右 消 泡 剂 由 于 在 发 酵 过 程 中 二 氧 化 碳 的 不 断 产 生, 加 上 培 养 基 中 有 很 多 有 机 氮 源 含 有 蛋 白 质, 因 此 在 发 酵 罐 内 会 产 生 大 量 泡 沫, 如 不 严 加 控 制, 就 会 产 生 发 酵 液 逃 液, 导 致 染 菌 的 后 果 虽 然 植 物 油 一 方 面 可 作 为 消 沫 剂, 另 一 方 面 还 可 以 起 到 碳 源 作 用, 但 现 在 已 普 遍 采 用 合 成 消 沫 剂 ( 如 聚 酯 聚 醇 类 消 沫 剂 ) 代 替 豆 油 灭 菌 灭 菌 指 的 是 用 化 学 或 物 理 的 方 法 杀 灭 或 除 去 物 料 及 设 备 中 所 有 的 有 生 命 物 质 的 技 术 或 工 艺 流 程 灭 菌 实 质 上 可 分 杀 菌 和 溶 菌 两 种, 前 者 指 菌 体 虽 死, 但 形 体 尚 存, 后 者 则 指 菌 体 杀 死 后, 其 细 胞 发 生 溶 化 消 失 的 现 象 工 业 上 常 用 的 方 法 有 : 干 热 灭 菌 湿 热 灭 菌 化 学 药 剂 灭 菌 射 线 灭 菌 和 介 质 过 滤 除 菌 等 几 种 在 青 霉 素 的 生 产 中, 对 培 养 基 和 发 酵 罐 主 要 采 用 的 是 湿 热 蒸 汽 灭 菌 和 空 气 过 滤 除 菌 的 方 法 7

10 图 6 灭 菌 介 绍 界 面 发 酵 这 一 过 程 的 目 的 主 要 是 为 了 使 微 生 物 分 泌 大 量 的 抗 生 素 发 酵 开 始 前, 有 关 设 备 和 培 养 基 必 须 先 经 过 灭 菌, 后 接 入 种 子 接 种 量 一 般 为 5%~20% 发 酵 周 期 一 般 为 4~5 天, 但 也 有 少 于 24 小 时, 或 长 达 二 周 以 上 的 在 整 个 过 程 中, 需 要 不 断 通 气 和 搅 拌, 维 持 一 定 的 罐 温 和 罐 压, 并 隔 一 段 时 间 取 样 进 行 生 化 分 析 和 无 菌 试 验, 观 察 代 谢 变 化 抗 生 素 产 生 情 况 和 有 无 杂 菌 污 染 图 7 青 霉 素 发 酵 工 艺 流 程 图 8

11 图 8 发 酵 罐 操 作 界 面 发 酵 的 过 程 控 制 1 碳 源 控 制 : 青 霉 菌 能 利 用 多 种 碳 源, 如 乳 糖 蔗 糖 葡 萄 糖 阿 拉 伯 糖 甘 露 糖 淀 粉 和 天 然 油 脂 等 乳 糖 是 青 霉 素 生 物 合 成 的 最 好 碳 源, 葡 萄 糖 也 是 比 较 好 的 碳 源, 但 必 须 控 制 其 加 入 的 浓 度, 因 为 葡 萄 糖 易 被 菌 体 氧 化 并 产 生 抑 制 抗 生 素 合 成 酶 形 成 的 物 质, 从 而 影 响 青 霉 素 的 合 成, 所 以 可 以 采 用 连 续 添 加 葡 萄 糖 的 方 法 代 替 乳 糖 苯 乙 酸 或 其 衍 生 物 苯 乙 酰 胺 苯 乙 胺 苯 乙 酰 甘 氨 酸 等 均 可 作 为 青 霉 素 G 的 侧 链 前 体 菌 体 对 前 体 的 利 用 有 两 个 途 径 : 直 接 结 合 到 产 物 分 子 中 或 作 为 养 料 和 能 源 利 用, 即 氧 化 为 二 氧 化 碳 和 水 前 体 究 竟 通 过 哪 个 途 径 被 菌 体 利 用, 主 要 取 决 于 培 养 条 件 以 及 所 用 菌 种 的 特 性 通 过 比 较 苯 乙 酰 胺 苯 乙 酸 及 苯 氧 基 乙 酸 的 毒 性, 除 苯 氧 基 乙 酸 外, 苯 乙 酰 胺 和 苯 乙 酸 的 毒 性 取 决 于 培 养 基 的 ph 和 前 体 的 浓 度 碱 性 时, 苯 乙 酰 胺 有 毒 ; 酸 性 时, 苯 乙 酸 毒 性 较 大 ; 中 性 时, 苯 乙 酰 胺 的 毒 性 大 于 苯 乙 酸 前 体 用 量 大 于 0.1% 时, 青 霉 素 9

12 的 生 物 合 成 均 下 降 所 以 一 般 发 酵 液 中 前 体 浓 度 以 始 终 维 持 在 0.1% 为 宜 在 碱 性 条 件 下, 苯 乙 酸 被 菌 体 氧 化 的 速 率 随 培 养 基 ph 上 升 而 增 加 年 幼 的 菌 丝 不 氧 化 前 体, 而 仅 利 用 它 来 构 成 青 霉 素 分 子 随 着 菌 龄 的 增 大, 氧 化 能 力 逐 渐 增 加 培 养 基 成 分 对 前 体 的 氧 化 程 度 有 较 大 影 响, 合 成 培 养 基 比 复 合 培 养 基 对 前 体 的 氧 化 量 少 为 了 尽 量 减 少 苯 乙 酸 的 氧 化, 生 产 上 多 用 间 歇 或 连 续 添 加 低 浓 度 苯 乙 酸 的 方 法, 以 保 持 前 体 的 供 应 速 率 略 大 于 生 物 合 成 的 需 要 2 ph 控 制 : 在 青 霉 素 发 酵 过 程 中,pH 是 通 过 下 列 手 段 控 制 的 : 如 ph 过 高, 则 添 加 糖 硫 酸 或 无 机 氮 源 ; 若 ph 过 低, 则 加 入 碳 酸 钙 氢 氧 化 钠 氨 或 尿 素, 也 可 提 高 通 气 量 另 外, 也 可 利 用 自 动 加 入 酸 或 碱 的 方 法, 使 发 酵 液 ph 维 持 在 6.8~7.2, 以 提 高 青 霉 素 产 量 3 温 度 控 制 : 青 霉 菌 生 长 的 适 宜 温 度 为 30, 而 分 泌 青 霉 素 的 适 宜 温 度 是 20 左 右, 因 此 生 产 上 采 用 变 温 控 制 的 方 法, 使 之 适 合 不 同 阶 段 的 需 要 一 般 一 级 种 子 的 培 养 温 度 控 制 在 27± 1 左 右 ; 二 级 种 子 的 培 养 温 度 控 制 在 25±1 左 右 ; 发 酵 前 期 和 中 期 的 温 度 控 制 在 26 左 右 ; 发 酵 后 期 的 温 度 控 制 在 24 左 右 4 补 料 控 制 : 发 酵 过 程 中 除 中 间 补 糖 控 制 糖 浓 度 及 ph 外, 补 加 氮 源 也 可 提 高 发 酵 单 位 经 试 验 证 实 : 若 在 发 酵 60~70 小 时 开 始 分 次 补 加 硫 酸 铵, 则 在 90 小 时 后 菌 丝 含 氮 量 几 乎 不 下 降, 维 持 在 6%~7%,, 且 60%~70% 的 菌 丝 处 于 年 幼 阶 段, 菌 丝 呼 吸 强 度 维 持 在 二 氧 化 碳 量 近 30μl/(mg 菌 丝 h), 抗 生 素 产 率 为 最 高 水 平 的 30%~40%; 而 不 加 硫 酸 铵 的 对 照 罐, 在 发 酵 中 期 菌 丝 含 氮 量 为 7%, 以 后 逐 级 下 降 至 发 酵 结 束 时 为 4% 发 酵 结 束 时 呼 10

13 吸 强 度 降 至 二 氧 化 碳 量 为 16μl/(mg 菌 丝 h), 且 抗 生 素 产 量 下 降 至 零, 总 产 量 仅 为 试 验 罐 的 1/2 因 此, 为 了 延 长 发 酵 周 期, 提 高 青 霉 素 产 量, 发 酵 过 程 分 次 补 加 氮 源 也 是 有 效 的 措 施 5 铁 离 子 的 影 响 : 三 价 铁 离 子 对 青 霉 素 生 物 合 成 有 显 著 影 响, 一 般 若 发 酵 液 中 铁 离 子 含 量 超 过 30~40μg/ml, 则 发 酵 单 位 增 长 缓 慢 因 此 铁 罐 在 使 用 前 必 须 进 行 处 理, 可 在 罐 壁 涂 上 环 氧 树 脂 等 保 护 层, 使 铁 离 子 含 量 控 制 在 30μg/ml 以 下 防 止 染 菌 的 要 点 染 菌 是 抗 生 素 发 酵 的 大 敌, 不 制 服 染 菌 就 不 能 实 现 优 质 高 产 造 成 染 菌 的 因 素 很 多, 如 : 菌 种 培 养 过 程 操 作 不 当 培 养 基 灭 菌 不 彻 底 发 酵 设 备 ( 如 发 酵 罐 管 道 ) 密 封 不 严 空 气 除 菌 不 净 等, 但 只 要 认 真 对 待, 过 细 地 工 作, 染 菌 是 可 以 防 止 的 1 种 子 带 菌 的 防 止 : 培 养 基 及 其 用 具 灭 菌 要 彻 底, 防 止 假 压 ; 菌 种 转 接 过 程 应 严 格 按 程 序 操 作, 并 加 强 该 过 程 的 管 理 ; 防 止 菌 种 在 培 养 或 保 存 过 程 中 受 污 染 2 培 养 基 和 设 备 灭 菌 不 彻 底 导 致 的 染 菌 及 其 防 止 : 淀 粉 质 原 料, 升 温 过 快 或 混 合 不 均 匀, 易 结 块, 团 块 中 包 埋 的 活 菌 不 易 杀 灭, 可 在 升 温 前 搅 拌 和 加 淀 粉 酶 防 止 ; 实 罐 灭 菌 时 未 充 分 排 除 罐 内 空 气, 造 成 假 压, 所 以 升 温 时 应 打 开 排 气 等 阀 门 放 气 3 无 菌 空 气 带 菌 及 其 防 止 : 防 止 空 气 带 菌 主 要 是 提 高 空 压 机 进 口 空 气 的 洁 净 度, 防 止 空 气 夹 带 油 和 水 及 空 气 过 滤 器 失 效 提 高 空 压 机 进 口 空 气 的 洁 净 度, 可 以 从 提 高 吸 气 口 的 位 置 及 加 强 空 气 的 压 缩 前 过 滤 着 手 防 止 空 气 夹 带 油 水, 除 加 强 去 除 油 水 的 措 施 外, 还 必 须 防 止 空 气 冷 却 器 漏 水, 注 意 勿 使 冷 却 水 压 力 大 于 空 气 压 力, 防 止 冷 却 水 进 入 空 气 系 统 11

14 蒸 汽 系 统 的 要 求 重 视 饱 和 蒸 汽 的 质 量, 要 严 防 蒸 汽 中 夹 带 大 量 冷 凝 水, 防 止 蒸 汽 压 力 大 幅 度 波 动, 保 证 生 产 时 所 用 的 蒸 汽 压 力 在 30~35 千 帕 以 上 1 连 续 灭 菌 设 备 : 连 消 塔 结 构 要 求 简 单, 易 于 拆 装 和 清 理, 操 作 时 蒸 汽 能 与 物 料 混 合 均 匀, 并 易 于 控 制 温 度 2 发 酵 罐 : 发 酵 罐 及 其 附 属 设 备 应 注 意 严 密 和 防 止 泄 漏, 避 免 形 成 死 角 凡 与 物 料 空 气 下 水 道 连 接 的 阀 门 都 必 须 保 证 严 密 度 3 无 菌 室 : 用 超 净 工 作 台 及 净 化 室 代 替 无 菌 室, 以 提 高 无 菌 程 度 2.2 提 炼 工 艺 流 程 发 酵 液 预 处 理 发 酵 液 中 的 杂 质 如 高 价 无 机 离 子 (Fe 2+ Ca 2+ Mg 2+ ) 和 蛋 白 质 在 离 子 交 换 的 过 程 中 对 提 炼 影 响 甚 大, 不 利 于 树 脂 对 抗 生 素 的 吸 收 如 用 溶 媒 萃 取 法 提 炼 时, 蛋 白 质 的 存 在 会 产 生 乳 化, 使 溶 媒 合 水 相 分 离 困 难 对 高 价 离 子 的 去 除, 可 采 用 草 酸 或 磷 酸 如 加 草 酸 则 它 与 钙 离 子 生 成 的 草 酸 钙 还 能 促 使 蛋 白 质 凝 固 以 提 高 发 酵 滤 液 的 质 量 如 加 磷 酸 ( 或 磷 酸 盐 ), 既 能 降 低 钙 离 子 浓 度, 也 利 于 去 除 镁 离 子 Na 5 P 3 O 10 + Mg 2+ ====MgNa 3 P 3 O Na + 加 黄 血 盐 及 硫 酸 锌, 则 前 者 有 利 于 去 除 铁 离 子, 后 者 有 利 于 凝 固 蛋 白 质 此 外, 两 者 还 有 协 同 作 用, 他 们 所 产 生 的 复 盐 对 蛋 白 质 有 吸 附 作 用 2K 4 Fe(CN) 6 + 3ZnSO 4 K 2 Zn[Fe(CN) 6 ] 2 + 2Na + 12

15 为 了 有 效 的 去 除 发 酵 液 中 的 蛋 白 质, 需 加 入 絮 凝 剂 絮 凝 剂 是 一 种 能 溶 于 水 的 高 分 子 化 合 物 含 有 很 多 离 子 化 基 团 ( 如 NH 2, COOH, OH) 图 9 发 酵 液 预 处 理 和 过 滤 操 作 界 面 提 取 化 学 提 取 和 精 制 的 目 的 : 从 发 酵 液 中 制 取 高 纯 度 的 合 乎 药 典 的 抗 生 素 成 品 由 于 发 酵 液 中 青 霉 素 浓 度 很 低, 仅 0.1%~4.5% 左 右, 而 杂 质 浓 度 比 青 霉 素 的 高 几 十 倍 甚 至 几 千 倍, 并 且 某 些 杂 质 的 性 质 与 抗 生 素 的 非 常 相 近, 因 此 提 取 精 制 是 一 件 十 分 重 要 的 工 作 发 酵 液 中 常 见 的 杂 质 有 : 菌 丝 未 用 完 的 培 养 基 易 污 染 杂 菌 产 生 菌 的 代 谢 产 物 预 处 理 需 要 加 入 的 杂 质 等 在 提 炼 过 程 中 要 遵 循 下 面 四 个 原 则 : 1 时 间 短 2 温 度 低 3 ph 适 中 4 勤 清 洗 消 毒 13

16 常 用 的 提 取 方 法 有 溶 媒 萃 取 法 离 子 交 换 法 和 沉 淀 法 等 1 溶 媒 萃 取 法 这 是 利 用 抗 生 素 在 不 同 的 ph 值 条 件 下 以 不 同 的 化 学 状 态 ( 游 离 态 碱 或 盐 ) 存 在 时, 在 水 及 水 互 不 相 溶 的 溶 媒 中 溶 解 度 不 同 的 特 性, 使 抗 生 素 从 一 种 液 相 ( 如 发 酵 滤 液 ) 转 移 到 另 一 种 液 相 ( 如 有 机 溶 媒 ) 中 去, 以 达 到 浓 缩 和 提 纯 的 目 的 利 用 此 原 理 就 可 借 助 于 调 节 ph 值 的 方 法 使 抗 生 素 从 一 个 液 相 中 被 提 取 到 另 一 液 相 中 去 所 选 用 的 溶 媒 与 水 应 是 互 不 相 溶 或 仅 很 小 部 分 互 溶, 同 时 所 选 溶 媒 在 一 定 的 ph 值 下 对 于 抗 生 素 应 有 较 大 的 溶 解 度 和 选 择 性, 方 能 用 较 少 量 的 溶 媒 使 提 取 完 全, 并 在 一 定 程 度 上 分 离 掉 杂 质 2 离 子 交 换 法 利 用 离 子 交 换 树 脂 和 抗 生 素 之 间 的 化 学 亲 和 力, 有 选 择 性 的 将 抗 生 素 吸 附 上 去, 然 后 以 较 少 量 的 洗 脱 剂 将 它 洗 下 来 3 沉 淀 法 一 种 分 离 抗 生 素 简 单 而 经 济 的 方 法, 浓 缩 倍 数 高, 因 而 也 是 很 有 效 的 方 法 青 霉 素 的 提 取 采 用 溶 媒 萃 取 法 青 霉 素 游 离 酸 易 溶 于 有 机 溶 剂, 而 青 霉 素 盐 易 溶 于 水 利 用 这 一 性 质, 在 酸 性 条 件 下 青 霉 素 转 入 有 机 溶 媒 中, 调 节 ph, 再 转 入 中 性 水 相, 反 复 几 次 萃 取, 即 可 提 纯 浓 缩 选 择 对 青 霉 素 分 配 系 数 高 的 有 机 溶 剂 工 业 上 通 常 用 醋 酸 丁 酯 (BA) 和 戊 酯 萃 取 2~3 次 从 发 酵 液 萃 取 到 乙 酸 丁 酯 时,pH 选 择 2.8~3.0, 从 乙 酸 丁 酯 反 萃 到 水 相 时,pH 选 择 6.8~7.2 为 了 避 免 ph 波 动, 采 用 硫 酸 盐 碳 酸 盐 缓 冲 液 进 行 反 萃 所 得 滤 液 多 采 用 二 次 萃 取, 用 10% 硫 酸 调 ph2.8~3.0, 加 入 醋 酸 丁 酯 在 一 次 丁 酯 萃 取 时, 由 于 滤 液 含 有 大 量 蛋 白, 通 常 加 14

17 入 破 乳 剂 防 止 乳 化 第 一 次 萃 取 时 存 在 蛋 白 质, 加 0.05%~0.1% 乳 化 剂 PPB 图 10 青 霉 素 提 取 工 艺 流 程 图 图 11 一 次 BA 提 取 工 序 界 面 精 制 这 是 青 霉 素 生 产 的 最 后 工 序 对 产 品 进 行 精 制 烘 干 和 包 装 的 阶 段 要 符 合 药 品 生 产 管 理 规 范 的 规 定 15

18 图 12 青 霉 素 精 制 工 艺 流 程 图 脱 色 和 去 热 原 质 脱 色 和 去 热 原 质 是 精 制 注 射 用 青 霉 素 中 不 可 缺 少 的 一 步 色 素 是 在 发 酵 过 程 中 所 产 生 的 代 谢 产 物, 它 与 菌 种 和 发 酵 条 件 有 关 热 原 质 是 在 生 产 过 程 中 由 于 被 污 染 后 杂 菌 所 产 生 的 一 种 内 毒 素 生 产 中 一 般 用 活 性 炭 脱 色 去 热 原 质, 但 需 注 意 脱 色 时 ph 温 度 活 性 炭 用 量 及 脱 色 时 间 等 因 素, 还 应 考 虑 它 对 抗 生 素 的 吸 附 问 题, 否 则 影 响 收 率 图 13 脱 色 工 序 界 面 16

19 结 晶 抗 生 素 精 制 常 用 结 晶 法 来 制 得 高 纯 度 成 品 常 用 的 几 种 结 晶 方 法 有 : 1 改 变 温 度 结 晶 利 用 抗 生 素 在 溶 剂 中 的 溶 解 度 随 温 度 变 化 而 显 著 变 化 的 这 一 特 性 来 进 行 结 晶 2 利 用 等 电 点 结 晶 当 将 某 一 抗 生 素 溶 液 的 ph 调 到 等 电 点 时, 它 在 水 溶 液 中 溶 解 度 最 小, 则 沉 淀 析 出 3 加 成 盐 剂 结 晶 在 抗 生 素 溶 液 中 加 成 盐 剂 使 抗 生 素 以 盐 的 形 式 从 溶 液 中 能 够 沉 淀 结 晶 图 14 结 晶 抽 滤 及 干 燥 工 序 界 面 青 霉 素 钠 盐 在 醋 酸 丁 酯 中 溶 解 度 很 小, 利 用 此 性 质, 再 二 次 醋 酸 丁 酯 萃 取 液 中 加 入 醋 酸 钠 乙 醇 溶 液, 并 控 制 温 度 青 霉 素 钠 盐 就 结 晶 析 出 反 应 如 下 : 醋 酸 丁 酯 中 含 水 量 过 高 会 影 响 收 率, 但 可 提 高 晶 体 纯 度 水 17

20 分 在 0.9% 以 下 对 收 率 影 响 较 小, 得 到 的 晶 体 要 求 颗 粒 均 匀, 有 一 定 的 细 度, 颗 粒 太 细 会 使 过 滤 洗 涤 困 难 晶 体 经 丁 醇 洗 涤, 真 空 干 燥 即 可 等 到 成 品 成 品 鉴 定 成 品 鉴 定 是 根 据 药 典 的 要 求 逐 项 进 行 分 析, 包 括 效 价 鉴 定 毒 性 试 验 无 菌 检 查 热 源 质 试 验 水 分 测 定 水 溶 液 酸 碱 度 及 混 浊 度 测 定 结 晶 颗 粒 的 色 泽 及 大 小 的 测 定 等 对 于 药 典 上 未 有 规 定 的 新 抗 生 素, 则 可 参 照 相 近 抗 生 素, 按 经 验 规 定 一 些 指 标 酸 碱 度 检 测 取 本 品, 加 水 制 成 每 1ml 中 含 30mg 的 溶 液, 测 定 ph 值 应 为 5.0 ~ 溶 液 的 澄 清 度 与 颜 色 取 样 品 0.3g, 加 水 5ml 使 溶 解, 溶 液 应 澄 清 无 色 ; 如 显 浑 浊, 与 浊 度 标 准 液 比 较, 均 不 得 更 浓 ; 如 显 色, 与 黄 色 或 黄 绿 色 标 准 比 色 液 比 较, 均 不 得 更 深 吸 光 度 取 样 品, 加 水 制 成 每 1ml 中 含 1.80mg 的 溶 液, 在 280nm 的 波 长 处 测 定 吸 光 度, 不 得 大 于 0.10; 在 264nm 的 波 长 处 有 最 大 吸 收, 吸 光 度 应 为 0.80~ 细 菌 内 毒 素 取 样 品 测 定, 每 100 青 霉 素 单 位 中 含 内 毒 素 的 量 应 小 于 0.01EU 无 菌 取 样 品, 用 青 霉 素 酶 法 灭 活 后 或 用 适 宜 溶 剂 溶 解 后, 转 移 至 不 少 于 500ml 的 0.9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液 中, 用 薄 膜 过 滤 法 处 理 后 测 定 18

21 效 价 测 定 取 本 品 适 量, 精 密 称 定, 加 水 溶 液 并 定 量 稀 释 制 成 每 1ml 中 约 含 0.5mg 的 溶 液, 摇 匀, 精 密 量 取 10μl, 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 ; 另 取 青 霉 素 对 照 品 适 量, 同 法 测 定 按 外 标 以 峰 面 积 计 算, 其 结 果 乘 以 , 即 为 本 品 效 价 每 1mg 相 当 于 1670 青 霉 素 单 位 图 15 成 品 鉴 定 界 面 成 品 分 装 抗 生 素 产 品 一 般 分 装 为 大 包 装 的 原 料 药, 以 供 制 剂 厂 进 行 小 包 装 或 制 剂 加 工 也 有 一 些 抗 生 素 工 厂 在 无 菌 条 件 下 用 自 动 分 装 机 进 行 小 瓶 分 装 19

22 图 16 成 品 包 装 生 产 线 界 面 20

23 3 操 作 规 程 3.1 发 酵 工 艺 操 作 规 程 正 常 发 酵 ( 过 程 ) 1 进 料 ( 基 质 ), 开 备 料 泵 2 开 备 料 阀 VD1 3 备 料 后 ( 罐 重 kg) 关 备 料 阀 VD1 4 关 备 料 泵 5 开 搅 拌 器 6 设 置 搅 拌 转 速 为 200 转 7 开 通 风 阀 V02 8 开 排 气 阀 V09 9 投 加 菌 种 10 补 糖, 开 补 糖 阀 V01 11 补 氮, 开 加 硫 铵 阀 V10 12 开 冷 却 水 V07, 维 持 温 度 在 PH 值 保 持 在 一 定 范 围 内 14 前 体 超 过 1kg/m 3 ( 扣 分 步 骤, 出 现 则 扣 分 ) 出 料 1 停 止 进 空 气 2 停 搅 拌 3 关 闭 所 有 进 料, 开 阀 出 料 发 酵 过 程 中 PH 值 低 调 节 PH 值 开 大 氨 水 流 量 21

24 PH 值 指 标 发 酵 过 程 中 PH 值 高 关 闭 进 氨 水 开 大 补 糖 阀 调 节 PH 值 发 酵 过 程 中 溶 解 氧 低 开 大 进 空 气 阀 V02 调 节 溶 解 氧 大 于 30% 残 糖 浓 度 低 开 加 糖 阀 补 糖 发 酵 过 程 中 温 度 高 开 通 冷 却 水 进 水 冷 却 温 度 指 标 泡 沫 高 添 加 消 泡 剂 泡 沫 高 度 降 低 到 30CM 3.2 提 炼 工 艺 操 作 规 程 预 处 理 操 作 1 打 开 阀 V14, 加 发 酵 液 2 待 加 料 至 5000kg 时, 关 闭 阀 V14 3 打 开 预 处 理 罐 搅 拌 器 4 打 开 阀 V13, 加 黄 血 盐, 去 除 铁 离 子 5 观 察 铁 离 子 浓 度 变 化, 待 铁 离 子 浓 度 为 零 时, 关 闭 阀 V13 6 打 开 阀 V12, 加 磷 酸 盐, 去 除 镁 离 子 22

25 7 观 察 镁 离 子 浓 度 变 化, 镁 离 子 浓 度 为 零 时, 关 闭 阀 V12 8 打 开 阀 V11, 加 絮 凝 剂, 去 除 蛋 白 质 9 观 察 蛋 白 质 浓 度 变 化, 蛋 白 质 浓 度 为 零 时, 关 闭 阀 V11 10 打 开 阀 V16 V17 及 泵 P5, 同 时 打 开 转 筒 过 滤 器 开 关 及 后 阀 V18 11 待 发 酵 液 经 过 滤 排 至 混 合 罐 B101 后, 关 闭 阀 V16 V17 泵 P5 以 及 转 筒 过 滤 器 开 关 及 后 阀 V18 12 停 止 预 处 理 罐 搅 拌 器 一 次 BA 萃 取 操 作 1 打 开 混 合 罐 B101 搅 拌 器 2 打 开 阀 V19, 加 BA( 醋 酸 丁 酯 ) 质 量 为 发 酵 液 的 1/4~1/3 倍 3 关 闭 阀 V19 4 打 开 阀 V22, 加 稀 硫 酸 调 节 PH 值 5 待 PH 值 调 节 至 2~3 时, 关 闭 阀 V22 6 打 开 阀 V21, 加 破 乳 剂 7 加 破 乳 剂 量 为 100kg 时, 关 闭 阀 V21 8 打 开 阀 V23 V24 及 泵 P6, 向 分 离 机 注 液 9 待 分 离 机 中 有 液 位 时, 迅 速 打 开 A101 开 关 10 打 开 萃 余 相 回 收 阀 V26, 调 节 V26 阀 门 开 度, 控 制 重 相 液 位 在 总 液 位 的 80% 左 右, 使 轻 相 液 能 充 分 的 溢 流 至 B 待 混 合 罐 B101 液 体 排 空 后, 关 闭 阀 V23 V24 及 泵 P6 12 停 止 混 合 罐 B101 搅 拌 器 13 待 分 离 机 A101 中 液 体 排 尽 后, 关 闭 阀 V26 23

26 14 关 闭 分 离 机 A101 开 关 一 次 反 萃 取 操 作 1 打 开 混 合 罐 B102 搅 拌 器 2 打 开 V28, 加 碳 酸 氢 钠 溶 液, 质 量 为 青 霉 素 溶 液 的 3~4 倍, 并 调 节 PH 值 为 7~8 3 待 PH 值 调 节 至 7~8 时, 关 闭 阀 V28 4 打 开 阀 V29 V30 及 泵 P7, 向 分 离 机 A102 注 液 5 待 分 离 机 A102 中 有 液 位 时, 迅 速 打 开 A102 开 关 6 打 开 萃 余 相 回 收 阀 V32, 调 节 V32 阀 门 开 度, 控 制 重 相 液 位 在 总 液 位 的 80% 左 右, 轻 相 液 能 充 分 的 溢 流 出 7 待 混 合 罐 B102 液 体 排 空 后, 关 闭 阀 V29 V30 及 泵 P7 8 停 止 混 合 罐 B102 搅 拌 器 9 待 分 离 机 中 剩 余 少 许 重 液 时, 关 闭 阀 V32, 防 止 轻 液 流 入 混 合 罐 B103 中 10 关 闭 分 离 机 A102 开 关 二 次 BA 萃 取 操 作 1 打 开 混 合 罐 B103 搅 拌 器 2 打 开 阀 V33, 加 BA( 醋 酸 丁 酯 ) 质 量 为 发 酵 液 的 1/4~1/3 倍 3 关 闭 阀 V33 4 打 开 阀 V35, 加 稀 硫 酸 调 节 PH 值 5 待 PH 值 调 节 至 2~3 时, 关 闭 阀 V35 6 打 开 阀 V36 V37 及 泵 P8 7 待 分 离 机 中 有 液 位 时, 迅 速 打 开 A103 开 关 8 打 开 萃 余 相 回 收 阀 V39, 调 节 V39 阀 门 开 度, 控 制 重 24

27 相 液 位 在 总 液 位 的 80% 左 右, 使 轻 相 液 能 充 分 的 溢 流 至 脱 色 罐 中 9 待 混 合 罐 B103 液 体 排 空 后, 关 闭 阀 V36 V37 及 泵 P8 10 停 止 混 合 罐 B103 搅 拌 器 11 待 分 离 机 A103 中 液 体 排 尽 后, 关 闭 阀 V39 12 关 闭 分 离 机 A103 开 关 脱 色 罐 操 作 1 打 开 活 性 炭 进 料 阀 2 选 择 进 料 量, 进 料 25kg 3 进 料 4 关 闭 进 料 阀 5 打 开 脱 色 罐 搅 拌 器, 并 设 定 搅 拌 时 间 :10min 6 搅 拌 10min 后, 打 开 阀 V41 V42 及 泵 P9, 将 青 霉 素 溶 液 经 过 过 滤 器 排 至 结 晶 罐 7 待 脱 色 罐 液 体 排 空 后, 关 闭 阀 V41 V42 及 泵 P9 8 停 止 脱 色 罐 搅 拌 器 结 晶 罐 及 抽 滤 干 燥 操 作 1 启 动 结 晶 罐 搅 拌 器 2 打 开 阀 V43, 向 结 晶 罐 中 加 入 醋 酸 钠 - 乙 醇 溶 液 3 观 察 青 霉 素 浓 度, 待 青 霉 素 刚 好 反 应 完 时, 关 闭 阀 V43 4 打 开 冷 却 水 阀 V44 及 VD10, 控 制 结 晶 罐 温 度 为 5 以 下, 并 输 入 保 持 时 间, 保 持 10min 5 打 开 阀 V45 V46 及 泵 P10, 将 结 晶 液 排 至 真 空 抽 滤 机 进 行 抽 滤 6 待 真 空 抽 滤 机 中 上 层 液 位 达 到 50% 左 右 后, 迅 速 打 开 25

28 真 空 阀 V47, 进 行 抽 滤 7 同 时 打 开 V48, 回 收 母 液 8 待 结 晶 罐 中 液 体 排 空 后, 关 闭 阀 V45 V46 及 泵 P10 9 停 止 结 晶 罐 搅 拌 器 10 抽 滤 完 成 后, 关 闭 真 空 阀 V47 11 待 母 液 全 部 回 收 后, 关 闭 阀 V48 12 点 击 移 出 晶 体 按 钮, 将 抽 滤 后 的 晶 体 移 入 洗 涤 罐 13 打 开 阀 V49, 加 丁 醇 进 行 洗 涤 14 待 丁 醇 加 入 量 为 500kg 时, 关 闭 阀 V49 15 启 动 洗 涤 罐 搅 拌 器, 并 设 定 时 间 为 8min 16 停 止 洗 涤 罐 搅 拌 器 并 设 定 时 间, 保 持 10min 17 打 开 阀 V50, 排 出 废 洗 液 18 待 废 洗 液 排 尽 后, 关 闭 阀 V50 19 点 击 移 出 晶 体, 将 洗 涤 后 的 晶 体 移 至 真 空 干 燥 机 20 启 动 干 燥 机, 进 行 干 燥, 并 设 定 时 间 为 20min 21 关 闭 干 燥 机 开 关, 停 止 干 燥 26

( 二 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 培 养 人 的 创 新 精 神,,,,,,,,,,,,, [ ],,,,,,,,,,, :, ;,,,,,,? ( 三 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 全 体 学 生 都 获 得 全 面 发 展,, [ ],,,,,,,,,,,

( 二 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 培 养 人 的 创 新 精 神,,,,,,,,,,,,, [ ],,,,,,,,,,, :, ;,,,,,,? ( 三 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 全 体 学 生 都 获 得 全 面 发 展,, [ ],,,,,,,,,,, ( ) ( )... 李 雪 岩, 龙 耀 (. 广 西 民 族 大 学 商 学 院, 广 西 南 宁 ;. 中 山 大 学 教 育 学 院, 广 东 广 州 ) : 高 等 教 育 是 专 业 教 育 高 考 是 为 高 等 教 育 服 务 的, 是 为 高 等 专 业 教 育 选 拔 有 专 业 培 养 潜 质 的 人 才 现 行 高 考 制 度 忽 略 专 业 潜 质 的 因 素, 过 份 强

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