上海交通大学学报农业科学版第卷 -$. ()!+$:+%**.$$%+$--$../%$.$.:$-++.+% 黑灵芝!+$ 是我国灵芝资源宝库中的一个种类在我国有着悠久的历史其药用价值早在古代就

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浸否马佳
7 years ago
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1 第卷第期年月上海交通大学学报农业科学版!"!! $%$ 文章编号 ) 黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析苏恺琪王雪飞周选围上海交通大学农业与生物学院上海摘要黑灵芝!+$ 是灵芝家族中一个重要成员克隆和分析黑灵芝免疫调节蛋白基因可为进一步了解真菌免疫调节蛋白在种群中的分布打下基础以黑灵芝为材料采用同源克隆方法对真菌免疫调节蛋白 3 基因进行 3 扩增并对其核苷酸编码序列进行了生物信息学分析结果表明黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因序列包含可编码个氨基酸残基命名为 *%<3<+ 分子量为 5 理论等电点为 ( 符合 3 的特性是 3 家族一新成员对 3<+ 进行序列分析发现其氨基酸序列具有 3 的保守序列模式与紫灵芝.!$ 紫芝小孢灵芝!.!$ 赤灵芝 "$+$ 松杉灵芝 $ 金针菇 "$""$. 及草菇!""!" 的 3 序列的同源性分别为 8(8(8(8(88))8 系统进化树分析表明黑灵芝的 3 与紫芝的 3 亲缘性最高与金针菇和草菇的 3 亲缘性相对较远该研究为进一步了解免疫调节蛋白在灵芝种群中的分布提供了较详细的数据关键词黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因克隆生物信息学分析中图分类号文献标识码 3 % $ 13$$ /$$%$:-/%-+.2$%$+.++$$ :+%**.$*$%+$--$.3../++*%::-$*.$*/$:!+$ 3++-$:/:/-*-.+*%<./+.+% $+:-+*./$.+.+:%./$.-$.$:./$.+*.$+/-+ *$%/%+-*+$:5/-$.++$:(-%$:./+.+%./++3<+++. **-$:3:+*%/+*.$+/./$:3<+ +-*%+-$-**-$:3:+*%/+3+.!$3 3*!.!$ 3% "$+$ 3 $3:4 "$""$.+.344$!""!"/-:$.$8(8(8 (8(88+.))8./+%-/4%+.%%$./-%+$.-+.+%..$-$..*$%$./-$+3+++/%$-%+$ $4+.*$-+.:$.+$.:$-:--$:3/$**. 收稿日期 ( 基金项目国家自然科学基金面上项目 ) 作者简介苏恺琪 ( 女硕士生研究方向真菌生物技术!*+%+.(/. 周选围为本文通讯作者男学士教授研究方向真菌生物技术!*+%1+.$/.

了生物信息学分析结果表明黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因序列包含可编码个氨基酸残基命名为 *%<3<+ 分子量为 5 理论等电点为 ( 符合 3 的特性是 3 家族一新成员对 3<+ 进行序列分析发现其氨基酸序列具有 3 的保守序列模式与紫

2 上海交通大学学报农业科学版第卷 -$. ()!+$:+%**.$*$%+$--$../%$.$.:$-*++.+% 黑灵芝!+$ 是我国灵芝资源宝库中的一个种类在我国有着悠久的历史其药用价值早在古代就被我国劳动人民所认识明朝的李时珍在本草纲目中就记载并列举了青芝赤芝白芝黄芝黑芝紫芝种灵芝的药用性能其研究和总结为后人研究灵芝奠定了基础现代研究证明灵芝中含有多糖三萜类蛋白类甾醇脂肪酸微量元素等多种营养和药用成分具有广泛的药理 ) 学活性与其他灵芝种类一样人们对黑灵芝的研究也多集中在多糖的提取分离和生理活性的研 ( 究从未涉及有关蛋白研究的报道灵芝蛋白质是一类重要的活性物质主要包括凝集素真菌免疫调节蛋白 :+%**.$*$%+$- -$. 3 核糖体失活蛋白抗微生物蛋白脱氧核糖核酸酶等它不仅是灵芝生命活动的重要物质而且具有的独特免疫原性使其在免疫调节和抗肿瘤病等方面具显著效果 3 最初是从赤灵芝 "$+$ 中分离出来的后来相继从松杉灵芝 $ 金针菇 "$""$. 草菇!""!" 中分别纯化出了种 3 并从赤灵芝 "$+$ 松杉灵芝 $ 紫灵芝.!$ 小孢灵芝!.!$ 紫芝金针菇 "$" "$. 及草菇!""!" 等物种中分别克隆了编码 3 的基因并进行了原核和真核表达研究了其生理活性到目前为止分离出的天然 3 的基本特征为分子量均为 5 左右个氨基酸残基除赤灵芝 "$+$ 的 3 为糖蛋白含糖量约为 ) 8 之外其他 3 均不是糖蛋白以前的研究表明 3 的氨基酸序列同源性较高一般可达 88 左右但不同来源的 3 其生理活性表现出明显的差异为了进一步了解不同来源 3 免疫活性的变化特别是灵芝属内 3 的差异和免疫活性的差异本文以黑灵芝为材料克隆了编码 3 蛋白的基因 *% 并对其进行了生物信息学分析该研究为利用基因工程技术表达 3 蛋白提供了一个新的资源同时也为利用特异基因对灵芝进行分类打下基础 * 材料与方法 ** 材料菌株及主要试剂黑灵芝!+$ 由上海市农业科学研究院刘灶长研究员馈赠保存于上海交通大学植物生物技术研究中心胶回收小量试剂盒 (*% /$- 试剂盒柱离心式小量质粒抽提试剂盒 + 聚合酶 3 标准分子量及 ) 均为宝生物工程大连有限公司产品 *+ 基因组的提取采用高盐低法提取黑灵芝基因组步骤如下用液氮将菌丝体研磨成粉末状在材料中加入少许 ) 预热的提取缓冲液 ) 水浴保温 *. 每 )*. 缓慢振摇次在室温下 -*. 离心 *. 取上清液加入体积的 >/)*$% 溶液混匀后置于保持 *. -*. 离心 *. 上清液加入等体积的氯仿异戊醇 -*. 离心 *. 使其分层取出水相转入另一离心管加入体积的冰冷的异丙醇混匀后置于 < 过夜以沉淀核酸用 8 乙醇洗涤沉淀在空气中干燥 )*. 将沉淀溶解在 ) 的. 水中放置于 < 保存 * 真菌免疫调节蛋白基因的克隆以提取的黑灵芝基因组为模板进行 3 扩增根据已经报道的 3% 3 ( 基因序列在上海生工生物工程有限公司合成如下引物 3 上游引物 ) 32 下游引物 ) 3 反应体系包括 2:- )+ 引物各 ) 终体积为 )3 反应程序为预变性 ) *. 后按照 )) 进行 ) 个循环最后延伸 *.3 产物在电泳缓冲液下经

定了基础现代研究证明灵芝中含有多糖三萜类蛋白类甾醇脂肪酸微量元素等多种营养和药用成分具有广泛的药理 ) 学活性与其他灵芝种类一样人们对黑灵芝的研究也多集中在多糖的提取分离和生理活性的研 ( 究从未涉及有关蛋白

3 第期苏恺琪等黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析 8 琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后用凝胶成像系统拍照电泳检测回收后连接到 ( *% /$- 载体并转化到感受态细胞 ) 菌落 3 检测的阳性克隆送上海英骏生物工程有限公司进行测序 *- 黑灵芝 : 基因的生物信息学分析基因和蛋白质同源性分析核苷酸序列翻译和氨基酸序列比对由软件 /$-( 完成蛋白的理化性质及疏水性分析利用!13 中的相关工具预测蛋白质的三级结构通过 2 进行预测分子系统进化树在软件!) 上进行采用.$-$.. 方法重复运行次 + 结果与分析 +*% 基因的克隆以黑灵芝菌丝体为材料提取黑灵芝基因组电泳检测结果如图从图可以看到提取的黑灵芝较完整以黑灵芝的基因组为模板以 332 为引物进行 3 扩增电泳图谱显示大小为左右的条带图此条带与目的片段大小相符合将此条带克隆后经菌落 3 检测为阳性克隆图阳性克隆测序结果见图经 /$-( 软件分析表明黑灵芝 3 基因长度为编码个氨基酸 ++:+ 和其他 :+ 的同源性分析采用 /$-( 对 3+ 和其他 3 进行了同源性分析图 ) 其他 3 的序列来自.2+.5 如紫灵芝.!$ ( 的 3+ 赤灵芝 "$+$ ) 的 3% 来自金针菇 "$.2( 的 3:4 和已发表的文献如紫芝的 3 小孢灵芝!.!$ 的 3* 松杉灵芝 $ 的 3 草菇!" 的 344$ ) 结果显示出不同真菌免疫调节蛋白的氨基酸序列具有一定的同源性其中 3+ 和 33+ 3*33% 同源性较高大于 ()8 分别为 8(8(8(8(8 而与 3:4 和 344$ 的同源性较低分别为 8))8 序列同源性的比对结果表明黑灵芝和紫芝的亲缘性很高推测黑灵芝属于紫芝组灵芝组和紫芝组之间的氨基酸序列差别 (8 图 )3+ 与紫芝组的同源性为 (8 与灵芝组的同源性为 (8 图黑灵芝基因组泳道 +-5-) 泳道黑灵芝基因组!+$.$*/ +.*+-5-)+.!+$.$*/ 图基因组 3 产物的电泳图泳道 +-5- 泳道 *% 目的基因!+$.$*/3-$/ +.*+-5-+.*%. 图菌落 3 检测电泳图泳道 +-5- 泳道 <) 3 阳性检测泳道阴性对照!%/-$$-$:/$%$.3-$/ +.*+-5-+.<)$%$. 3-$/+.+4/$.-$%

13 中的相关工具预测蛋白质的三级结构通过 2 进行预测分子系统进化树在软件!) 上进行采用.$-$.

4 @ 上海交通大学学报!农业科学版" 第!"卷图?!黑灵芝核酸序列和推导氨基酸序列 N B X 8?!)N 图A! 和其他种的氨基酸序列比对结果注黑色背景和*(表示@种完全一致的氨基酸序列%灰色背景表示和一致的氨基酸%*4表示灵芝属内!来自 + 38?++ "?"%!来自 ] 8 "%!来自 ]L +3?"%!来自 ] " (+ 8"% N L!来自 ] 4?"% 3?" 个序列一致的氨基酸*)表示紫芝组和灵芝组$组之间的差别氨基酸 B!来自 ]? 3 A!^N XB X \ H H 8 B / N X B B I BNB B \ B 81H B B!!) B Y: H H\ : S: S N m(m% H B \ H H\ Y : S N8*4 B B! + 38?++ "? "%! ] 8 "%! ] L +3?"%! ]" (+ 8"% N! ]4?"% ]? 3?"8*) X X B B! L ?+ N: 8+ 38?+] : \ N: 81+

$来自 ] 4?"% 3?" 个序列一致的氨基酸*)表示紫芝组和灵芝组$组之间的差别氨基酸 B!来自 ]? 3 A!^N XB X \ H H 8 B / N X B B I BNB B \ B 81H B B!$

5 第期苏恺琪等黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析 +:+ 的结构分析经!1+ 相关软件预测 1+$-$$%-$+-+**%3+ 的氨基酸残基为个分子量为 )5 这与 3 蛋白具有 5 氨基酸的结论相吻合 3+ 的理论等电点为 ( 不含胱氨酸和组氨酸却富含天冬氨酸和缬氨酸 +% 疏水性分析结果表明 3+ 第 ( 位的甘氨酸 % 亲水性最强 < 第 ( 位苯丙氨酸 3 疏水性最强 (3+ 的整体结构表现出亲水性但其端和端是疏水的图通过 $*+ 方法.+%/:-/./-$*+ % 预测了 3+ 的二级结构其二级结构包括 8 螺旋 )8 延伸链和 ))8 无规则盘绕螺旋最长的线主要存在于端无规则盘绕最短的线贯穿于整个 3+ 序列是最重要的结构元素而延伸链中长的线则分散在序列中图 2 通过 / 网站 / 5-4/+-+ 对 3+ 进行三维结构预测表明空间结构与 3* 链 >B 结晶体结构相似图 +- 分子系统进化树将 3+ 和其他几种已知的 3 用! 图 3+ 蛋白质序列疏水区域分布预测图疏水性峰大于零亲水性峰小于零 23+ 的二级结构图螺旋延伸链无规则盘绕分别用长中短线表示 3+ 三级结构预测图 -$$/+-+:$-/+*+$:3+-$. -$$/ $+.-$%/+5%+.-$2$*.$.+%-/-% $*/$%+-./+%$./$.%$.+.$-4-/+%%.-/4%3-/3+-*.$.+%*$%

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6 上海交通大学学报农业科学版第卷 ) 软件 /%+%B 比对后采用方法进行分子系统进化分析重复次数次构建系统进化树图从图中可以看出 3+ 的推导氨基酸序列与紫芝 3 紫灵芝.!$3+ 氨基酸序列在进化上很接近同属于紫芝组而赤灵芝 "$+$3% 和松杉灵芝 $3 同属于灵芝组 3 * 处于组之间 3+ 与 3:4 和 344$ 亲缘性较远讨论图 3+ 的分子系统进化树 3%$./-$:3+ 本试验根据已报道的 3 的基因序列在其 ) 和端设计引物扩增出黑灵芝 *% 基因的编码区序列通过软件 /$-( 分析 *% 基因序列与 *% 基因的同源性达到了 (8 经过氨基酸序列比对发现黑灵芝的 3+ 与 3 氨基酸序列仅有个差别和 3+ 有个氨基酸差别这与柳永等认为灵芝免疫调节蛋白在灵芝亚属各个种中保守性较高的结论相一致同时也证明了利用 3 对灵芝进行分类是可行和可靠的神农本草经是最早提出灵芝分类的著作主要根据子实体颜色将灵芝分为六芝青芝赤芝白芝黄芝黑芝紫芝虽然这种分类和现代科学灵芝的分类完全是两回事但它却给后来灵芝的分类和研究以有益的启迪奠定了以形态特征为依据的分类设想根据形态学及担孢子的特征对灵芝属进行分类灵芝属可分为灵芝亚属树舌灵芝亚属和粗皮灵芝亚属其中灵芝亚属又分为灵芝组和紫芝组近年来随着分子生物学技术的发展灵芝属的分类学研究已逐步由表型观察深入到核酸水平苏春丽等用 < 微管蛋白基因部分序列对灵芝属菌株的亲缘关系进行探讨将黑灵芝归于紫芝 ) 组这与本研究的结果是一致的而赵明文等利用 3 技术对生产中常用的灵芝属 ( 个菌株的亲缘关系进行了分析根据 3 构建的树状图表明 ( 个菌株在较低的相似水平上可以分成个明显不同的组其中黑灵芝 $ 松杉灵芝 $ 圆芝!$+$ 灵芝 "$+$ 和韩国灵芝 "$+$ 被分为同一组也就是说黑灵芝和赤灵芝的亲缘关系较近这一结论和我们本研究的结果存在一定的出入本研究根据灵芝免疫调节蛋白的序列的分析认为 3+ 与紫芝的 3 和紫灵芝的 3+ 氨基酸序列在进化上很接近有可能从同一祖先平行进化而来与 3% 和 3 所属的灵芝组较远而与 3:4 和 344$ 亲缘性更远所以初步认为黑灵芝属于紫芝组本研究利用生物信息学方法对黑灵芝免疫调节蛋白基因推导的氨基酸序列从氨基酸组成理化性质疏水性二级和三级结构等方面进行了预测与分析为后期 3+ 氨基酸序列的结构性质及蛋白质空间结构的实验研究提供了一定的理论参考依据并为进一步研究 3+ 的表达和功能奠定基础对深入了解黑灵芝免疫调节蛋白基因结构与功能之间的相关性有着深远的意义参考文献周选围林娟中国野生灵芝资源的开发利用食用菌学报 )( 周选围林娟周良灵芝主要营养成分的测定分析陕西师范大学学报 ( 田光辉林娟陈文强等野生与栽培灵芝挥发油成分的分析中国食用菌 ( 黄为群吴其威黄瑞珊等灵芝菌发酵产物中多糖组分的分离与性质研究上海交通大学学报 ((( ) $ B.".""+.$-*++/ +.+-+%-$/+.--%++-*+/$%$/+% :./$.(-*-./+ )))) B3 ""!+$ $%+//+-+.+$1+4-./ +%+/$.*$-+.4.(( )(."B$%:+.2B""+.$-*+ //-*.+$.+%*$/-$*+$-+/ :.--..$.+$.+-+:/.

/-$:3+ 本试验根据已报道的 3 的基因序列在其 ) 和端设计引物扩增出黑灵芝 *% 基因的编码区序列通过软件 /$-( 分析 *% 基因序列与 *% 基因的同源性达到了 (8 经过氨基酸序列比对发现黑灵芝的 3+ 与 3 氨基酸序列仅有个差别和

7 第期苏恺琪等黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析 -$%/.-+/$./-$*+$-++.-/$. $:+*%*/%+:/+$.-++$.+%$: -4-+/-$*+$-+-*-./- ()-/1())) (." "$./-$ /$.:$-$%+$.$:$+%--.$ +$..:-$*!+$ -*-.:-- ( 周选围林娟李奇璋等灵芝蛋白类活性成分的研究进展天然产物开发与研究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柳永郭丽琼王海燕等灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和分析热带作物学报 ))( $ B"."".:/+$.$: */.+%!+/+$.3 /:/-*-+. 33*) ( 钟金霞何青何顺志等中国主要药用灵芝的鉴别中国中药杂志 () 赵继鼎张小青中国灵芝科真菌资源与分布真菌学报 )) ) 苏春丽唐传红张劲松等基于微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系菌物学报 )) 赵明文陈明杰王南等灵芝生产用种的亲缘关系研究南京农业大学学报

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