Microsoft Word - 质粒中量试剂盒201009_ver02.doc

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贴逸弓
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1 AxyPrep 质粒中量制备试剂盒本试剂盒采用改进的 SDS 碱裂解法, 结合 DNA 制备膜选择性地吸附 DNA 的方法达到快速纯化质粒 DNA 的目的适合于从 ml 细菌培养物中提取多至 100 μg 高纯的质粒 DNA, 用于测序体外转录与翻译限制性内切酶消化细菌转化等分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MD-P-2 AP-MD-P-10 AP-MD-P-25 制备次数 2 preps 10 preps 25 preps 中量滤器中量制备管 ml 离心管塑料扳手 RNase A 22 μl 120 μl 270 μl Buffer S1 11 ml 55 ml 125 ml Buffer S2 11 ml 55 ml 125 ml Buffer S3K 11 ml 55 ml 125 ml Buffer B 11 ml 55 ml 125 ml Buffer W1 16 ml 80 ml ml Buffer W2 concentrate 7.2 ml 36 ml 72 ml Eluent 1.5 ml 6 ml 20 ml 说明书 RNase A:50 mg/ml, 室温贮存 6 个月 ; 长期贮存于 -20 C Buffer S1: 细菌悬浮液加入 RNase A 后, 混合均匀,4 C 贮存 Buffer S2: 细菌裂解液 ( 含 SDS/NaOH) 室温密闭贮存 Buffer S3K: 中和液, 室温密闭贮存 Buffer B:DNA 结合溶液, 室温密闭贮存 Buffer W1: 洗涤液, 室温密闭贮存 Buffer W2 concentrate: 去盐液使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 ( 可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 ), 混合均匀, 室温密闭贮存 Eluent: 洗脱液, 室温密闭贮存二注意事项 1. 细菌过量将影响细菌裂解及质粒 DNA 的释放 2. 在步骤 3 和步骤 4 中操作必须温和剧烈摇晃, 将导致基因组 DNA 的污染但混合必须充分, 否则影响得率 3. 在加入 Buffer S3K 时, 蛋白质和基因组 DNA 形成粘稠的白色絮状沉淀, 必须充分混合均匀, 使凝集块中间也得到充分中和凝结 Page 1

2 4. 将 Eluent 或去离子水加热至 65 C, 有利于提高洗脱效率 5. DNA 分子呈酸性, 建议在 2.5 mm Tris-HCl,pH 洗脱液中保存 6. Buffer S2 Buffer S3K Buffer B 和 Buffer W1 试剂含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻若沾染皮肤眼睛时, 要立即用大量清水或生理盐水冲洗, 必要时寻求医疗咨询三实验准备 1. 第一次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4 C 贮存 2. 第一次使用时, 在 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 3. 准备无核酸和核酸酶污染的 Tip 头离心管 4. 4 C 预冷 Buffer S3K 和 Buffer B 5. 使用前, 检查 Buffer S2 是否出现沉淀, 应于 37 C 温浴加热溶解并冷却至室温后再使用 6. 需要使用负压装置 ( 推荐使用 Axygen 配套负压装置 AxyVac Cat No. : AP-VM) 四操作步骤 1. 取 30 ml 在 LB 培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液, 或 100 ml 过夜培养的低拷贝质粒菌液 ( 若使用丰富培养基, 菌液体积应减半或更少 ), 3, 000 g 离心 8 min, 弃上清将离心管倒置于纸巾上 1min, 除尽上清 2. 加 4.5 ml 的 Buffer S1 悬浮细菌沉淀, 悬浮需均匀, 不应留有小的菌块 * 确认 Buffer S1 中已加入 RNase A 3. 加 4.5 ml Buffer S2, 温和并充分地上下翻转 6-8 次混合均匀使菌体充分裂解, 直至形成透亮的溶液 ; 此步骤不宜超过 5 min * Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖, 以免空气中的 CO 2 中和 Buffer S2 中的 NaOH, 降低溶菌效率 * 避免剧烈摇晃, 否则将导致基因组 DNA 的污染 * 此步骤不宜超过 5 min 4. 加 4.5 ml 4 C 预冷的 Buffer S3K, 温和并充分地上下翻转 10 次混合均匀, 直至形成紧实的凝集块 ; 室温放置 5 min * 加入 Buffer S3K 后应立即混合, 以避免形成局部的凝结块 * 避免剧烈摇晃, 否则将导致基因组 DNA 的污染 5. 加 4.5 ml 4 C 预冷的 Buffer B, 温和并充分地上下翻转 10 次混合均匀, 6,000 g 离心 (4 C) 10 min 6. 正确连接负压装置, 将中量制备管插到负压装置的插口上 7. 吸取步骤 5 中的混合液, 转移到中量滤器中, 插入注射器芯, 垂直向下缓慢推注至中量制备管中, 开启并调节负压至英寸汞柱, 缓慢吸走管中溶液 8. 保持负压, 加 7 ml Buffer W1, 吸尽管中溶液 9. 加 8 ml Buffer W2, 吸尽管中溶液 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇 Page 2

3 10. 用塑料扳手取下中量制备管下部含质粒的制备管管头, 置于洁净的 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 加 0.3 ml Buffer W2,12, 000 g 离心 2 min 11. 将制备管管头置于另一洁净的 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 在制备管的膜中央加 0.3 ml Eluent 或去离子水室温静置 1 min 12, 000 g 离心 1 min 收集质粒 DNA * 将 Eluent 或去离子水加热至 65 将提高洗脱效率 12. 可选步骤 : 同样方法, 在制备管的膜中央加 0.2 ml Eluent 或去离子水, 室温静置 1 min 12, 000 g 离心 1 min 收集质粒 DNA 五流程图加 4.5 ml Buffer S1 加 4.5 ml Buffer S2 加 4.5 ml Buffer S3K 裂解中和加 4.5 ml Buffer B, 离心 6, 000 g(4 C),10 min 过滤加 7 ml Buffer W1 加 8 ml Buffer W2 加 0.3 ml Buffer W2, 离心 12, 000 g,2 min 结合洗涤加 0.3 ml Eluent 或去离子水可选步骤 : 再加 0.2 ml Eluent 或去离子水洗脱 Page 3

4 六常见问题分析主要问题原因建议得率低或纯化不到质粒 1. 质粒丢失在含有新鲜抗生素的平板上重新划甘油菌培养若当前使用的是氨苄青霉素, 可以考虑试用羧苄青霉素如果有必要, 可重新转化质粒或使用不同的宿主菌 2. 细菌裂解不完全 1) 菌量过多将菌量减少为原先的一半 ( 实际操作中可按实验情况相应调整 ) 2) Buffer S2 过期 Buffer S2 中的 NaOH 易被空气中的 CO2 中和使用完要立即拧紧瓶盖 3. 细菌重悬不完全在加入 Buffer S1 后注意观察细菌是否完全悬浮是否有菌块残留 4. 质粒过早的被洗确保 buffer W2 中已经加入正确体积的脱 % 无水乙醇 5. 洗脱效率低 1) 膜过干制备管在负压装置上抽干时间不宜过长 DNA 纯度低高纯度的质粒 A 260/280 比值通常在之间低于 1.7 考虑蛋白质污染, 高于 1.9 考虑 RNA 污染 1. A 260/280 比值过低表现为琼脂糖凝胶电泳的背景底色亮和酶切效率低 2. A 260/280 比值过高表现为电泳时会出现 RNA 条带 1) 菌量过多 2) 加入 Buffer S1 后菌体未完全悬起 3) 加入 Buffer S2 后裂解不完全 4) 加入 Buffer S3K 后中和不完全 1)Buffer S1 中未加入 RNase A 2)Buffer S1 保存不当, 或者已经过期,RNase A 活性下降洗脱液或者去离子水 65 C 预热以及增加洗脱前静置时间至 5min 都可提高洗脱效率 3) 菌量过多 4) 加入 Buffer S1 后菌体没有完全悬起 5) 加入 Buffer S2 后裂解不完全 Page 4

5 主要问题原因建议琼脂糖凝胶中 1. 使用 enda+ 宿主菌尽量使用 enda- 宿主菌质粒条带模糊 enda+ 是宿主菌中含有 enda 基因型, 确保 Buffer W1 洗涤 1 次通常质粒条带表达 Endonuclease I 内源核酸酶模糊是由于降解影响, 而此降解可能部分 enda+ 宿主菌列表见下是宿主菌自身引起的, 也可能是纯化 BL21(DE3) MC1061 过程中造成 BMH71-18 NM522 (NM 系列宿主菌都是 End A +) CJ236 P2392 ES1301 PR700 (PR 系列宿主菌都是 End A +) HB101 Q358 JM83 RR1 JM101 TB1 JM110 TG1 LE392 Y1088 ( Y10 系列宿主菌都是 End A +) 2. 菌培养时间过长不要超过 16 小时 3. 存放 / 处理收集菌时间过长存放 3 个月以内 4. 存放收集菌的方式不对请于 -20 以下存放 5. 加入 Buffer S2 后裂解不完全 6. 加入 Buffer S3K 后中和不完全琼脂糖凝胶电泳出现多个条带正常质粒电泳会出现多条带清晰的主带是质粒的超螺旋结构在超螺旋主带的上方通常有 1-3 条电泳更慢的条带, 一般认为是开环质粒和质粒二聚体 ( 或者不同的交联形式 ) 偶然也会有在超螺旋条带前面出现微弱的称为不可逆变性质粒条带, 这个是碱裂解的副产品大多数酶对这种质粒不起作用, 包括限制性和测序的酶如果在 S2 环境中时间过长, 会使得不可逆变性的质粒含量增加 Buffer S2 裂解不要超过 5min. Page 5

6 主要问题原因建议琼脂糖凝胶电泳 1. 培养时间过长, 大量细菌死亡和产生大量菌体碎片背景底色亮细菌碎片基 2. 收集的细菌保存 / 处理时间过长因组和 RNA 污染都显现高亮电泳背景 3. 保存收集细菌的方法不对 4. 菌量过多 5. 加入 Buffer S2 后裂解不完全 6. 加入 Buffer S3K 后中和不完全基因组 DNA 污染 1. 培养时间过长, 大量细菌死亡和产生大量菌体碎片 2. 菌量过多 3. 加入 Buffer S2 后震荡剧烈 / 裂解不完全 / 作用时间太长 4. 加入 Buffer S3K 后剧烈震荡 / 中和不完全 RNA 污染少量的 RNA 污染对于一般实验来说是没有影响的 DNA 酶切效果不好酶切效果不好可能是有抑制剂的污染 ( 比如盐和乙醇 ) 或者质粒修饰偶尔, 质粒在传代几次后会产生缺失在排除其他原因的情况下, 要通过测序才能确定参见 A 260/280 比值过高 1. 盐污染 2. 乙醇污染 3. Buffer S2 作用时间过长 4. 核酸酶污染引起的质粒降解 5. 质粒序列缺失确保用 Buffer W2 洗涤 2 次在最后一次 Buffer W2 洗涤后可将制备管离心时间由原来 1min 增加至 2min Page 6

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<4D F736F F D20D7DC524E41D0A1C1BFD6C6B1B8CAD4BCC1BAD02E646F63> AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-RNA-4