4 期黎观红等 : 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响 635 pernatantsofculturedepithelialcelstreated with 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊,indicatingthatAvBD9 peptidereleasesint

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锦錞余
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1 畜牧兽医学报 2012,43(4): 犃犮狋犪犞犲狋犲狉犻狀犪狉犻犪犲狋犣狅狅狋犲犮犺狀犻犮犪犛犻狀犻犮犪鼠李糖乳酸杆菌犔犌犃对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响黎观红 1, 洪智敏 1, 贾永杰 1, 易中华 1, 瞿明仁 1, 刘思国 2 (1. 江西农业大学动物科技学院, 南昌 ;2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨 ) 摘要 : 本研究旨在研究益生性鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对体外培养的鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9(AvBD9) 表达的调节作用选用鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对体外培养的鸡小肠上皮细胞进行剂量依赖性及时间依赖性刺激实验, 利用实时荧光定量 PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ PCR) 从 mrna 水平研究刺激后上皮细胞犃狏犅犇 9 基因表达水平的差异结果表明, 不同浓度 ( cfu ml -1 ) 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 均能上调犃狏犅犇 9 mrna 的表达, 且在不同细菌浓度之间犃狏犅犇 9 mrna 的表达存在差异热灭活鼠李糖乳杆菌 LGA 亦能上调犃狏犅犇 9 基因表达, 且上调值显著高于活菌 ( 犘 <0.05) 鼠李糖乳杆菌 LGA 刺激上皮细胞后 AvBD9 表达存在时间依赖关系,12h 时 AvBD9 的表达达到峰值 Westernblot 检测结果显示, 鼠李糖乳杆菌 LGA 刺激后的上皮细胞培养上清中存在 AvBD9 蛋白表达, 表明 AvBD9 蛋白可以分泌到细胞外而发挥其生物学功能益生性鼠李糖乳酸杆菌 LGA 与鸡肠道上皮细胞的相互作用过程中, 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 能够促进上皮细胞抗菌肽 β 防御素 9 的表达本研究结果提示益生性乳杆菌可能通过促进肠道上皮抗菌肽的表达而发挥其益生作用关键词 : β 防御素 9; 鸡小肠上皮细胞 ; 鼠李糖乳酸杆菌 LGA; 荧光定量 PCR 中图分类号 :S831.1 文献标识码 :A 文章编号 : (2012) 犈犳犳犲犮狋狅犳犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊犔犌犃狅狀 β 犱犲犳犲狀狊犻狀 9 犈狓狆狉犲狊犻狅狀犻狀犆狌犾狋狌狉犲犱犆犺犻犮犽犲狀犛犿犪犾犐狀狋犲狊狋犻狀犪犾犈狆犻狋犺犲犾犻犪犾犆犲犾狊 LIGuan hong 1,HONGZhi min 1,JIA Yong jie 1,YIZhong hua 1,QU Ming ren 1,LIUSi guo 2 (1. 犆狅犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犑犻犪狀犵狓犻犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犖犪狀犮犺犪狀犵 , 犆犺犻狀犪 ;2. 犎犪狉犫犻狀犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊, 犎犪狉犫犻狀 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Thisstudyaimedtoinvestigatetheefectofprobiotic 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊 ( 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 )ontheβ defensin9(avbd9)expressioninculturedchickensmalintestinalepi thelialcels. 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 wasselectedtoexaminethetime anddose responseof 犃狏犅犇 9 geneexpressionuponstimulationofchickenintestinalsmalepithelialcelswith 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊.The 犃狏犅犇 9 mrna expression wasdeterminedbyfluorescencequantitativepcr (FQ PCR).Theresultsshowedthat 犃狏犅犇 9expressionwasupregulatedbystimulationof 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 atdiferentconcentrations (2 10 5,2 10 6, cfu ml -1 ),andexpression diferencewasobservedbetweentreatmentsatthreebacterialconcentrations.heat inactivated 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 alsostimulatedtheexpressionof 犃狏犅犇 9,andshowedstrongerinductionresponse thanlivebacteria( 犘 <0.05).The 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 promoted 犃狏犅犇 9mRNAtranscriptionin time dependentmanner.the 犃狏犅犇 9mRNAexpressionpeakedat12hofincubationupontreat mentofepithelialcelswithlactobacilus.avbd9peptidewasdetectedbywesternblotinthesu 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 江西省青年科学家培养对象计划项目 ( 赣科发计字 [2010]209 号 ) 作者简介 : 黎观红 (1974 ), 男, 江西于都人, 博士, 副教授, 主要从事家禽肠道免疫研究,E mail:liguanh@163.com 通讯作者 : 黎观红,Tel: ,E mail:liguanh@163.com

2 4 期黎观红等 : 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响 635 pernatantsofculturedepithelialcelstreated with 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊,indicatingthatAvBD9 peptidereleasesintoextracelularmediumandexertsitsbiologicalactions.probiotic 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊 stimulates 犃狏犅犇 9expressionintheepithelialcelsofchickensmalintestineduringlac tobacilus epithelialcelinteraction.thisstudyrevealsthenewpossiblefunctionalmechanismby whichtheprobioticlactobaciliexerttheirbeneficialefectstothehostthroughtheantimicrobial peptideexpressioninthesmalintestinalepithelium. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : β defensin 9;chickensmalintestinalepithelialcels; 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊 ; fluorescencequantitativepcr 动物内源性抗菌肽 (Endogenousantimicrobial peptides) 是基因编码的阳离子多肽, 具有广谱抗菌能力, 在机体组织中分布广泛, 尤其是那些与微生物密切接触的上皮如消化道呼吸道生殖道黏膜上皮和皮肤, 抗菌肽在机体局部抗感染与免疫方面发挥 [1] 着重要作用最近研究发现, 抗菌肽是肠道黏膜天然免疫的重要成分, 是先天抗微生物免疫的直接 [2] 效应分子肠道抗菌肽主要由肠道黏膜上皮细胞 (Intestinalepithelialcels,IECs) 和免疫细胞产生和分泌, 而肠道上皮细胞作为机体防御的第一道防线, 其产生的抗菌肽 / 蛋白对保护整个肠道黏膜完整 [2] 和调节微生物区系平衡尤为重要肠道上皮细胞产生的抗菌肽除了具有较强的直接杀灭有害微生物的作用外, 它们还可作为细胞间的信号分子而发挥多重免疫调节活性, 在连接天然免疫和获得性免疫 ( 特异性免疫 ) 反应之间起着重要的桥梁作用, 并启 [3] 动获得性免疫系统提高机体的特异性免疫水平目前, 从鸡肠道组织中发现的抗菌肽 / 蛋白主要有鸡 β 防御素 ( β defensins) Cathelicidins 组蛋白 H1 和 [4 8] H2B 溶菌酶等其中, β 防御素家族是鸡肠道上皮细胞表达的一类最重要的抗菌肽鸡的染色体基因编码 13 种 β 防御素, 它们成族地排列在 3 号染 [4,5,9] 色体的 q3.5 q3.7 上国内外学者对 β 防御素在健康鸡各种组织 ( 包括消化道 ) 的分布表达进行了许多研究, 不同的 β 防御素在机体内的表达具有 [4 5,8,10 11] 组织特异性, 其中, β 防御素 9(AvBD9) 是鸡胃肠道上皮细胞表达的重要抗菌肽, 在肠道黏膜抗感染免疫中发挥重要作用人和哺乳动物肠道上皮细胞抗菌肽的表达调控及其机制新功能的发现已成为医学和农业生物学研究的热点然而, 对于鸡肠道抗菌肽的研究报道尤其是其在肠道的表达调控和功能研究则很少乳酸杆菌作为一种重要的绿色饲料添加剂已广泛用于畜禽饲料中以提高动物健康和生产性能然而, 乳酸杆菌的作用机理目前还不完全清楚乳酸杆菌黏附并定植于肠道上皮细胞是其发挥益生作用的前提, 而上皮细胞是乳酸杆菌发挥益生作用的重 [12] 要扮演者目前, 对于肠道内占绝大多数的乳酸杆菌与肠道抗菌肽表达之间的关系研究甚少, 两者之间的关系尚不清楚为此, 本试验采用实时荧光定量 PCR(FQ PCR) 检测益生性鼠李糖乳酸杆菌刺激鸡小肠上皮细胞后抗菌肽犃狏犅犇 9 基因表达变化, 为从益生菌与上皮细胞抗菌肽表达关系新角度解析益生菌发挥益生作用的新途径和机制提供一定的基础及依据 1 材料与方法 1.1 材料主要试剂与仪器细胞培养基 :DMEM 培养基, 购自 Gibco 公司细菌培养基 :MRS 培养基,1 L 蒸馏水中溶解 15g 琼脂的培养基, 加入下列成分 : 蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 柠檬酸二铵 2g 酵母膏 5 g 乙酸钠 5g 葡萄糖 20g 吐温 801mL K 2HPO 42 g MgSO 4 7H 2O0.58g MnSO 4 4H 2O0.25g, 调节 ph 为 6.2~6.4,121 灭菌 15min RNA 提取试剂盒 (TOYOBO 公司 ) 反转录试剂盒 (DRR037, TaKaRa 公司 ) 及荧光定量试剂盒 (DRR039,TaKa Ra 公司 ) 二氧化碳培养箱 (HF90, 香港 Heal Force 公司 ) 倒置显微镜 (CKX31, 日本 OLYMPUS 公司 ) 酶联免疫检测仪 (ELX800, 美国 BioTek 公司 ) 细胞培养瓶培养板 0.22μm 滤膜, 均购自美国 Costar 公司梯度 PCR 仪 (TP600, 大连宝生物工程有限公司 ); 荧光定量 PCR 仪 (LightCycler 480, 美国罗氏公司 ) 小肠上皮细胞的获取与培养将孵育 18 日龄无特定病原 (Specificpathogenfree,SPF) 鸡胚用酒精棉擦拭, 并将大头朝上放置在蛋座上, 用已消毒的金属器具轻轻将鸡蛋大头击破, 用镊子夹去破

3 636 畜牧兽医学报 43 卷碎的蛋壳, 弯头镊子撕去气室膜, 用镊子夹住鸡胚颈部, 将其拖出放入干净无菌的培养皿中, 备用在无菌条件下取出整条小肠, 小心去除肠系膜, 用 D Hank s 液清洗 2~3 次, 将小肠剪成小于 1 mm 3 的组织块, 加入 D Hank s 液清洗, 清洗液中加入浓度为 500U ml -1 左右的双抗 ( 青霉素链霉素 ), 静置 1 min, 反复洗 2~3 次至上清液澄清, 吸弃洗液, 清洗干净组织块加入 5 倍体积胶原酶 Ⅰ(1mg ml -1 ) 至组织块中, 移入三角瓶中 37 慢速振荡消化 50min, 期间不断观察小肠黏膜的消化情况, 小肠粘膜为蜂窝空泡状时终止消化, 小心吸弃消化液, 加入完全培养液反复吹打 5~10 次而后 500g 离心 6min, 去除残余的消化液, 沉淀用培养液悬浮, 轻轻吹打 5~10 次,500g 离心 6 min, 重复 1 次, 尽量去掉单细胞, 最终沉淀用完全培养液悬浮, 并用四层纱布过滤, 滤去未消化完全的组织块, 收集隐窝细胞团块, 液接种于 75cm 2 培养瓶中, 差速贴壁培养, 成纤维细胞在培养 10min 左右就开始贴壁,90min 后将细胞按一定浓度接种于 6 孔板中,37 5%CO 2 饱和湿度培养箱静置培养 24~48h 后换液, 以后每 2d 换液 1 次供试菌株鼠李糖乳酸杆菌 ( 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊 ), 分离自健康鸡消化道 1.2 试验方法乳酸杆菌的培养与鉴定乳酸杆菌的培养 : 乳酸杆菌接种于 MRS 液体培养基,37 厌氧恒温箱中静置培养, 紫外分光光度计测定 600nm 光密度 (OD 600nm ), 当细菌处于指数生长期时, 犵离心 10min, 弃液体,PBS 洗涤 2 次, 按照公式 cfu ml -1 = OD 600nm 调节细菌数, 使其浓度为 cfu ml -1, 用于细胞刺激试验乳酸杆菌鉴定 : 革兰氏染色, 光学显微镜下观察菌体形态, 如大小长短分叉情况及染色性等进一步进行 16SrDNA 分子鉴定 16SrDNA 菌种鉴定由北京三博远志生物技术有限责任公司完成 β 防御素 9mRNA 表达水平的检测小肠上皮细胞与乳酸杆菌共培养 : 取相同数目细胞接种于六孔板中,37 5%CO 2 培养箱中静置培养, 至细胞铺满底层 80% 时用于细菌刺激试验, 吸弃培养液,PBS 洗 2~3 次, 加入不同浓度的鼠李糖乳酸杆菌进行刺激试验, 每孔加入 2 ml DMEM 培养液悬浮的细菌悬液, 对照组加入 2 ml DMEM 培养液分别用 3 个浓度梯度进行刺激试验 : cfu ml -1 刺激 4h 后, 吸去培养基,PBS 洗 3 次, 用细胞刮刷将贴壁细胞刮下,2500 犵离心 5 min, 弃上清放入 -80 冰箱保存, 用于提取总 RNA 检测 AvBD9 mrna 的表达量取活菌和热灭活全菌 cfu ml -1 与小肠上皮细胞共培养 4h 后分别提取各组总 RNA 检测 AvBD9 mrna 的表达量取 cfu ml -1 鼠李糖乳酸杆菌刺激小肠上皮细胞 h 后分别提取各组总 RNA 检测 AvBD9mRNA 的表达量乳酸杆菌刺激后细胞总 RNA 的提取和反转录合成 :RNA 提取按照试剂盒说明书操作提取的样品用 1% 琼脂糖电泳观察所提 RNA 的质量, 同时用紫外分光光度计测吸光度 A 260nm 和 A 280nm, 以测定 RNA 纯度和浓度将经鼠李糖乳酸杆菌刺激后以及无细菌刺激组 ( 对照组 ) 提取的总 RNA, 根据 TaKaRa 公司试剂盒采用两步法进行反转录, 得到 cdna 以提取的总 RNA 为模板,Oligo (dt)15 为随机引物,10μL 反转录合成 cdna 的体系为 5 PrimeScriptBufer2μL,PrimeScriptRT En zyme 犕犻狓 I0.5μL,OligodTPrimer(50mmol L -1 ) 0.5μL,Random 6 mers (100 μmol L -1 )2 μl, RNaseFreedH 2O2μL, 样品 RNA3μL 反应条件为 37 15min,85 5s RT 产物于 -20 保存备用 PCR 引物设计和探针的合成 : 参照 Gen Bank 中所提供的基因序列设计特异性引物 ( 目的基因犃狏犅犇 9 基因 GenBank 登录号 :NM_ , 内参 β 犪犮狋犻狀基因登录号 :L ) 目的基因引物及探针由上海超世生物公司设计合成, 内参基因引物及探针由南京金斯瑞公司设计合成目的基因犃狏犅犇 9 上游引物序列 : CCACGGCTCCT GCTCTTTT, 下游引物序列 :ACCACGGCAG GTCCCAAT, 探针 : FAM TTGCATGCCGT GCTCCTTCAGTTG BHQ, 预期扩增长度 69bp; 内参 β 犪犮狋犻狀上游引物序列 :TTGTGATG GACTCTGGTGATGG, 下游引物 :TGTCAG GATCTTCATGAGGTAGTC, 探针 : FAM TCACGGCCAGCCAGATCCAGACGG BHQ, 预期扩增长度 131bp 实时荧光定量 PCR 检测犃狏犅犇 9 基因

4 4 期黎观红等 : 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响 637 mrna 表达水平 : 用 LightCycler480PCR 仪检测 AvBD9 在不同浓度鼠李糖乳酸杆菌刺激后其 mrna 表达水平根据 TaKaRa 试剂盒优化反应体系, 对每个样品 cdna 进行目的基因和内参基因荧光定量 PCR 反应 20μL 反应体系 :PremixEx 犜犪狇 (2 )10μL,PCRForwardPrimer(10μmol L -1 )0.4 μl,pcrreverseprimer(10μmol L -1 )0.4μL, Probe0.6μL,RNaseFreedH 2O6.6μL, 样品 cd NA2μL 反应条件: 两步法进行 PCR 扩增,95 预变性 30s,1 循环 ;95 5s,60 20s,40 循环 PCR 扩增反应结束, 根据扩增曲线的 CT 值计算定量结果, 并对数据进行统计学分析目的基因及内参基因在同一条件下不同管内扩增, 每个样品设 3 个重复 Tricine SDS PAGE 蛋白质电泳由于 AvBD9 相对分子质量较小, 只有 8ku 左右, 按常规蛋白胶配方配制, 蛋白容易丢失, 因此采用适合小分子蛋白分离的 Tricine SDS PAGE 每份蛋白质样品取 50μg, 按比例加入 4 上样缓冲液, 旋涡混匀, 沸水浴 5min,12000 犵离心 2 min, 吸取上清加入凝胶上样孔其中一空加入 10μL 预染蛋白质分子质量标准 (Marker) Westernblot 检测培养上清中 AvBD9 的表达收集乳酸杆菌刺激上皮细胞 12h 后的培养上清, 冻干后用 PBS 重溶, 测定蛋白浓度,Western blot 检测 AvBD9 蛋白的表达 1.3 数据处理目的基因的相对表达量采用 C T 法计算 : C T ( 目的基因 )=C T ( 目的基因 )-C T ( 内参基因 ); C T= C T ( 乳酸杆菌刺激组 )- C T ( 对照组 ) 目的基因的相对表达水平 =2 - CT 实时荧光定量 PCR 结果均用平均值 ± 标准误 (Means± SE) 表示, 其中各基因的表达量所示结果均经内参基因表达量的校正采用 SAS8.0 的 One way ANOVA 过程进行方差分析, 并采用 Duncan 氏法进行多重比较, 以犘 <0.05 为显著性标准酸杆菌的 16SrDNA 序列与鼠李糖乳酸杆菌 (GenBank 登录号为 HM ) 相似性为 99% 通过 BLAST 工具找到与测得序列同源性最高的序列, 按照目前建议的依据细菌 16SrDNA 序列进行分类的标准, 乳酸杆菌鉴定为鼠李糖乳酸杆菌 ( 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊 ) 2.2 肠上皮细胞总犚犖犃的检测所提取的总 RNA 用 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测,RNA 样品电泳条带清晰,28S 18S 和 5S 清晰可见, 均未降解紫外分光光度计检测样品 A 260nm /A 280nm, 比值在 1.8~2.0, 表明无 DNA 残留, 无蛋白污染, 可以满足试验要求 2.3 实时荧光定量犘犆犚结果不同浓度鼠李糖乳酸杆菌对犃狏犅犇 9 mrna 表达的影响分别用 cfu ml -1 鼠李糖乳酸杆菌刺激生长 5d 的鸡肠道上皮细胞,4h 后吸去培养液, 用 PBS 洗 3 次, 提取细胞总 RNA,FQ PCR 检测犃狏犅犇 9 mr NA 的表达, 结果如图 1 未受刺激的正常对照组也检测到犃狏犅犇 9 mrna 的表达, 不同浓度鼠李糖乳酸杆菌均能上调犃狏犅犇 9 基因表达, 且呈剂量依赖性 cfu ml -1 鼠李糖乳酸杆菌刺激组犃狏犅犇 9mRNA 表达量均极显著高于未受细菌刺激的对照组 ( 犘 <0.01), cfu ml -1 组犃狏犅犇 9mRNA 表达量显著高于 cfu ml -1 组 ( 犘 <0.05), 但与 cfu ml -1 组差异不显著 ( 犘 >0.05) cfu ml -1 组与 cfu ml -1 组犃狏犅犇 9 mrna 表达量亦无显著差异 ( 犘 >0.05) 2 结果 2.1 乳酸杆菌的鉴定鼠李糖乳酸杆菌经革兰氏染色为革兰氏阳性, 呈小菌落针尖状, 乳白色突起, 长杆菌, 单个或成对排列根据菌株的 16SrDNA 测序结果 ( 图略 ), 登录 GenBank 数据库进行序列比对, 经比对乳图 1 不同浓度鼠李糖乳酸杆菌犔犌犃对鸡小肠上皮细胞犃狏犅犇 9 犿犚犖犃表达的影响犉犻犵.1 犈犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犲狉犲狀狋犱犲狀狊犻狋狔狅犳犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊犔犌犃狅狀犃狏犅犇 9 犿犚犖犃犲狓狆狉犲狊犻狅狀犻狀犮狌犾狋狌狉犲犱犮犺犻犮犽犲狀狊犿犪犾犻狀狋犲狊狋犻狀犪犾犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾狊

5 638 畜牧兽医学报 43 卷鼠李糖乳酸杆菌及其灭活菌与犃狏犅犇 9mRNA 表达水平的关系取对数生长期的鼠李糖乳酸杆菌, 调节浓度为 cfu ml -1, 另取相同数量的此菌在 65 水浴中灭活 30min; 刺激肠上皮细胞, 对照组只加入 DMEM 培养液, 刺激 4 h 后, 活菌与热灭活菌均上调犃狏犅犇 9mRNA 表达, 但热灭活菌上调值显著高于活菌 ( 犘 <0.05, 图 2) 图 3 鼠李糖乳酸杆菌犔犌犃刺激不同时间与犃狏犅犇 9 犿犚犖犃表达水平的关系犉犻犵.3 犜犻犿犲犮狅狌狉狊犲狅犳犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊犔犌犃犻狀犱狌犮犲犱犃狏犅犇 9 犿犚犖犃犲狓狆狉犲狊犻狅狀图 2 鼠李糖乳酸杆菌犔犌犃活菌及热灭活菌与对鸡小肠上皮细胞犃狏犅犇 9 犿犚犖犃表达的影响犉犻犵.2 犈犳犲犮狋狊狅犳犾犻狏犲犪狀犱犺犲犪狋犻狀犪犮狋犻狏犪狋犲犱犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊犔犌犃狅狀犃狏犅犇 9 犿犚犖犃犲狓狆狉犲狊犻狅狀犻狀犮狌犾狋狌狉犲犱犮犺犻犮犽犲狀狊犿犪犾犻狀狋犲狊狋犻狀犪犾犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾狊鼠李糖乳酸杆菌刺激时间与犃狏犅犇 9 mrna 表达水平的关系不同菌株浓度依赖性试验结果表明, 在细菌浓度为 cfu ml -1 时, 鼠李糖乳酸杆菌促进鸡小肠上皮细胞犃狏犅犇 9 表达能力最强因此, 用此浓度的鼠李糖乳酸杆菌刺激上皮细胞 h 后分别提取各样品的总 RNA,FQ PCR 检测犃狏犅犇 9 mrna 的表达水平结果发现, 与对照组相比, 鸡小肠上皮细胞受鼠李糖乳酸杆菌刺激后, 犃狏犅犇 9mRNA 的表达水平在 20h 内均上调, 且存在时间依赖性,12h 达到峰值, 此后犃狏犅犇 9mRNA 的表达开始下降 ( 图 3) 2.4 犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测培养上清中犃狏犅犇 9 蛋白的表达用鼠李糖乳酸杆菌刺激上皮细胞 12h 后收集上清,Westernblot 检测表明, 鼠李糖乳酸杆菌与上皮细胞共培养的上清中存在 AvBD9 蛋白 ( 图 4 箭头所示 ), 说明抗菌肽是上皮细胞产生的分泌蛋白, 可分泌到细胞外, 从而发挥抗菌作用及其他生物学功能图 4 犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测犔犌犃刺激的培养上清中犃狏犅犇 9 蛋白表达犉犻犵.4 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犃狏犅犇 9 狆犲狆狋犻犱犲犻狀犮狌犾狋狌狉犲狊狌狆犲狉狀犪狋犪狀狋狊犳狉狅犿犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊犔犌犃狊狋犻犿狌犾犪狋犲犱犮犺犻犮犽犲狀狊犿犪犾犻狀狋犲狊狋犻狀犪犾犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾狊犫狔犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋 3 讨论益生菌作为调整胃肠道微生态平衡预防肠道感染以及减轻胃肠道炎症反应等制剂以及作为肠道免疫调节剂和黏膜免疫佐剂, 已广泛用于畜禽饲料中以提高动物生产性能但是, 益生菌的具体作用机制还不完全清楚, 许多益生菌的研究只停留在作用效果研究上目前, 研究者对于益生菌的作用机制主要有以下几种解释 : 生物夺氧, 使肠道菌群恢复到正常状态 ( 主要针对芽孢杆菌的作用 ), 即生物夺氧学说 ; 增加肠道内有益菌数量, 竞争性抑制致病菌

6 4 期黎观红等 : 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响 639 对肠上皮细胞的黏附, 拮抗致病微生物, 即菌群屏障学说 ; 益生菌产生有机酸降低肠道 ph, 产生过氧化氢细菌素和类似抗菌素的抗菌物质, 合成和分泌营养物质和消化酶, 即微生物代谢学说 ; 调节机体体液免疫细胞免疫和非特异性免疫, 即免疫调节学说不同益生菌对畜禽作用效应的研究也主要围绕以上解释展开乳酸杆菌是家禽肠道正常菌群中的主要优势菌 [13] 群, 尤其是在小肠占据绝对优势在乳酸杆菌发挥的众多益生作用中, 乳酸杆菌对肠道黏膜免疫 ( 包括天然免疫和获得性免疫 ) 的调节作用尤其引人关注乳酸杆菌可通过多种方式调节或维持肠道免疫功能, 包括提高肠道局部体液免疫应答即提高抗原 [14] 特异性分泌型 IgA 水平, 诱导上皮细胞黏液素基 [15] 因表达和分泌, 诱导上皮细胞细胞因子表达和分 [16 17] [18 19] 泌以及调节炎症信号分子表达乳酸杆菌通过黏附作用附着在肠黏膜上皮细胞表面, 与宿主细胞紧密接触甚至深入到细胞内并与之发生相互作用, 从而调节上皮细胞的生理功能和信号转 [20] [21] [22 23] 导 Wehkamp 等和 Schlee 等利用结肠癌细胞系 (Caco 2) 研究发现, 益生乳杆菌及其他益生菌在与上皮细胞相互作用过程中可通过诱导细胞抗菌肽 ( 防御素 ) 而提高机体天然免疫功能然而, 在现有的几项关于益生菌对肠道上皮细胞抗菌肽表达影响的研究报道中, 研究者所使用的肠道上皮细胞均为人结肠癌上皮细胞系显然, 癌上皮细胞与正常上皮细胞在细胞基本结构代谢和功能等特征方面存在一定的差异, 以癌细胞的研究结果来解释正常细胞的行为存在很大的局限性肠道抗菌肽除主要来源于上皮细胞外, 还来源于肠黏膜免疫细 [3] 胞此外, 益生菌在体内发挥作用受许多因素的影响, 如胃肠道 ph 环境消化酶和胆汁等均会影响益生菌的活力和细胞壁组分的完整性因此, 为避免这些复杂因素的干扰及肠道共生菌相互之间的影响, 本研究利用体外原代培养的正常鸡小肠上皮细胞研究了益生性鼠李糖乳酸杆菌对抗菌肽犃狏犅犇 9 基因表达的影响研究发现, 分离自健康鸡肠道的鼠李糖乳酸杆菌能够促进鸡小肠上皮细胞防御素犃狏犅犇 9 的表达研究表明 ( 未发表资料 ), 来源于健康鸡肠道的鼠李糖乳酸杆菌可 [24] 提高肉鸡的生产性能最近在鸡的试验中发现, 饲喂动物肠道来源的抗菌肽可提高鸡肠道黏膜上皮内淋巴细胞和 IgA 分泌细胞数量, 并可改善小肠黏膜结构, 增强小肠消化吸收能力综合这些试验结果以及本试验结果, 可推断益生性鼠李糖乳酸杆菌促进或诱导鸡肠道抗菌肽的表达可能是其发挥益生作用尤其是免疫促进作用的一种重要作用方式益生性鼠李糖乳酸杆菌通过上调鸡肠道抗菌肽如 AvBD9 表达而提高肠道天然免疫功能本研究 Westernblot 检测证实,AvBD9 肽可分泌至细胞外而发挥其生物学作用因此, 益生性乳酸菌可能通过诱导或促进肠道抗菌肽的表达在黏膜局部形成高浓度, 从而抑制和杀灭肠道有害菌并调节有益菌数量和种类以维持肠道微生态平衡同时, 肠道上皮细胞分泌的抗菌肽可作为细胞间的信号分子发挥多重免疫调节作用本试验发现, 热灭活的鼠李糖乳杆菌亦能促进鸡小肠上皮细胞抗菌肽 AvBD9 的表达, 且灭活菌刺激后肠上皮细胞犃狏犅犇 9 基因表达水平显著高于活菌刺激 ( 犘 <0.05) Schlee 等研究亦发现, 热灭活的益生乳杆菌亦可促进肠道上皮细胞抗菌肽 [22] ( 防御素 ) 基因表达益生菌的细胞组分自身亦可通过增强肠道抗菌肽表达而对宿主发挥益生作 [25] 用 Bu 等研究发现, 用溶菌酶处理来自人粪便有益菌犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狊狆.(ATCC53103) 所得的细胞壁组分能够被小肠吸收进入肝脏并被肝脏中的巨噬细胞吞噬, 口服该细菌细胞壁组分能够提高败血症大鼠肝脏清除细菌的能力并因此而有效降低败血症大鼠的死亡率, 这种保护效应是通过增强败血症大鼠肝脏和巨噬细胞抗菌肽 CRAMP(Cathelicidin relatedantimicrobialpeptide) 表达而介导的同样 [26 27] 地,Sakai 等研究发现, 益生性粪肠球菌 EC 12 细胞壁组分能够阻止抗万古霉素肠球菌在刚孵化后的鸡的肠道定植, 并可促进 5 日龄鸡舌头和法氏囊 β 防御素 2(AvBD2) 基因的表达, 肠道 β 防御素表达的提高是益生性粪肠球菌 EC 12 细胞壁组分抑制抗万古霉素肠球菌在肠道定植的主要作用机制之 [23] 一此外,Schlee 等研究表明, 益生菌犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻 Nissle1917 培养上清诱导人结肠癌细胞 (Caco 2 细胞 ) β 防御素 2(hBD 2) 表达的能力强于菌体, 存在于培养上清的鞭毛蛋白 (Flagelin) 是犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻 Nissle1917 诱导 hbd 2 表达的主要刺激因子研究发现热灭活乳杆菌也具有与活菌 [28] 相同的黏附能力, 甚至黏附能力高过活菌刺激灭活后乳酸杆菌对细胞黏附率增高, 可能和黏附素有关,65 灭活过程中, 乳酸杆菌中的黏附素样的

7 640 畜牧兽医学报 43 卷物质由于热刺激而被释放出, 这些黏附素能黏附肠道上皮细胞, 进而加强了益生菌与上皮细胞间的作用以上结果表明, 活的状态并不是益生菌发挥其益生作用的必需条件, 益生菌的免疫调节作用并非完全通过活益生菌与小肠上皮细胞的黏附作用而实现的, 益生菌的特定组成成分 ( 包括细胞壁组分和细菌分泌产物 ) 在促进抗菌肽的表达中发挥重要作用然而, 本试验中上调抗菌肽基因表达的鼠李糖乳杆菌特定组分的分离鉴定仍需进一步研究 4 结论本研究利用体外培养的鸡小肠上皮细胞模型, 从基因水平和蛋白质水平探讨了鼠李糖乳杆菌诱导或促进肠道正常抗菌肽 AvBD9 表达的可能性, 适宜浓度的鼠李糖乳杆菌可显著提高鸡正常上皮细胞抗菌肽 AvBD9 的表达, 且呈剂量和时间依赖性鼠李糖乳杆菌刺激后 AvBD9 蛋白可以分泌到细胞外, 发挥杀菌作用和其他生物学功能本研究结果有助于深入揭示益生菌调节肠道免疫功能的分子机制 from chicken liver [J]. 犑犘犲狆狋犛犮犻,2007,13: [8] WELLMAN LABADIE O,PICMANJ,HINCKE M T.Avianantimicrobialproteins:structure,distribu tionandactivity[j]. 犠狅狉犾犱犘狅狌犾狋狉狔犛犮犻犑,2007,63: [9] LYNN DJ,HIGGSR,LLOYD A T,etal.Avianbe ta defensinnomenclature:acommunityproposedup date[j]. 犐犿犿狌狀狅犾犔犲狋,2007,110: [10] 张辉华, 毕英佐, 曹永长, 等. 鸡 β 防御素 3 的克隆与诱导表达 [J]. 中国预防兽医学报,2006,28(4): [11] MA D Y,LIUS W,HANZX,etal.Expressionand characterizationofrecombinantgalinacin 9andgali nacin 8in 犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻 [J]. 犘狉狅狋犲犻狀犈狓狆狉犲狊犘狌狉犻犳,2008,58: [12] GALDEANO C M,VINDEROLA G,BONET M E B,etal.Proposed model:mechanismsofimmuno modulationinduced byprobioticbacteria [J]. 犆犾犻狀犞犪犮犮犻狀犲犐犿犿狌狀狅犾,2007,14: [13] 郭兴华. 益生菌基础与应用 [M]. 北京 : 北京科学技术出版社,2002: [14] MEDICIM,VINDEROLA C G,PERDIGON G.Gut 参考文献 : [1] ZASLOFF M.Antimicrobialpeptidesofmulticelular organisms[j]. 犖犪狋狌狉犲,2002,415: [2] DANNS M,ECKMANNL.Innateimmunedefenses intheintestinaltract[j]. 犆狌狉狉犗狆犻狀犌犪狊狋狉狅犲狀,2007, 23: [3] CUNLIFFE R N,MAHIDA Y R.Expressionand regulationofantimicrobialpeptidesinthegastrointes tinaltract[j]. 犑犔犲狌犽狅犮狔狋犲犅犻狅犾,2004,75: [4] LYNN DJ,HIGGSR,GAINESS,etal.Bioinformat icdiscoveryandinitialcharacterizationofninenovel antimicrobialpeptidesgenesinthechicken [J]. 犐犿犿狌狀狅犵犲狀犲狋犻犮狊,2004,56: [5] XIAO Y,HUGHESA L,ANDOJ,etal.Agenome widescreenidentifiesasingleβ defensingenecluster inthechicken:implicationsfortheoriginandevolu tionof mammaliandefensins [J]. 犅犕犆犌犲狀狅犿犻犮狊, 2004,5: [6] XIAOY,CAIY,BOMMINENIYR,etal.Identifica tionandfunctionalcharacterizationofthreechicken cathelicidinswithpotentantimicrobialactivity [J]. 犑犅犻狅犾犆犺犲犿,2006,281: [7] LIG H,MINEY,HINCKE M T,etal.Isolationand characterizationofantimicrobialproteinsandpeptide mucosalimmunomodulationbyprobioticfreshcheese [J]. 犐狀狋犇犪犻狉狔犑,2004,14: [15] CABALLERO FRANCO C,KELLER K,DESIMO NEC,etal.TheVSL#3probioticformulainduces mucingeneexpressionandsecretionincolonicepithe lialcels [J]. 犃犿犑犘犺狔狊犻狅犾犌犪狊狋狉犔,2007,292: G [16] GALDEANOC M,PERDIGON G. The probiotic bacteriumlactobaciluscaseiinducesactivationofthe gutmucosalimmunesystemthroughinnateimmunity [J]. 犆犾犻狀犞犪犮犮犻狀犲犐犿犿狌狀狅犾,2006,13: [17] PATURIG,PHILLIPS M,JONES M.Immuneen hancingefectsof 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊犪犮犻犱狅狆犺犻犾狌狊 LAFTI L10and 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾狌狊狆犪狉犪犮犪狊犲犻 LAFTIL26in mice [J]. 犐狀狋犑犉狅狅犱犕犻犮狉狅犫犻狅犾,2007,115: [18] OTTEJM,PODOLSKYDK.Functionalmodulation ofenterocytes by gram positive and gram negative microorganisms[j]. 犃犿犑犘犺狔狊犻狅犾犌犪狊狋狉狅犻狀狋犲狊狋犔犻狏犲狉犘犺狔狊犻狅犾,2004,286:G [19] PAGNINIC,SAEEDR,BAMIASG,etal.Probiotics promoteguthealththroughstimulationofepithelial innateimmunity [J]. 犘狉狅犮犖犪狋犾犃犮犪犱犛犮犻犝犛犃, 2010,107: [20] PETRA W,DARAB G,JRGEN S,etal.Molecular

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BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,2018 & X R( + 1, 1, < 1,=> 3 (1. E^ IFTU ^,NO ; 2.NO\ ^,NO ;3.NO B`a -

$BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,2018 & X R( + 1, 1, < 1,=> 3 (1. E^ IFTU ^,NO ; 2.NO\ ^,NO ;3.NO B`a -$ 383 0186 BuletinofSoiland WaterConservation Vol.38,No.3 Jun.,018 & X R( + 1, 1, < 1,=>,?@A 3 (1. E^ IFTU ^,NO 730070;.NO\ ^,NO 730070;3.NO B`a -[/H,NO 730000) -.:[# ] _D5 & % I /, + -. I P+- [ ] ( 犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿

4 期 黎观红等 : 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响 635 pernatantsofculturedepithelialcelstreated with 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊,indicatingthatAvBD9 peptidereleasesint

4 期黎观红等 : 鼠李糖乳酸杆菌 LGA 对鸡小肠上皮细胞 β 防御素 9 基因表达的影响 635 pernatantsofculturedepithelialcelstreated with 犔. 狉犺犪犿狀狅狊狌狊,indicatingthatAvBD9 peptidereleasesint