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1 生态学杂志 Chinese Journal of Ecology 2015,34(7): 多个环境因素对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响 1,2 陆春云 2 习丙文 3 叶诗尧 2 梁利国谢 1,2 骏 ( 1 南京农业大学无锡渔业学院, 江苏无锡 ; 2 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室, 江苏无锡 ; 3 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 ) 摘要采用正交试验 L 16 ( ) 设计检验了养殖环境中多种理化因子 ( 温度 ph 分子氨亚硝酸盐 ) 对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响试验设立温度 (A)4 个水平 ( );ph(b)2 个水平 ( ); 分子氨 (C)2 个水平 ( mg L -1 ) 和亚硝酸盐 (D)2 个水平 ( mg L -1 ), 每组试验鱼分别注射嗜水气单胞菌 10 6 CFU ml -1 ; 以试验鱼存活时间的长短判断嗜水气单胞菌对团头鲂致病力的大小结果表明 : 分子氨与 ph 的交互作用 ( B C) 和温度 ( A) 因素分别对嗜水气单胞菌致病力影响极其显著 ( F > F 0.01 ),ph(b) 对嗜水气单胞菌致病力影响显著 (F >F 0.05 ), 而亚硝酸盐 (D) 和分子氨 (C) 对嗜水气单胞菌致病力的影响不显著 ; 团头鲂存活时间 y( 单位为 h) 与环境因子间的多元线性回归方程为 y = A B (B C); 根据该线性回归方程, 当温度为 20 ph = 8.0 分子氨浓度为 0.02 mg L -1 时, 嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力最弱, 鱼体的存活时间最长 ( h) 本实验结果可为团头鲂养殖中的嗜水气单胞菌出血病防控预警提供一定的参考关键词团头鲂 ; 嗜水气单胞菌 ; 致病力 ; 环境因子中图分类号 S963 文献标识码 A 文章编号 (2015) Effects of environmental factors on the virulence of Megalobrama amblycephala infected with Aeromonas hydrophila. LU Chun yun 1,2, XI Bing wen 2, YE Shi yao 3, LIANG Li guo 2, XIE Jun 1,2 ( 1 College of Fisheries, Nanjing Agricultural University, Wuxi , Jiangsu, China; 2 Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Labo ratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Wuxi , Jiangsu, China; 3 College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai , China). Chinese Journal of Ecology, 2015, 34(7): Abstract: To detect the effects of environmental factors ( temperature, ph, ammonia, and ni trite) on the virulence of Megalobrama amblycephala infected with pathogen Aeromonas hydrophi la, an experiment was conducted based on the orthogonal design L 16 ( ). The water tempera ture (A) was designed with four levels, 20, 24, 28, and 32 ; ph (B), ammonia (C) and nitrite (D) were set with two levels respectively: 6.5 and 8.0 for ph, 0.02 and 0.04 mg L -1 for ammonia, and 0.1 and 0.3 mg L -1 for nitrite. The virulence strength of M. amblycephala infec ted with A. hydrophila was determined by the fish survival time. The results showed that the inter active effect of ph and ammonia nitrogen (B C), as well as temperature (A) significantly im pacted the virulence of M. amblycephala infected with A. hydrophila (F>F 0.01 ), the effect of ph (B) was significant (F>F 0.05 ), while the effects of ammonia nitrogen (C) and nitrite (D) were not significant. Based on the statistical analysis, the fish survival time y ( h) presented a signifi cant linear correlation with environmental factors ( temperature, ph and ammonia nitrogen), i.e., y = A B ( B C). According to the equation, M. amblycephala 国家大宗淡水鱼类产业技术体系项目 (CARS 46) 和国家科技支撑计划项目 (2012BAD25B07) 资助通讯作者 E mail: xiej@ ffrc.cn 收稿日期 : 接受日期 :

2 2026 生态学杂志第 34 卷第 7 期 shows weakest virulence to A. hydrophila infection and can survive longest time ( h) when the temperature is 20, ph = 8.0 and ammonia nitrogen 0.02 mg L -1. The experimental results provide reference for the prevention and control warning of hemorrhagic disease caused by A. hy drophila in M. amblycephala breeding. Key words: Megalobrama amblycephala; Aeromonas hydrophila; virulence; environmental fac tors. 嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 隶属于气单胞菌科 ( Aeromondaceae ) 气单胞菌属 ( Aero monas), 是有运动能力且嗜温的革兰氏阴性菌 ( 陆承平,1992) 该菌广泛存在于自然界尤其是水环境中 ( 饶静静等,2007), 是人畜和鱼共患的条件性致病菌 ( 单晓枫等,2010; 梁利国等,2013), 同时也是细菌性败血症的主要病原菌 ( 张美超等,2011) 团头鲂 ( Megalobrama amblycephala) 俗名武昌鱼, 是中国淡水养殖的主要品种之一, 近年来随着大规模高密度集约化养殖, 团头鲂的发病趋势日益严峻, 尤其是嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症, 给养殖带来了非常严重的经济损失 ( 姚伦等,2009; 郭松林等,2011) 嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力, 除病原菌自身的毒力因子外 ( 朱大玲等,2006), 还受到外界环境温度 ph 分子氨和亚硝酸盐浓度等因子的影响 (Vilches et al.,2004;bi et al.,2007) 如, 同样培养条件下嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶分泌量在 28 明显大于 4 ~ 25 ( 储卫华等,2001) 目前关于 ph 分子氨和亚硝酸盐等单因素对水产动物的毒性以及病原嗜水气单胞菌的生长条件和毒力因子表达的影响有较多报道 ( 余瑞兰等, 1999; 李波等, 2009), 然而, 温度 ph 分子氨和亚硝酸盐等多因子条件下嗜水气单胞菌对鱼体致病力的研究鲜有报道在养殖中, 疾病发生往往受到多种因素的影响因此, 本试验尝试探讨在不同的温度 ph 分子氨和亚硝酸盐等条件下嗜水气单胞菌对团头鲂致病力的影响, 为养殖中的嗜水气单胞菌出血病防控预警提供参考 1 材料与方法 1 1 试验材料团头鲂来自中国水产科学院淡水渔业研究中心南泉养殖基地, 鱼体规格为 (400±7) g, 驯养 7 d 后, 挑选健康个体作为试验用鱼 1 2 正交试验设计试验共设置温度 ph 分子氨和亚硝酸盐浓度 4 个因素由于温度是池塘中诱发鱼体发病的主要影响因素 ( 许友卿等,2010), 所以选取 4 个水平, 以夏季池塘平均水温 32 为最高水平, 以 20 为最低水平其余 3 个因素均选择高低两个水平其中温度设置和 32 共 4 个水平 ;ph 设置 6.5 和 8.0 两个水平 ; 分子氨浓度设置 0.02 和 0.04 mg L -1 两个水平 ; 亚硝酸盐浓度设置 0.1 和 0.3 mg L -1 两个水平选取正交表 L 16 ( ) 共设计 16 组进行试验 ( 表 1), 每组一个水族箱 ( 容积 120 L, 试验时加入 100 L 曝气自来水 ), 每个水族箱 10 尾鱼实验重复 2 次, 每次为期 7 d 试验水族缸的水温通过加热棒调节,pH 采用盐酸和氢氧化钠调节, 调节后的 ph 温度用探头直接测定 ; 亚硝酸盐浓度采用亚硝酸钠调节, 使用化学方法测定通过重氮化偶反应, 利用显色剂与水样结合, 测定其吸光值来判断亚硝酸盐的浓度大小 ( 史彩华等,2008); 氨氮采用氯化铵调节, 氨氮则主要指水中对鱼类有毒害作用的分子氨, 目前还没有直接测定水中分子氨的方法一般测定分子氨的含量是先测定总铵, 根据当时的 ph 和水温, 再由下述 2 个公式 (El Mashad et al.,2004) 求得 : 表 1 试验设置 Table 1 Experimental design 实验组温度 ( ) ph 分子氨亚硝酸盐

3 陆春云等 : 多个环境因素对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响 2027 Pka = T + 式中, Pka 为 NH 4 解离常数的负对数, T 为水温 (, 适用范围 5 ~ 30 ), 分子氨 (mg L -1,NH 3 N) = 总铵 (mg L -1,NH + 4 N) [1+10 (Pka-pH) ] 感染方法调试好各组试验水体指标后, 将试验用团头鲂从暂养池捞出并迅速使用麻醉剂三卡因甲基磺酸盐 (MS 222,200 mg L -1 ) 将鱼麻醉, 腹腔注射嗜水气单胞菌 (WJ 8, 由本实验室分离保存自发病团头鲂 ) ( 夏飞等,2012), 浓度为 10 6 CFU ml -1, 注射后将鱼放进准备好的 16 个试验水族箱 1 4 养殖管理和数据处理试验期间每天投喂团头鲂配合饲料 1 次, 早晚清污 1 次, 每 24 h 换试验用水 1 次, 换水量为试验用水总量的 1 / 3, 每组试验用水参照试验方案表 1 即时配制, 试验过程始终保持充氧出现发病死亡的鱼及时移走, 并记录其存活时间 ( 注射攻毒后到死亡时的时间间隔 ) 1 5 数据处理试验数据均用 SPSS 18.0 统计软件进行统计分析温度 ph 分子氨亚硝酸盐浓度以及 ph 与分子氨交互作用温度与分子氨交互作用对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病的影响显著性采用方差分析 ; 各因素对嗜水气单胞菌感染下鱼体存活时间的线性相关关系通过多元线性回归方程进行模型分析 2 结果与分析 2 1 各组团头鲂平均存活时间团头鲂存活时间为注射攻毒后到死亡时的时间间隔, 若试验结束尚未死亡, 则以注射后到试验结束时的时间间隔为存活时间多个环境因素下团头鲂的平均存活时间见表 2 第 1 次试验结束时 ( 168 h), 各组团头鲂存活时间不尽相同, 其中, 第 9 组平均存活时间最短, 为 9 h, 其次是第 14 组的 17 h 和第 13 组的 25.8 h, 其余各组团头鲂平均存活时间都较长 ; 第 2 次试验结束时 (168 h), 各组团头鲂存活时间也不尽相同, 其中, 平均存活时间最短的是第 13 组的 19 h, 其次是第 14 组的 23 h 和第 9 组的 31 h, 其余各组团头鲂平均存活时间都较长 2 2 各因素对团头鲂平均存活时间的影响计算各因素各水平下总平均存活时间的平均值, 用同一因素下最大的平均值减去最小的平均值, 得到该因素下的极差, 各因素下极差的大小分别为温度 h,ph h, 分子氨 h, 亚硝酸盐 h 根据所得数据可得出各因素对团头鲂存活时间大小的影响顺序为温度 >ph> 亚硝酸盐 > 分子氨以因素水平为横坐标, 以平均存活时间为纵坐标可得图 1 由图 1 可知, 温度在 20 ~ 32 范围内, 随着温度的升高, 团头鲂的平均存活时间逐渐变小 ; 在试验表 2 不同处理组团头鲂平均存活时间 Table 2 Mean survival time of Megalobrama amblycephala in different treatment groups 实验组样本数 1 批 2 批温度 ( ) ph 分子氨亚硝酸盐 y 1 和 y 2 分别表示第 1 次和第 2 次试验各组团头鲂存活平均时长 ( 单位为小时 ), y 为两组数据的平均值 y 1 y 2 y

4 2028 生态学杂志第 34 卷第 7 期 3 讨论图 1 不同因素水平下团头鲂平均存活时间 Fig.1 Mean survival time of Megalobrama amblycephala in different levels of different factors 范围内, 高水平 ph 下团头鲂平均存活时间大于低水平 ph; 低水平分子氨和亚硝酸盐浓度下团头鲂存活时间大于高水平浓度 2 3 分析多因素与团头鲂存活时间的多元线性回归由显著性检验结果 ( 表 3) 可知, 嗜水气单胞菌对团头鲂致病力的大小跟温度 ph 和 ph 与分子氨的交互影响有关以此为主因素对鱼体存活时间建立多元线性回归模型, 经逐步分析得到线性回归方程如下 : y = A B ( B C) 式中,y 为团头鲂平均存活时间,A 为温度,B 为 ph,b C 代表 ph 和氨氮的交互作用 A 的取值范围是 20 ~ 32,B 的取值范围是 6.5 ~ 8.0,C 的取值范围是 0.2 ~ 0.4 mg L -1 该线性回归方程的显著性检验 ( F 检验 ) 的 F 值 (4.61) >F 0.05 因此, 温度 ph ph 和氨氮的交互作用对团头鲂的平均存活时间存在较好的线性关系根据该方程推导得出在试验范围内, 当温度 = 20 ph = 8.0 分子氨浓度为 0.02 mg L -1 时, 嗜水气单胞对团头鲂的致病力最弱, 鱼体的存活时间最长为 h 表 3 方差分析表 Table 3 Variance analysis table 方差来源离差平方和自由度均方 F 值 F 临界值 A B C D B C A C A B C 和 D 分别代表温度 ph 分子氨和亚硝酸盐浓度因素 P<0.05; P<0.01 嗜水气单胞菌对水产养殖动物危害极大, 特别是其引起的细菌性败血症给团头鲂的养殖造成了重大的经济损失在水产养殖过程中, 温度 ph 分子氨和亚硝酸盐等因子的变化显著影响鱼体生长和抗病力 (Mikkelsen et al.,2006), 同时也影响着嗜水气单胞菌的致病力 ( 孙建和等,1999;Gonz lez Serrano et al.,2002) 本试验的多因素分析结果进一步表明, 温度对嗜水气单胞菌的致病力具有显著性影响 (F 值 > 临界值 ) 根据线性回归方程 y = A B (B C) 可知, 在其他因素不变的情况下, 温度在 20 ~ 32, 温度越高鱼体存活时间越短, 即嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力越强孙翰昌等 (2008) 研究结果表明, 在 ph = 7 的条件下气单胞菌的生长速度从 20 到 37 是逐渐增大的趋势 ;Tsai 等 (1997) 发现, 嗜水气单胞菌在都可以产生血溶素和细胞毒素, 且温度越高其产生的血溶素和细胞毒素越多 ; 其他毒力因子, 如溶血素气溶素外膜蛋白粘附素在和 37 都能高效表达, 在 4 时少量表达或不表达 ( 胡靖等,2006) 其研究结果与本试验所得结论相似, 即在一定范围内, 嗜水气单胞菌的致病力随着温度的升高而增强本试验结果表明, 在其他条件不变的情况下, 嗜水气单胞菌的致病力随着 ph(6.5 ~ 8.0) 的升高而减弱, 且变化显著储卫华等 (2001) 研究也发现,pH 趋于 6.5 时嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶表达量最高,pH 过高或过低都不利于胞外蛋白酶的表达此外, 本试验还发现,pH 与分子氨的交互作用对嗜水气单胞菌致病力的影响极显著根据线性回归方程可知, 当其他因素不变的情况下,pH 取最小值, 分子氨浓度取最大值时, 嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力最强目前, 国内关于二者交互作用下对嗜水气单胞菌致病力的研究尚未见报道, 大多是单一因素下某一变量对嗜水气单胞菌的影响, 胡靖等 (2006) 研究发现 ph = 7 时嗜水气单胞菌的毒力因子血溶素和气溶素表达量最大 ; 周显青等 (2003) 认为, 在 ph 较小的酸性水体, 能引起中华鳖血液中的补体 C3 和 C4 含量下降, 从而降低了其血清的溶菌活力和杀菌活力 ;ph 对分子氨的影响, 罗杰等 (2010) 发现在水中分子氨的毒性随着 ph 的升高而增强根据线性回归方程 y = A +

5 陆春云等 : 多个环境因素对嗜水气单胞菌感染团头鲂致病力的影响 B (B C) 可知, 嗜水气单胞菌的致病力与温度 ( A) ph( B) 和 ph 与分子氨的交互作用 (B C) 具有显著关系, 而单独的分子氨和亚硝酸盐胁迫则对嗜水气单胞菌的致病力没有显著影响一方面可能与水环境中无机氮 NH 4 + 能抑制气单胞菌胞外蛋白酶的产生有关 (Liu et al.,1969), 另一方面可能与实验用水缸不断充氧有关 Thurston 等 (1981) 和 Meade(1985) 研究证实,NH 3 的毒性随着溶解氧浓度的升高而降低 ; 曲克明等 (2007) 提出, 在水产动物养殖过程中向水体中充氧可以提高机体对非离子氨和亚硝酸盐的耐受力试验过程不断供氧, 这可能既降低了分子氨和亚硝酸盐对团头鲂机体的毒害作用, 同时也抑制了嗜水气单胞菌对团头鲂的致病力试验通过模拟养殖环境下的不同温度 ph 分子氨亚硝酸盐等多种环境因素下嗜水气单胞菌对团头鲂致病力的影响, 统计分析并建立了上述环境因素与病原菌致病力的线性回归方程试验结果与前期文献中单因素研究结果较为吻合, 因此, 该数学模型方程式可以适用于团头鲂养殖中的嗜水气单胞菌细菌性败血症防控预警参考参考文献储卫华, 陆承平培养条件对嗜水气单胞菌胞外蛋白酶合成与分泌的影响. 南京农业大学学报, 24(3): 郭松林, 冯建军, 熊静, 等嗜水气单胞菌在欧洲鳗鲡体内的免疫组织化学定位与病理观察. 华中农业大胡学学报, 30(4): 靖, 李爱华, 胡成钰, 等温度和 ph 值对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响. 南京理工大学学报, 30(3): 李波, 樊启学, 张磊, 等不同溶氧水平下氨氮和亚硝酸盐对黄颡鱼的急性毒性研究. 淡水渔业, 39(3): 梁利国, 谢骏青鱼病原嗜水气单胞菌分离鉴定毒力因子检测及药敏试验. 生态学杂志, 32(12): 陆承平致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述. 水产学报, 16(3): 罗杰, 杜涛, 刘楚吾, 等不同盐度 ph 条件下氨氮对管角螺稚贝毒性影响. 动物学杂志, 45(3): 曲克明, 徐勇, 马绍赛, 等不同溶解氧条件下亚硝酸盐和非离子氨对大菱鲆的急性毒性效应. 海洋水产研究, 28(4): 饶静静, 李寿崧, 黄克和, 等致病性嗜水气单胞菌多重 PCR 检测方法的建立. 中国水产科学, 14(5): 单晓枫, 郭伟生, 陈畅, 等嗜水气单胞菌检测技术研究进展. 动物医学进展, 31(5): 史彩华, 王凯华, 李志新水中亚硝酸盐含量测定. 安徽农业科学, 36(33): 孙翰昌, 杨帆, 邹莹, 等部分环境因子对肺炎克雷伯氏菌和温和气单胞菌生长的影响. 安徽农业科学, 36(27): 孙建和, 严亚贤, 陈怀青, 等温度对嗜水气单胞菌外膜蛋白表达的影响. 中国兽医学报, 19(6): 夏飞, 梁利国, 谢骏团头鲂病原嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验. 水产科学, 31(10): 许友卿, 曹占旺, 丁兆坤, 等高温对鱼类的影响及其预防研究. 水产科学, 29(4): 姚伦, 吴小平, 欧阳珊, 等团头鲂对嗜水气单胞菌的免疫应答. 湖北农业科学, 48(2): 余瑞兰, 聂湘平, 魏泰莉, 等分子氨和亚硝酸盐对鱼类的危害及其对策. 中国水产科学, 3(6): 张美超, 曹雅男, 姚斌, 等淬灭酶 AiiO AIO6 酶学性质及对嗜水气单胞菌毒力因子的表达调控. 水产学报, 35(11): 周显青, 牛翠娟, 孙儒泳, 等维生素 C 和酸应激对中华鳖幼鳖血清补体 C3 和 C4 含量的影响, 动物学报, 49(6): 朱大玲, 李爱华, 汪建国, 等嗜水气单胞菌毒力与毒力基因分布的相关性. 中山大学学报, 45(1): Bi ZX, Liu YJ, Lu CP Contribution of AhyR to virulence of Aeromonas hydrophila J 1. Research in Veterinary Sci ence, 83: El Mashad HM, Zeeman G, VanLoon WKP, et al Effect of temperature and temperature fluctuation on thermophilic anaerobic digestion of cattle manures. Bioresource Technolo gy, 95: Gonz lez Serrano CJ, Santos JA, García L pez ML, et al Virulence markers in Aeromonas hydrophila and Aeromonas veroniibiovarsobria isolates from freshwater fish and from a diarrhoea case. Journal of Applied Microbiology, 93: Liu PV, Hsieh HC Inhibition of protease production of various bacteria by an ammonium salts: Its effect on toxin production and virulence. Journal of Bacteriology, 99: Meade JW Allowable ammonia for fish culture. The Pro gressive Fish Culturist, 47: Mikkelsen H, Lindenstrøm T, Nielsen ME Effects of temperature on production and specificity of antibodies in rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss). Journal of the World Aquaculture Society, 37: Thurston RV, Russo RC, Vinogradov GA Effect of ph on the toxicity of the unionized ammonia specie. Environmental Science and Technology, 15: Tsai GJ, Tsai FC, Kong ZL Effects of temperature, me dium composition, ph, salt and dissolved oxygen on hae molysin and cytotoxin production by Aeromonas hydrophila isolated from oyster. International Journal of Food Microbi ology, 38: Vilches S, Urgell C, Merino S, et al Complete type Ⅲ secretion system of amesophilic Aeromonas hydrophila strain. Applied and Environmental Microbiology, 70: 作者简介陆春云, 男,1987, 硕士研究生, 研究方向为水产动物病害学 E mail: luchunyun1987@ sina.cn 责任编辑李凤芹

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32期中国农学通报 2014,30(32):38-42 Chinese Agricultural Science Bulletin 中草药饲料添加剂对黄鳝性激素含量的影响 1,2 1,2 1,2 2 赵庆凯, 丁炜东, 邴旭文, 王建新 ( 1 南京农业大学无锡渔业学院, 江苏无锡 214081; 2 中国水产