吉林省科技发展计划项目申报书19817

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糊胃罕
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1 计划类别 : 项目类别 : 支持重点 : 管理处室 : 科技创新人才培育计划青年科研基金项目医药科学计划处项目名称 : 申报主持单位 ( 盖章 ): 项目负责人 : 通讯地址 : 华蟾酥毒基诱导非小细胞肺癌凋亡的作用机制研究吉林大学张广鑫吉林长春市自强街 218 号吉林大学第二医院胸外科固定电话 : 移动电话 : 传真 : 邮编 : 电子邮箱 : zhangguangxin_409@163.com 填报日期 : 吉林省科学技术厅二 O 一二年八月制

2 一申报项目基础信息项目名称华蟾酥毒基诱导非小细胞肺癌凋亡的作用机制研究项目所属学科基础医学项目所属专业医学分子生物学经费预算总额 10.0 万元, 其中申请经费 10.0 万元起止年限至申报主持单位项目负责人申报参加单位 1 申报参加单位 2 名称吉林大学所在南关区地通讯地址吉林长春市自强街 218 号吉林大学第二医院邮编单位类别企业科研机构高等院校事业单位其它帐号开户银行隶属中直省直其它吉林长春市中国银行长春前进大街支行姓名张广鑫性别男出生年月学历研究生学位博士身份证号职务医师职称中级电话工作单位吉林大学第二医院邮箱 zhangguangxi 409@163.com 名称所在地联系人帐号电话开户银行名称所在地联系人帐号电话开户银行基于肿瘤细胞特异性靶点开发新的化疗药物成为现阶段针对 NSCLC 的临床治疗函待解决的项目简介 ( 研重要问题促分裂素原活化蛋白激酶 (MAPK) 链是真核生物信号传递网络中的重要途径之发内容拟解一, 在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用, 在肿瘤细胞中常常过度激活在决关键技术 MAPK 家族中,ERK 被认为是与细胞增殖转化和分化相关的 MAPK 华蟾酥毒基预期技术经 (CG) 是蟾酥的主要化合物之一, 研究发现其对多种癌细胞具有抗肿瘤特性, 然而在抗济指标等肺癌治疗方面的作用及分子机制尚未见报道本项目利用小分子药物 CG 作用于 NSCLC 细 )(400 字以内胞株, 通过流式细胞术及蛋白免疫印迹技术研究 CG 对 MEK/ERK 通路的影响, 并通过体内实验验证其抗癌活性, 从而系统全面的探讨小分子药物 CG 抑制 NSCLC 增殖的分子机制 ), 为临床筛选新的抗癌药物提供一个新靶点预期成果新产品新品种新工艺新装置新材料技术标准 ( 国际标准国家标准行业标准企业标准 ) 专利计算机软件论文论著研究报告其它预期专利授权获得国外发明专利 0 项, 国内专利 0 项, 其中发明专利 0 项成果预期作用形成自主研发能力突破关键技术试点示范规模生产推广应用提高经济效益其它第 1 页

3 二申报项目内容概况 (1) ( 一 ) 立项的必要性 (150 字以内 ) 非小细胞肺癌 (NSCLC) 是最常见的肺癌病理类型, 但绝大多数患者在诊断时已失去了手术治疗机会, 且对放疗和化疗不敏感, 而以 EGFR-TKI 为代表的靶向化疗药物易发生的耐药现象严重制约着化疗药物的应用因此, 基于肿瘤细胞特异性靶点开发新的化疗药物成为现阶段针对 NSCLC 的临床治疗函待解决的重要问题 ( 二 ) 相关技术国内外发展现状与趋势 (150 字以内 ) 传统中药的小分子化合物对 NSCLC 的抑制作用成为近年来研究的热门随着不断深入的研究, 中药小分子单体及化合物诱导肿瘤细胞凋亡, 已成为肿瘤治疗的一个新策略, 既可深入研究抗肿瘤药物的作用机制, 还可与化疗药物联合使用, 提高肿瘤对化疗药物的敏感性, 减少毒副作用, 为提高 NSCLC 患者的治疗效果提供了新的希望 ( 三 ) 前期工作基础 1 申报单位和项目负责人前期所开展的相关研究工作(200 字内 ); 吉大二院中心研究室配有 SPF 级动物房, 配备从事细胞生物学以及分子生物学等研究设备, 已具备确保该课题顺利完成的所有实验设备条件项目负责人一直致力于肺癌的科研工作, 已获得博士学位, 本项目组共有 6 名博士研究生参与, 有充足的人力资源保证在前期研究工作中, 我们已建立完善的功能学检测平台, 如 MTT 流式细胞分析 Transwell 实验等, 以及 Western Blot 等分子生物学平台, 可以物信息学手段及统计学分析, 对数据进行综合处理 2 前期研究所取得的进展和阶段性成果 (200 字以内 ) 针对本课题, 我们在前期研究中发现, 小分子药物华蟾酥毒基 (CG) 可显著抑制非小细胞肺癌 (NSCLC) 的增殖, 并呈时间及浓度依赖性流式细胞术检测发现 CG 还具有诱导 NSCLC 凋亡的作用, 同时激活线粒体途径, 降低线粒体膜电位, 增加细胞内活性氧水平然而, 其抗肿瘤作用的分子机制尚需进一步研究 ( 四 ) 研究 ( 开发 ) 内容和拟解决的关键技术问题 1 研究( 开发 ) 内容 (400 字以内 ) (1)MTT 实验检测华蟾酥毒基 (Cinobufagin,CG) 对四种 NSCLC 细胞系的生长抑制作用 (2) 流式细胞术检测 CG 对 NSCLC 的凋亡诱导作用及对细胞周期的影响 (3) 流式细胞术检测 CG 对 NSCLC 细胞内线粒体膜电位和细胞内活性氧水平的影响 (3) 蛋白免疫印迹技术检测 CG 对 MEK/ERK 信号通路及 Akt 信号通路的影响通过对磷酸化蛋白水平的检测, 验证抑制肿瘤细胞内一条信号转导通路是否激活另一条信号转导通路 (4) 建立小鼠非小细胞肺癌模型, 通过体内实验验证 CG 对 NSCLC 细胞的抗肿瘤作用 2 拟解决的关键技术(400 字以内 ) (1) 流式细胞术 : 检测 CG 对 NSCLC 细胞的凋亡的诱导作用 (2)Westem Blot 蛋白免疫印迹技术 : 检测 CG 对 MEK/ERK 信号通路及 Akt 信号通路的影响对路内磷酸化蛋白水平变化的检测, 如 Akt 通路 p-akt (S473)/(T308) p-gsk-3-b(s (S241) 等 MAPK 通路 MEK1/2 p-mek1/2(ser217/221) p44/42mapk p44/42mapk(erk1/2)(thr202/tyr204) Mcl-1 等 (3) 动物实验模型的建立 : 同时失活 Pten 和 Lkb1 基因可以导致多种组织学类型的肺癌, 选取特定组织学分型的肺癌模型作为实验模型进一步研究 CG 对 NSCLC 细胞的抗癌活性第 2 页

4 二申报项目内容概况 (2) ( 五 ) 实施方案 1 技术路线(600 字以内 ) 1 ) 四种 NSCLC 细胞系的体外培养 ; 2 )MTT 实验 :CG 对 NSCLC 药物作用的时间量效曲线及浓度量效曲线, 计算出不同细胞株的 IC50 值, 进后续实验研究 ; 3 ) 流式细胞术检测凋亡 :Annexin V-PI 双染检测细胞内凋亡的变化 4 ) 流式细胞术检测细胞周期 :PI 细胞周期检测试剂盒检测细胞周期的变化 5 ) 流式细胞术检测线粒体膜电位 :DCFH-DA 染色检测细胞线粒体膜电位的改变 6 ) 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 :Rh-123 染色检测细胞内活性氧水平的改变 7 )Western Blot 蛋白免疫印迹 : 检测 MAPK 通路的磷酸化水平及 Akt 通路磷酸化水平, 及其上下的影响 8 ) 体内实验 : 裸鼠荷瘤实验在体内水平检测 CG 的抗癌作用 2 实施方案( 组织方式产学研合作机制等 )(200 字以内 ) 严格按照项目计划实施, 依时间进度完成相应的任务及目标项目负责人负责项目的具体分工及实施, 并定期召集参与人进行交流研讨, 共同商讨解决项目实施过程中遇到的问题并且每个阶段都进行总结, 做出下一步更详尽的计划, 合理调整时间和实验内容, 按质按量的完成本项目 ( 六 ) 预期成果及指标 1 预期技术指标(200 字以内 ) 应用流式细胞术蛋白电泳技术等技术手段, 在体外水平揭示华蟾酥毒基在诱导非小细胞肺癌凋亡过程中的分子机理 ; 通过动物实验进一步验证华蟾酥毒基对非小细胞肺癌恶性表型的抑制作用, 为华蟾酥毒基的抗肿瘤机制研究开辟新的研究领域, 可能为肺癌的治疗提供一个合理的新方法 2 预期经济指标 (100 字以内 ) 无 3 预期产业应用前景和社会生态效益(100 字以内 ) 本实验拟通过研究 CG 调控 MEK/ERK 信号通路诱导人 NSCLC 细胞凋亡的分子机制, 为肺癌的个体化治疗及寻找最佳靶向治疗方案提供坚实的理论依据此外,MEK/ERK 作为肺癌细胞内 CG 新的作用靶点, 为 CG 的抗肿瘤活性开辟了新的研究领域 4 成果提供形式 ( 授权专利技术标准新技术新产品新装置论文专著的数量等 )(100 字以内 ) 发表 SCI 收录文章 1 篇 5 人才队伍建设 ( 培养博士硕士数等 )(100 字以内 ) 拟培养 1 名博士研究生通过本项目, 参与本课题的博士研究生可以掌握基本的实验原理和操作技能, 包第 3 页

5 括细胞培养细胞表型功能实验动物实验流式细胞术及 Western 定坚实基础 Blotting 等, 为日后的临床科研第 4 页

6 三项目团队构成项目负责人简介 ( 参与过的主要研究开发和成果转化项目及任务分工, 授权发明专利, 在国内外核心期刊上发表的代表性学术论文等研究成果情况 )(350 字以内 ): 毕业于吉林大学第二医院, 从事抗肺癌天然小分子药物的研究, 已发表 SCI 论文四篇, 第一作者一篇, 第四作者两篇, 第六作者一篇 Guangxin Zhang, Mei Sun, Yifan Zhang, Peiyan Hua, Ra G1/G0 Phase Arrest and Mitochondria-mediated Apoptos Oncology Letters. 2015,10: IF: 项目负责人姓名性别年龄所在单位及部门职称现从事专业在本项目中承担的主要工作张广鑫男 29 吉林大学第二医院医师胸外科细胞培养及动物实验数据处理及统计学分析主要参加人王一存女 29 滑佩言男 26 参加人员田欣女 26 宋哥男 25 吉林大学第二医院吉林大学第二医院吉林大学第二医院吉林大学第二医院讲师分子生物学分子生物学实验博士生胸外科 MTT 实验及流式细胞术博士生心血管外科 Western Blotting 实博士生胸外科动物实验第 5 页

7 四经费预算表单位 : 万元序号科目名称合计申请经费自筹经费申报单位参加单位 1 一经费支出合计 ( 一 ) 直接费用设备费 (1) 购置设备费用 (2) 原设备升级改造费用 (3) 设备租赁费 (4) 非标设备 ( 试验装置 ) 试制费材料费测试化验检验试验加工费燃料动力费差旅费会议费国际合作与交流费出版/ 文献 / 信息传播 / 知识产权事务费劳务费专家咨询费其它支出 ( 二 ) 间接费用房屋租赁费水电费暖消耗费绩效支出其它支出二经费来源合计申请专项经费资助 / / 26 2 自筹经费来源 0.0 / (1) 其它财政拨款 0.0 / (2) 单位自有资金 0.0 / (3) 其它资金 0.0 / 第 6 页

8 五年度计划安排 (1) 年月项目计划完成的内容及目标 1 内容:CG 对 NSCLC 生长的抑制作用目标 : 四株人非小细胞肺癌细胞系的体外培养 ; 以 IC50 为指标, 应用 MTT 法建立肺癌细胞的药敏曲线 ; 临床常用化疗药物对 NSCLC 细胞生长的抑制作用 ;Hoechst 核染色观察药物诱导下细胞核形态学的变化 ; 小分子药物 CG 对鼠脾细胞的生长毒性作用 ; 2016 年 01 月至 2016 年 06 月 1 内容: 流式细胞术检测 CG 对 NSCLC 的功能学改变目标 : 运用流式细胞仪检测 CG 对肿瘤细胞的凋亡的作用 ; 运用流式细胞仪检测 CG 对肿瘤细和细胞周期分布情况的影响 ; 运用流式细胞仪检测 CG 对肿瘤细胞的线粒体膜电位和细胞内活性氧水平所产生的作用 2016 年 07 月至 2016 年 12 月 1 内容:CG 对抗肺癌作用的分子机制研究目标 : 运用 Western Blotting 蛋白电泳技术检测 MEK/ERK 通路酸化水平 ; 运用 Western Blotting 蛋白电泳技术检测 Akt 通路磷酸化水子水平的改变探讨 MAPK/ERK 通路的激活和 CG 抗癌作用的关系 2017 年 01 月至 2017 年 06 月第 7 页

9 五年度计划安排 (2) 年月项目计划完成的内容及目标 1 内容: 体内实验 (in vivo) 研究目标 : 通过裸鼠荷瘤实验在体内水平验证 CG 对肿瘤的抑制作用 2017 年 07 月至 2017 年 12 月 2018 年 01 月至 2018 年 06 月 1 内容: 实验数据的统计学分析目标 : 总结数据, 补充实验, 撰写文章 1 内容: 文章发表与结题目标 : 发表文章, 接受结题验收 2018 年 07 月至 2018 年 12 月第 8 页

10 六任务分工及申请经费分配项目申报形式 : 独立合作产学研合作申报主持单位单位吉林大学任务申请经费 ( 万元 ) 参与方式利用小分子药物 CG 作用于 NSCLC 细胞株, 通过流式细胞术及蛋白免疫印迹技术研究 CG 对 MEK/ERK 通路的影响, 并通过体内实验验证其抗癌活性, 从而系统全面的探讨小分子 10.0 万元 / 药物 CG 抑制 NSCLC 增殖的分子机制, 为临床筛选新的抗癌药物提供一个新靶点合作技术承接技术依托合作技术承接技术依托申报参加单位合作技术承接技术依托合作技术承接技术依托合作技术承接技术依托第 9 页

11 七申报单位与推荐部门意见申报主持单位意见 : 申报参加单位意见 : 盖章年月日盖章盖章年月日年月日盖章年月日盖章年月日盖章年月日推荐部门意见 : 盖章盖章年月日年月日第 10 页

吉林省科技发展计划项目申报书21847

吉林省科技发展计划项目申报书21847 计划类别 : 项目类别 : 管理处室 : 自然科学基金自然科学基金基础处项目名称 : 申报主持单位 ( 盖章 ): 项目负责人 : 通讯地址 : 三焦辨证法对过敏性紫癜兔模型的 IgA T 细胞及 TNF-a 表达水平影响的研究 ( 白求恩专项 ) 长春中医药大学原晓风吉林长春市长春市工农大路 1478 号固定电话 : 0431-81953837 移动电话 : 15948000812 传真