７７７梁金钟等玉米原料高产 γ 聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化还原糖的测定突变株筛选结果现平皿中单菌落主要有两种形态一种是边缘整齐９表面光滑质地均匀的圆形菌落另一种是中间凸起还原糖的测定采用直接滴定法紫外线诱变及突变株的筛选紫外线诱变经反复初筛与复筛结果发

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曰赴周
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2007,27(12):46~51 玉米原料高产 γ- 聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化 1 梁金钟 1 李艳华 2 范洪臣 (1 哈尔滨商业大学食品工程学院哈尔滨东北农业大学生命科学学院哈尔滨 ) 摘要以筛选到的一株枯草芽孢杆菌 (Bacilussubtilis)B?1 为出发菌株, 采用紫外诱变技术对出发菌株进行反复诱变, 得到一株能够利用玉米原料生产 γ? 聚谷氨酸的优良高产菌株 B?115, 摇瓶发酵 γ? 聚谷氨酸的产量由原菌株的 12.5g/L 提高到 19.5g/L 再以该菌株为研究对象利用响应面法进行碳源氮源谷氨酸钠金属离子等发酵条件的优化实验, 经 48h 摇瓶发酵,γ? 聚谷氨酸产量达到 40.98g/L 关键词 γ? 聚谷氨酸枯草芽孢杆菌玉米原料诱变优化中图分类号 Q933 γ? 聚谷氨酸 (γ?pga) 是一种可由微生物大量生物合成的氨基酸聚合物, 它由 D? 型和 L? 型谷氨酸通过 γ? 酰胺键连接而成其分子量一般在 10 万 ~100 万之间, 相当于 5000 个左右的谷氨酸单体 [1] γ?pga 具有极佳的成膜性成纤维性阻氧性可塑性粘结性保湿性极强吸水性可食用性和可生物降解等独特的理化和生物学特性, 因而具有增稠乳化凝胶成膜保湿和粘接等多种功能 [1,2], 是一种对人体和环境无毒害的可生物降解的新型天然高分子, 因此可广泛用于食品化妆品医药农业工业石油脱水环保涂料日用品水处理中 [3] γ?pga 生物合成的微生物菌株主要是芽孢杆菌属的某些种, 目前, 国内外对于 γ?pga 的生物合成的研究主要集中在枯草芽孢杆 (Bacilussubtilis) 和地衣芽孢杆菌 (B. licheniformis) 的菌株上 [4] 不同的菌株对营养成分的需求不同, 在已报道的研究中 γ?pga 发酵生产所用碳源一般采用葡萄糖蔗糖麦芽糖甘油柠檬酸盐等 [5,6], 在研究中发现玉米糖化液比单一成分的葡萄糖蔗糖麦芽糖等产量高玉米中 68% 以上的成分是淀粉 [7], 因此, 利用玉米原料微生物发酵法生产 γ? 聚谷氨酸可有效地开发和利用玉米中的淀粉本实验选育出一株可高效利用玉米糖化液收稿日期 : 修回日期 : 黑龙江省十一五重大科技攻关资助项目 (2006G0687?00) 电子信箱 :ljz2050@162.com 的突变株 B?115, 并以提高产量着手利用响应面法对筛选菌株的发酵培养基进行了优化 1 材料与方法 1.1 菌种枯草芽孢杆菌 (Bacilussubtilis)( 本实验室保存, 从日本纳豆中分离得到 ) 1.2 培养基及培养条件斜面培养基蛋白胨 10g/L, 牛肉膏 3g/L,NaCl 5g/L, 琼脂 20g/L,pH7.2~7.4 将现有斜面菌种活化,37 培养 24h 种子培养基斜面培养基加 2% 葡萄糖, 不加琼脂种子培养 :250ml 三角瓶装液量 50ml, 温度 37, 转速 150r/min, 置于摇床上培养 18h 单菌落分离培养基还原糖为 25% 的玉米糖化液 150ml/L, 谷氨酸钠 50g/L, 蛋白胨 10g/L, 琼脂 20g/L, 接种量 2%,250ml 三角瓶装液量为 50ml, 转速 150r/min, 温度 37, 培养 48h 基础发酵培养基还原糖为 25% 的玉米糖化液 150ml/L, 谷氨酸钠 50g/L, 蛋白胨 10g/L,KH 2 PO 4 1.0g/L, MgSO 4 0.5g/L 摇瓶培养: 接种量 2%,250ml 三角瓶装液量为 50ml, 转速 150r/min, 温度 37, 培养 48h [7] 1.3 玉米糖化液的制作玉米粉调浆液化糖化过滤玉米糖化液

2 ７７７梁金钟等玉米原料高产 γ 聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化还原糖的测定突变株筛选结果现平皿中单菌落主要有两种形态一种是边缘整齐９表面光滑质地均匀的圆形菌落另一种是中间凸起还原糖的测定采用直接滴定法紫外线诱变及突变株的筛选紫外线诱变经反复初筛与复筛结果发８灭菌平皿中装入ｍ菌液然后置边缘不整齐褶皱的菌落第一种形态的菌落产量相对Ｗ紫外灯距离ｍ下照射照射时间分别为ｍ于高如图箭头所示因此每次诱变后挑取光滑粘ｍｎｍｎ８ｍｍｎ照射后在无菌室红灯下适当稀释稠较大的圆形单菌落接种斜面作初筛菌株通过摇ｍ涂布于分离培养基上避光恒温７培养分别取瓶复筛选出产量相对高的两株表ｈ并设立对照最后进行活菌计数计算致死率绘制曲线９的诱变剂量并以该剂量正从中找出致死率为８式处理出发菌的菌悬液然后涂布平皿挑取生长出来的单菌落进行初筛和摇瓶复筛稳定性试验将最终得到的高产菌株作次传代试验ｈ转接次活菌计数９采用稀释平板计数法致死率计算９致死率诱变后活菌数ｆｕｍ诱变前活菌数ｆｕｍ γ? ＰＧＡ产量的测定发酵液加入等体积水ｒｍｍｎ离心去图诱变后菌落形态ＦｇＣｏｏｎｙｍｏｒｐｈｏｏｇｙｆｒｍｕｇｎ菌体上清液加入倍体积无水乙醇搅拌得沉淀表突变株筛选结果ｒｍｍｎ离心沉淀干燥得粗品ＴｂＴｈｒｕｏｆｍｕｇｎｂｙｕｖ７培养基优化菌株首先用ＰｋｍｎＰＢ设计对培养基中相关?Ｂｕｒ影响因素的效应进行评价筛选出有显著影响效应的因素然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域ＰＧＡ产量ｇＬ γ? 产量提高倍数出发菌株８最后通过Ｂｏｘｈｎｋｎ设计及响应面分析确定主要影?ｂ响因素的最佳浓度稳定性试验结果将复筛得到的两菌株在斜面上连续传代次每次传代后摇瓶培养测定 γ? ＰＧＡ结果与讨论产量表传代培养次两菌株产量基本保持稳紫外线诱变定没有明显的下降说明诱变得到的菌株能够稳定遗诱变剂量确定从图可以看出当照射时间为ｍｎ时几乎对出发菌株全部致死而当照射时间的产量相对较高故选其作传菌种退化较慢为下阶段出发菌株表突变株遗传稳定性试验结果为８时致死率为８９因此选定８作为ＴｂＴｈｒｕｇｎｂｙｏｆｍｕｎ紫外诱变剂量传代次数７８９产量产量７７９培养基成分优化ＰｋＢｕｒｍｎ设计确定重要影响因子? 实验中采用ＰｋＢｕｒｍｎ实验设计对影响产 γ?? 图致死率曲线ＰＧＡ的重要因素进行了筛选选用Ｎ的实验设计ＦｇＴｈｕｒｖｏｆｈｙｒ对发酵培养基中的蛋白胨谷氨酸钠硫酸镁玉米糖

3 48 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No 化液磷酸二氢钾硫酸锰氯化钠等 7 个因素的重要性进行了考察, 每个因素设高低两个水平实验设计与结果见表 3 及表 4 表 3 N=12 的 Placket?Burman 试验设计与结果 Table3 Placket?Burmantestdesignandresult(N=12) 序号 A B C D E F G H J Kγ?PGA(g/L) 利用 Minitab 对实验数据进行分析, 所得结果列于表 4 由表 4 可知, 玉米糖化液谷氨酸钠是主要的影响因素, 其可信度都在 90% 以上其它 5 个因素的重要性相对较小一些, 氯化钠在 85% 的概率上差异显著, 相对其他因素可信度较高, 因此也将氯化钠作为显著性因素考虑由此确定玉米糖化液谷氨酸钠和氯化钠为三个显著影响因素进行下一步的实验表 4 各因素水平效应值及显著性分析 Table4 Levels,efectsandsignificancetesting Term level low(-1) high(+1) Efect T P A 玉米糖化液 (%) B 蛋白胨 (%) C 味精 (%) D 磷酸二氢钾 (%) E 氯化钠 (%) F 硫酸镁 (%) G 硫酸锰 (%) 最陡爬坡实验设计及结果根据表 4 分析结果, 确定不显著因素的水平, 表现为正效应的因素取高水平, 表现为负效应的因素取低水平根据效应值的大小确定步长变化显著因素步长及方向变化的实验设计及结果见表 5 从表 5 的实验结果可以看出, 最佳因素浓度处于第 5 组与第 7 组实验之间, 第 6 组产量最高, 因此以第 6 组的水平作为响应面实验的中心点, 即玉米糖化液 24%, 谷氨酸钠 8.75%, 氯化钠 1.025% 表 5 最陡爬坡实验设计及结果 Table5 Steepestascenttestdesignandresult 实验序号玉米糖化液 (%) 谷氨酸钠 (%) 氯化钠 (%) γ?pga(g/l) 响应面分析的实验设计及结果通过最陡爬坡实验确定了重要影响因素浓度的取值的区间利用 minitab 软件进行 Box?Behnken 实验设计 ( 表 6,7) 表 6 Box?Behnken 试验因素水平 Table6 LevelsofvariablesforBox?Behnken 变量编码编码水平玉米糖化液 (%) X 谷氨酸钠 (%) X 氯化钠 (%) X 表 7 (N=15)Box?Behnken 试验设计及结果 Table7 Box?Behnkendesignandresult 试验号 X 1 X 2 X 3 γ?pga 产量 (g/l) 利用 minitab 软件对实验结果进行回归分析及方差分析拟合得到回归方程为 :Y= X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X 3 方差分析结果见表 8, 从表中可以看出该回归模型在 α=0.01 水平上显著, 失拟项 p=0.158, 表明失拟不显著经 F 检验, 可知回归方程中一次项二次项及交

4 2007,27(12) 梁金钟等 : 玉米原料高产 γ- 聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化 49 互项均对响应值有显著影响, 说明所拟合的二次回归方程合适方程的相关系数 R 2 为 0.98, 调整后的 R 2 为 0.945, 即表明模型可以解释 98% 的 B?115 发酵产 γ? 表 8 回归方程的方差分析 Table8 Varianceanalysisoftheregresionequation 聚谷氨酸水平的变化, 进一步说明了回归方程的拟合程度较好 Source DF SeqSS AdjSS AdjMS F P Regresion Linear Square Interaction ResidualEror Lack?of?Fit PureEror Total 最佳浓度的确定及验证试验根据上述回归方程绘出响应面分析图及等高线图, 以确认玉米糖化液谷氨酸钠氯化钠 3 个因素对 B?115 产 γ? 聚谷氨酸的影响, 响应面图和等高线图见图 3 图 4 图 5 从图中也可看出两两因素间存在比较明显的交互作用, 最佳点落在实验考察的区域内图 3 Y=f(X 1,X 2 ) 的响应面立体分析及其等高线图 Fig.3 ResponsesurfaceplotandcontourplotofY=f(X 1,X 2 ) 图 4 Y=f(X 1,X 3 ) 的响应面立体分析及其等高线图 Fig.4 ResponsesurfaceplotandcontourplotofY=f(X 1,X 3 )

5 50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No 图 5 Y=f(X 2,X 3 ) 的响应面立体分析及其等高线图 Y:γ?PGA 产量 (g/l);x 1 : 玉米糖化液 (%);X 2 : 谷氨酸钠 (%);X 3 : 氯化钠 (%) Fig.5 ResponsesurfaceplotandcontourplotofY=f(X 2,X 3 ) 为了更进一步求证最佳点的值, 对回归方程分别求一阶偏导等于零, 整理得 : X X X 3 = X X X 3 = X X X 3 =0 解方程组得到模型的极值点为 :X 1 =0.2450;X 2 = ;X 3 = 代入回归方程, 解得预测产量最大值为 40.77g/L 进行编码代换, 即玉米糖化液 242ml/L 谷氨酸钠 88g/ L 氯化钠 10.26g/L 为了确定建立的模型与实验结果是否相符, 根据以上实验结果确定各因素的浓度来配制发酵培养基进行三组平行实验, 得到 γ? 聚谷氨酸的平均产量为 40.98g/L, 与预测值接近, 说明模型是比较可靠的, 利用响应面法寻求 B?115 产 γ? 聚谷氨酸最佳发酵培养基浓度是有效可行的 3 结论以实验室筛选的一株枯草芽孢杆菌作为诱变的出发菌株, 以玉米糖化液作为筛选培养基的碳源, 经紫外线照射 180s 后, 从筛选平板上挑取粘稠的单菌落接种斜面, 经发酵培养基摇瓶复筛得到 2 株 γ?pga 产量提高幅度较大的突变株其中 B?115 利用玉米糖化液产 γ?pga 的量相对较高, 比诱变前提高了 1.56 倍, 且经 10 代转接传代实验证明具有良好的传代稳定性在诱变后菌株的初筛与复筛中发现, 边缘整齐表面光滑质地均匀粘稠的圆形菌落产量相对较高通过 Placket?Burman 实验设计, 我们得到玉米糖化液谷氨酸钠氯化钠是影响 B?115 发酵产 γ? 聚谷氨酸的主要因素, 通过最陡爬坡试验, 获得了三个主要影响因素最优值的大体范围, 为进行响应面分析确立了变化区间采用 Box?Behnken 设计和 minitab 软件进行分析, 得到发酵产 γ? 聚谷氨酸的最佳培养基配方为 : 玉米糖化液 ( 还原糖含量 25%)242ml/L 谷氨酸钠 88g/L 蛋白胨 8.0g/L 磷酸二氢钾 5.0g/L 氯化钠 10.26g/L 硫酸镁 0.8g/L 硫酸锰 0.02g/L, 经 48h 发酵培养后 γ? 聚谷氨酸的产量达到 40.98g/L, 同优化前相比, 提高了 2.1 倍参考文献 [1] 游庆红, 张新民, 陈国广, 等.γ? 聚谷氨酸的生物合成及应用. 现代化工,2002,22(12):56~59 YouQ H,ZhangX M,ChenG G,etal.ModernChemical Industry,2002,22(12):56~59 [2] 李楠, 黄登禹, 李飞, 等.γ? 聚谷氨酸产生菌 S004?50?01 的筛选和优化培养. 食品与发酵工业,2006,32(6):1~4 LiN,HuangDY,LiF,etal.FoodandFermentationIndustries, 2006,32(6):1~4 [3]Ing?LungShih,Pei?JenWu,Chwen?Jen Shieh.Microbial productionofapoly(γ?glutamicacid)derivativebybacilus subtilis.procesbiochemistry,2005,40:2827~2832 [4] 施庆珊.γ? 多聚谷氨酸的微生物合成与应用. 精细与专用化学品,2004,12(11):20~23 ShiQSH.FineandSpecialtyChemicals,2004,12(11):20~23 [5]ShihIL,VanY T,ShenM H.Biomedicalapplicationsof chemicalyand microbiologicaly synthesized poly(glutamic acid)andpoly(lysine).mini?reviewsinmedicinalchemistry, 2004,4:179~188 [6] 黄金, 陈宁.γ? 聚谷氨酸的性质与生产方法. 氨基酸和生物

6 2007,27(12) 梁金钟等 : 玉米原料高产 γ- 聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化 51 资源,2004,26(4):44~48 HuangJ,ChenN.AminoAcids& BioticResources,2004,26 (4):44~48 [7] 尤新. 玉米深加工技术. 北京 : 轻工业出版社,1999 You X.Maize Deep Procesing Technology.Beijing:Light IndustryPres,1999 [8] 候曼玲. 食品分析. 北京 : 化学工业出版社,2004 HouML.FoodAnalysis.Beijing:ChemicalIndustryPres,2004 [9] 周德庆. 微生物学实验手册. 上海 : 上海科技出版社,1986 Zhou D Q.MicrobiologicalExperimentManual.Shanghai: ShanghaiScienceandTechnologyPres,1986 [10] 邓毛程, 宋炜, 张远平.γ? 聚谷氨酸高产菌株的选育和发酵培养基的初步优化. 四川理工学院学报,2006,19(30):47 ~51 DengM CH,SW,ZhangYP.JournalofSichuanUniversityof Science&Engineering,2006,19(30):47~51 [11] 胡荣章, 叶海峰, 金丽.γ? 聚谷氨酸高产菌株筛选及发酵条件优化. 中国生物工程杂志,2005,25(12):62~65 HuRZH,YeHF,JinL.ChinaBiotechnology,2005,25(12): 62~65 [12]NadiaA,SolimanMahmoudM,BerekaaYaserR.Polyglutamic acid(pga)productionbybacilusspsab?26:applicationof Placket Burman experimentaldesign toevaluateculture requirements.applmicrobiolbiotechnol,2005,69:259~267 [13] 孙艳辉, 董英. 响应面法优化以豆渣为基质发酵纳豆菌. 食品科学,2007,28(4):208~210 SunYH,DongY.FoodScience,2007,28(4):208~210 Screeningofγ?PolyglutamicAcidHighProductiveStrainUsing CropMaterialsandOptimizationofFermentationCondition LIANGJin?zhong 1 LIYan?hua 1 FANHong?chen 2 (1SchoolofFoodEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin ,China) (2ColegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin ,China) Abstract OnestrainBacilussubtilisB?115wasscreened,whichcanusecropmaterialstoproduceγ? Polyglutamicacid.Thehighproductivestrainwasobtainedfrom theprimitivestrainofbacilussubtilisb?1 throughuvmutagenesis.theyieldofγ?polyglutamicacidincreasedfrom original12.5g/lto19.5g/lbyflask fermentation.inordertoenhancetheyieldofthisstrain,responsesurfacemethodology(rsm)wasusedto optimizefermentationmedium,suchascarbonsource,nitrogensource,concentrationofsodium glutamate,metal ions.thefinalyieldofγ?polyglutamicacidwasupto40.98g/l. Keywords γ?polyglutamicacid Bacilussubtilis Cropmaterials Mutagenesis Optimization

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第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖