活性鈣 黑豆奶優酪乳 中文摘要 本研究是探討龍根菌(Bifidobacterium longum B6 及 15708)在四種 發酵基質( 牛奶 豆奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) )中的生長情形及鈣含量 結果顯示 (1) 兩株菌在四種發酵乳中的生長菌數大小順序

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1 附件二 報告書(10002_食品群_國立曾文高級農工職業學校_ 活性鈣 黑豆奶 優酪乳) 100 年全國高職學生實務專題製作競賽暨成果展報告書 (標楷體18) 題目 活性鈣 黑豆奶優酪乳 (標楷體16) 指導老師 陳惠添 參賽學生 王嬋諭 吳崇平 林昱均 梁賢銘 方晟宇 (標楷體16) 學校名稱 國立曾文高級農工職業學校 群 別 食品群 科 別 食品加工科 (標楷體16) 中 華 民 國 (標楷體16) 1 年 3 月 7 日

2 活性鈣 黑豆奶優酪乳 中文摘要 本研究是探討龍根菌(Bifidobacterium longum B6 及 15708)在四種 發酵基質( 牛奶 豆奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) )中的生長情形及鈣含量 結果顯示 (1) 兩株菌在四種發酵乳中的生長菌數大小順序如下 牛奶 豆奶+ 蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 豆奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 但差異不顯著 (2) 兩株菌在 牛奶 發酵乳中於最終發酵(48 小時)顯示 ph 測定值為最低 可滴定酸度( )為最高 (3) 在 ph2.0 環境下在四種發酵乳中的存活百分率(%)(Survival rate)大小 依序皆為 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 豆奶 牛奶 兩株菌於 ph2.0 ph3.0 環境下 在 牛 奶 優酪乳中耐酸性皆是最低 但在 ph3.0 環境下卻有很高的耐酸性 (4) 兩株菌種在四種發酵乳中對膽鹽之耐受性均很高為 69.76%~90.12% (5) 兩株菌種在四種發酵乳中 隨著發酵時間的增加 牛奶 發酵乳中 的鈣含量卻逐漸降低 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 在最終發 酵(48 小時)之鈣含量 分別為 ppm 皆超越 牛奶 發酵乳 中的鈣含量 ppm 關鍵字 黑豆 乳酸菌 優酪乳 蜆殼 壹 前言 一. 研究動機 豆奶(或稱豆漿) 為大豆以水抽出之乳狀物 其營養價值與牛乳相當 惟鈣含量遠比牛乳少 除提供高品質的植物性蛋白質外 不含乳糖及膽固 醇 含有生理效應的異黃酮素 (isoflavones) 具有抗氧化性 故有助於預 防心血管疾病 癌症與婦女之停經症候群等罹患率 是一種來源充裕且價 廉的高營養食品(陳 2002) 龍根菌是人體和一般動物體內常駐的腸道菌 種 對於維持腸道的平衡扮演了重要的角色 其存在具有治療功能 包括 提升免疫力 抗腫瘤活性 抗癌活性 抗菌活性 抗膽固醇活性及提高乳 糖利用性等 因此利用益生菌發酵豆奶的研究漸漸受到重視 董氏基金會 最近實際檢測市售豆漿和豆製品 發現每杯豆漿的鈣含量僅有牛奶的十分 之一 以國人一天約需 1000 毫克以上的鈣質 顯然攝取量不足 因此若能 2

3 使豆製品含有豐富的鈣質 便可提高鈣的攝取量 另外傾倒棄置的蜆殼不 僅散發惡臭 吸引蚊蠅 散落地面還會割人 會造成環境的污染 於是興 起探討研究龍根菌能否利用在黑豆奶中發酵產生的乳酸來溶解黃金蜆殼中 的鈣 產生美味可口兼具有抗氧化性的 活性鈣 黑豆奶優酪乳的動機 不僅可減少環境污染 還能節能減碳提高豆製品的營養價值 二. 研究目的 本實驗研究的目的主要有兩部份 一部份是探討龍根菌能否在含有黃 金蜆殼粉的黑豆奶中生長與在牛奶中的生長情形一樣 實驗包括生長菌數 測定 ph 值之測定 可滴定酸度(%)測定 耐酸性試驗 耐膽鹽性試驗 比較龍根菌在四種發酵基質 牛奶 黑豆奶 黑豆奶+黃金蜆殼粉(0.1 ) 黑豆奶+黃金蜆殼粉(0.1 )+1%葡萄糖 中的生長情形 另一部份是探討龍 根菌能否利用在黑豆奶中發酵產生的乳酸來溶解黃金蜆殼中的 CaCO3(CaO) 來產生活性鈣(含鈣離子) 評估龍根菌是否適合以黑豆奶為發酵基質來製 作出接受度高的 活性鈣 黑豆奶優酪乳 貳 研究過程或方法 一. 研究設備及器材 1. 菌株 Bifidobacterium longum B 為國立中興大學食品暨應用生 物科技學系微生物研究室林美吟教授贈送的低溫冷凍儲藏菌株 2. 藥品 (1) Bile Bovine(Oxgall Powder) 購自Sigma, St. Louis, MO, U.S.A. (2) Syringe Filter PVDF 13mm Diameter 0.45um Pore size) (3) 鈣 AAS 標準液 購自台灣默克股份有限公司 (4) ph2.0 ph3.0 磷酸緩衝溶液 PBS 無水磷酸二氫鉀 KH2PO4 8.0 g 磷酸氫二鉀 K2HPO4 2.0 g 以蒸餾水定容至 1 公升 調整至 ph2.0 ph3.0 高壓滅菌備用 3.培養基 (1) 黑豆 ( Black soybean, Glycine max( L.)Merr. ) 黃金蜆 購自台灣省台南 市麻豆區市場 (2) 脫脂奶粉 安佳脫脂即溶奶粉 Anchor New Zealand (3) 還原乳溶液配製 10 g 脫脂奶粉 + 90 g 蒸餾水 牛奶 (100%) 3

4 (4) 葡萄糖 購自林純藥工業株式會社,Osaka, Japan. (5) Lactobacilli MRS broth Agar Difco Laboratories Detroit U.S.A 4.設備 (1) 微電腦黏度計(Brookfied Model DV-Ⅱ+ Brookfied ngineering Laboratory, Stoughton, USA ) (2) ph meter Model 691, Metrohm, Swiss (3) 恆溫培養箱 Model 903 YIHDER (4) 無菌操作臺 Model S-150, YH-6969, 義興 台灣 (5) 火焰式原子吸收光譜儀 HiTACHi-Z2300 (6) 高速粉碎機 RT-12,榮聰 台灣 二. 實驗架構 (一) 黃金蜆殼粉製程 黃金蜆殼 洗淨 乾燥 分鐘 加熱 煅燒 高速粉碎機 粉碎 黃金蜆殼粉 4

5 (二) 實驗流程 黑豆 浸漬 磨漿 加熱 過濾 豆奶 配製不同培養基 (1) 牛奶 (2) 豆奶 (3) 豆奶 0.1 蜆殼粉 接種 1 活化龍根菌 Bifidobacterium longum B ph 值測定 生長菌數測定 (4) 豆奶 0.1 蜆殼粉 1 葡萄糖 37 培養 18 小時(48 小時) 耐酸性試驗 可滴定酸度測定 耐膽鹽性試驗 鈣含量測定 三. 實驗方法 (一). 菌株活化 取於 - 20 下保存之菌液 0.1 ml( 1%的接種量) 接入 9.9 ml Lactobacilli MRS broth 培養基中 於最適生長溫度 小時下連續活 化 2 次 活化完成後置於 4 的冰箱儲藏備用 此即為實驗使用菌株來源 (二). 黃金蜆殼粉的製備 將廢棄黃金蜆殼用自來水清洗乾淨 放入 110 烘箱乾燥後 再放入灰 5

6 化爐以 1000 加熱煅燒 60 分鐘 冷卻後以高速粉碎機粉碎備用 (三).豆奶優酪乳的製備 黑豆清洗後 以蒸餾水浸泡 6 小時 (黑豆乾重 水 1 5) 倒掉浸泡 水後 將黑豆置入豆漿機並加入蒸餾水均質成漿 (黑豆乾重 水= l 10) 加熱後再以雙層棉紗布過濾後 分裝至血清瓶中 配製以下不同培養基 (1) 牛奶( 固形物 10 ) (3) 豆奶 0.1 黃金蜆殼粉 (4) 豆奶 0.1 黃金蜆殼粉 1 葡萄糖 最後以殺菌釜滅菌( 分鐘) 滅 菌冷卻後 於無菌操作台中分別接 1 不同菌種 Bifido. longum B (四).生長菌數測定 龍根菌於不同培養基培養 18 小時後 取 1ml 不同優酪乳 注入 9 ml 無 菌水中做 10 倍系列稀釋(serial dilution) 並取 1 ml 稀釋液以傾注平板法 (Pour plate method)加入 MRS agar 混合均勻後凝固 在 37 下培養 48 小 時後 進行平板計數 觀察其菌落形態並計數 25~250 CFU/ml 的菌落數 計算存活之龍根菌菌數並以對數值(logCFU/ml)表示之 (伍). ph 值之測定 龍根菌於不同培養基 在 37 下培養 48 小時 期間依 小時取出 將樣品振盪均勻後以 ph 計測之 (六).可滴定酸度(%)測定 龍根菌於不同培養基 在 37 下培養 48 小時 期間依 小時取出 將樣品振盪均勻後 依中國國家標準 CNS 3441 之方法測定 精確秤取 9.0 g 之試樣 加入等量之蒸餾水稀釋 再加入 1% phenolpthalein 0.5 ml 以 0.1 N NaOH 滴定至試樣達 ph 7.0 時為滴定終點 酸度以乳酸 (%)表示(陳 2002) 計算公式如下 0.1 N NaOH 溶液 1 ml 等於 g 乳酸 0.1 N NaOH 滴定數( ml ) f 乳酸 ( ) = 100 試樣重量 ( g ) f 0.1 N NaOH 之力價 (七). 耐酸性試驗 取經過 37 下培養 18 小時後之不同優酪乳液 1 m1 分別加入不同 ph 值(pH )之 9m1 磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中 樣品與緩衝液充分混合後 6

7 立刻取出 l m1 混合液 於 9ml 之無菌水中做 10 倍系列稀釋 然後以傾注 平板法加入 MRS agar 混合均勻後凝固 在 37 下培養 48 小時 計算 0 小 時存活之乳酸菌菌數並以對數值(logCFU/ml)表示之 另外剩餘樣品與磷酸 鹽緩衝液(PBS)之混合液以 37 80rpm 培養之 3 小時後立刻取出 l m1 混 合液 於 9ml 之無菌水中做 10 倍系列稀釋 然後以傾注平板法加入 MRS agar 混合均勻後凝固 在 37 下培養 48 小時 計算 3 小時存活之乳酸菌 菌數並以對數值(logCFU/ml)表示之 所得實驗數據依下列公式求出存活百 分率(%) (Survival rate) 在 ph 2.0(3.0) PBS 中處理 3 小時後殘存的之 乳酸菌菌數(logCFU/ml) 存活百分率(%) = (Survival rate) 在 ph 2.0(3.0) PBS 中處理 0 小時後殘存的之 乳酸菌菌數(logCFU/ml) 100% (八). 耐膽鹽性試驗 取經過 37 下培養 18 小時後之不同優酪乳液 0.1ml 分別接種至 9.9 m1 之 MRS broth(不含 ox gall)及含 0.3%(w/v)ox gall 之 MRS broth 中 置 於 37 下培養 12 小時後 立刻取出 l m1 混合液 於 9ml 之無菌水中做 10 倍系列稀釋 然後以傾注平板法加入 MRS agar 混合均勻後凝固 在 37 下培養 48 小時 計算 12 小時存活之乳酸菌菌數並以對數值(logCFU/ml)表 示之 所得實驗數據依下列公式求出膽鹽耐受力(bile tolerance)之百分率 含膽鹽(0.3%)之乳酸菌菌數(logCFU/ml) 膽鹽耐受力百分率(%) = 100% 不含膽鹽之乳酸菌菌數(logCFU/ml) (九). 鈣含量測定 龍根菌於不同培養基 在 37 下培養 48 小時 期間依 小時取出 將樣品振盪均勻後 取 1ml 不同優酪乳 注入無菌水中 稀釋成 300 倍稀釋溶液 再打入 PVDF 過濾頭(Syringe Filter)(13mm Diameter 0.45um Pore size)過濾 濾液再打入火焰式原子吸收光譜儀定量 稀釋溶液中鈣含量 火焰式 Z-2300 系列原子吸收光譜儀條件設定 訊號模式 背景扣除 波長 (nm) 空氣壓力 ( KPa ) 160 7

8 空氣流速 ( L/min ) 15 測定模式 標準曲線 標準品濃度(ppm) 標準品測量吸收值 r= 標準品鈣離子濃度檢量線 1-Ca 吸 0.7 收 0.6 值 標準品鈣離子濃度 ( ppm )

9 肆 研究結果與討論 一 研究結果 表一 厭氧環境下 發酵乳經 小時培養後 在 MRS agar 培養基上的龍 根菌菌數. Viable numbers of bifidobacteria in different media when grown on MRS agar at 37 for 18 hrs under anaerobic condition. Medium Viable numbers of bifidobacteria ( log CFU/ml ) 0 hr 18 hr Fermented with B.longum B Fermented with B.longum ) (15708)豆奶 蜆殼粉 (0.1 ) 9 (15708)豆奶 蜆殼粉 (0.1 ) 不同優酪乳 (15708)豆奶 (15708)牛奶 (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) (B6)豆奶 (B6)牛奶 雙叉桿菌菌數(logCFU/ml) (圖一) 厭氧環境下 優酪乳經37 18小時培養後 在MRS agar培養基上的活性雙叉桿菌菌數 0hr 18hr

10 表二 37 發酵 48 小時不同的發酵乳 ph 值之變化. Changes of ph values in different media after fermentation at 37. Medium ph 0hr Fermented with B.longum B6 Fermented with B.longum hr 24hr 36 hr 48hr (圖二) 37 發酵48小時不同的發酵乳 ph值之變化 (B6)牛奶 (B6)豆奶 6.00 (B6)豆奶+蜆殼粉(0.1 ) ph 值 5.00 (B6)豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡 萄糖(1 ) (15708)牛奶 (15708)豆奶 1.00 (15708)豆奶+蜆殼粉(0.1 ) hr 12hr 24hr 36hr 發酵時間(hr) 10 48hr (15708)豆奶+蜆殼粉 (0.1 )+葡萄糖(1 )

11 表三 37 發酵 48 小時不同的發酵乳可滴定酸度( % )之變化 Changes of titratable acidity ( % ) in different media after fermentation at 37 可滴定酸度(TA)(%) Medium 0hr Fermented with B.longum B Fermented with B.longum hr 24hr 36 hr 48hr (圖三) 37 發酵48小時不同的發酵乳可滴定酸度( % )之變化 (B6)牛奶 (B6)豆奶 可滴定酸度( % ) (B6)豆奶+蜆殼粉 (0.1 ) (B6)豆奶+蜆殼粉 (0.1 )+葡萄糖(1 ) (15708)牛奶 (15708)豆奶 hr 12hr 24hr 36hr 發酵時間(hr) 11 48hr (15708)豆奶+蜆殼粉 (0.1 (15708)豆奶+蜆殼粉 (0.1 )+葡萄糖(1 )

12 表四 不同的發酵乳中的龍根菌經不同 ph 值 ( ph 2 及 ph 3 )之 PBS ( phosphate buffer saline) 在 37 處理 3 小時後殘存的菌數. Viable numbers of bifidobacteria in different media after 3 hrs exposure in phosphate buffer saline at ( ph 2 and ph 3 ) Medium Viable cell numbers( log CFU/ml ) ph 2 0 hr ph 3 3 hr 0 hr 3 hr Fermented with B.longum B Fermented with B.longum

13 表五 不同的發酵乳中的龍根菌於 ph 2 及 ph 3 的磷酸鹽溶液中經 37 3 小時 後之存活率 Survival rate of bifidobacteria in different media at ph 2 and ph 3 ( PBS) Survival rate ( ) Medium ph 2.0 Fermented with B.longum B6 Fermented with B.longum ph 在 ph 2.0(3.0) PBS 中處理 3 小時後殘存的之乳酸菌菌數 (logcfu/ml) 存活百分率(%) = 100% 在 ph 2.0(3.0) PBS 中處理 0 小時後殘存的之乳酸菌菌數 (logcfu/ml) (圖四)不同的優酪乳中的龍根菌於pH 2及pH 3的磷酸鹽溶液中經 37 3小時後之存活率 存活率 ( ) (15708)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) 葡萄糖(1 ) 13 (15708)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) 不同優酪乳 (15708)豆奶 (15708)牛奶 0.00 (B6)豆奶 (B6)牛奶 (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) 葡 萄糖(1 ) ph 2 ph 3

14 表六 膽鹽(0.3 )對不同優酪乳中的龍根菌之生長影響 優酪乳 龍根菌菌數(logCFU/ml) Fermented with B.longum B Fermented with B.longum 膽鹽耐受力( ) 膽鹽的龍根菌菌數(logCFU/ml) 1.膽鹽耐受力( )= 膽鹽的龍根菌菌數(logCFU/ml) (圖五) 膽鹽(0.3 )對不同優酪乳中的龍根菌之生長影響 (B6)牛奶 膽鹽耐受力( ) (B6)豆奶 (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) 葡萄糖(1 ) (15708)牛奶 (15708)豆奶 不同的優酪乳 14 (15708)豆奶 蜆殼粉 (0.1 ) (15708)豆奶 蜆殼粉 (0.1 )

15 表七 37 發酵 48 小時不同的發酵乳中鈣含量(ppm)之變化 Changes of Calcium content (ppm) in different media after fermentation at 37 Medium 鈣含量(ppm) 0hr 12hr 24hr 36hr 48hr Fermented with B.longum B Fermented with B.longum (圖七) 37 發酵48小時不同的發酵乳中鈣含量(ppm)之變化 (B6)牛奶 (B6)豆奶 鈣 含 量 (p p m ) 2.5 (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) (B6)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) 葡 萄糖(1 ) (15708)牛奶 (15708)豆奶 0 0hr 12hr 24hr 36hr 時間(hr) 48hr (15708)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) (15708)豆奶 蜆殼粉(0.1 ) 葡萄糖(1 ) 二 討論 (一) 龍根菌在四種發酵乳中的生長情形 15

16 紀(2006)應用灰化牡蠣殼粉降低花椰菜表面生菌數 結果顯示花椰 菜清洗方面 添加 800 灰化牡蠣殼粉 0.4 以上時即可達到 100 之殺 菌效果 殺菌效力隨著添加量而增強 即灰化牡蠣殼粉具有抑菌作用 由 此推論蜆殼粉可能具有抑菌作用 由表一及圖一顯示 Bifido. longum B 在四種發酵乳中生長菌數大小順序如下 牛奶 豆奶+ 蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 豆奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) Bifido. longum B 在四種發酵乳中皆以在牛奶中之生長最佳 菌數分別 為 8.54 log CFU/ml 8.56 log CFU/ml 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 中 生長最差 菌數分別為 7.96 log CFU/ml 7.79 log CFU/ml 在 豆奶 +蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 優酪乳中生長情形比在 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 生長情形佳 實驗顯示 Bifido. longum B 在含有豆奶的三 種發酵乳中生長情性較牛奶差 可能是受到蜆殼粉(0.1 )抑菌影響 但 在 0.1 濃度下 此抑菌作用的影響 差異不顯著 並且在未添加額外醣 類的情形下仍可生長 顯示其應該可利用豆奶中的醣類 而添加少量的葡 萄糖即可改善其生長情形 並可使抑菌作用之影響不顯著 二 ph 值之測定 Sawai 等學者(2001)研究 牡蠣殼主要成分為碳酸鈣 在高溫加熱 的過程中碳酸鈣 CaO3 開始分解成氧化鈣 CaO 並產生二氧化碳散失 當加熱至 900~1000 時碳酸鈣(CaO3)均已生成大部份之氧化鈣 CaO 氧化鈣 CaO 加水 則成鹼性的氫氧化鈣水溶液 CaO+H2O Ca(OH)2 由表二 圖二顯示 Bifido. longum B 在四種發酵乳中最 終發酵(48 小時)之 ph 值測定值皆以在 牛奶 中最低 ph 值分別達 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 中為最高 ph 值分別達 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 優酪乳中比在 豆奶+ 蜆殼粉(0.1 ) 豆奶 為低 ph 值分別達 兩株菌種在四種發酵基質中產酸情形相類似 ph 值皆隨著時間增 加而降低 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 優酪乳中當發酵至 24 小時時 ph 值最先分別由 降至 兩種發酵基質最早成 凝固狀態類似豆花狀 推論蜆殼粉可能受到乳酸分解產生游離 Ca2 游離 Ca2 再與由豆乳蛋白質分解的氨基酸結合而成 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 優酪 乳中當發酵至 36 小時時 ph 值分別由 降至 ph 值 下降速率最慢 推論可能乳酸菌受到蜆殼粉的抑菌作用影響 而加入葡萄糖 (1 )確實可使 ph 值下降速率變快 (三) 可滴定酸度(%)測定 16

17 由表三 圖三顯示 Bifido. longum B 在四種發酵乳中 最終發酵(48 小時)可滴定酸度為 ~ 皆以在 牛奶 中 最高 可滴定酸度分別達 最終發酵(48 小時)可滴定酸 度高低順序為 牛奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 豆奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 中為 最低 分別達 可滴定酸度在 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+ 葡萄糖(1 ) 發酵乳中比在 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 豆奶 為高 顯示添加少量的葡萄糖即可提高可滴定酸度 並可使抑菌作用之影響 不顯著 兩株菌種在四種發酵乳中的可滴定酸度皆隨著發酵時間的增 長而增加 在 牛奶 發酵乳中發酵(24 小時)時可滴定酸度開始呈現 大幅度增加 (四) 耐酸性試驗 益生菌必須能存活於人體腸道中 在小腸中定殖 對人體才有益 生作用 但因攝食階段受到的連續緊迫 此緊迫包括了口腔中的酵素 ( Fuller, 1992 ) 胃中低 ph 值 腸道的蠕動及膽鹽的存在及胃腸中 的消化酵素等 這抑制了益生菌在小腸中的定殖 根據 Conway et al., (1987)研究指出 採用磷酸鹽緩衝溶液系 統或動物胃液系統來測定乳酸菌的耐酸性之體外試驗和體內試驗的測 定有很高的相關性 故均可作為篩選耐酸性益生菌的參考依據 Conway et al., (1987)並指出乳酸菌於磷酸鹽緩衝溶液中的存活率和胃液中 差異不大 大部分學者在體外試驗中多建議採用 ph 3.0 的磷酸鹽緩衝 溶液(Suskovic., 1997 Garriga et al., 1998) 主要因為乳酸菌攝 入體內時多伴隨著具緩衝胃液效果的食物 使 ph 值不至於降至太低 而就處理時間來看 人體試驗中以食用發酵乳為例 胃之排空速率在 2.5 小時後可達 100 % 故試驗時間以 3 小時為準 所以本試驗利用磷酸鹽緩衝溶液系統 在不同的 ph 值(pH )環境下來進行菌株在優酪乳中生長後的耐酸性試驗 耐酸性試驗結 果如表四 表五及圖四所示 兩株菌種在 ph2.0 環境下在四種發酵乳中 的存活百分率(%)(Survival rate)大小依序皆為 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+ 葡萄糖(1 ) 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 豆奶 牛奶 Bifido. longum B 在 ph2.0 在 牛奶 發酵乳中的存活 百分率(%)(Survival rate)為最低 分別為 顯示在 牛 奶 發酵乳中生長的菌耐酸性差 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 為最高分別為 顯示在 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄 糖(1 ) 發酵乳中生長的菌株耐酸性高 由此推論可能含蜆殼粉的發酵 乳因蜆殼粉受乳酸菌發酵產生乳酸 而乳酸分解蜆殼粉產生 OH 離子 中和部份酸度 致發酵乳酸度不如 牛奶 發酵乳酸度高 17

18 Bifido. longum B 在 ph3.0 環境下 在 牛奶 發酵乳 中的存活百分率(%)(Survival rate)為最低 但分別高達 顯示在 牛奶 發酵乳中生長的菌耐酸性高 (五) 耐膽鹽性試驗 肝臟內的膽固醇經氫氧化後產生膽鹽 常與醣類或胺基酸結合形成 結合式膽鹽(conjugated bile salts) 最後進入腸道內 膽鹽具有界面 活性劑的特性 其存在可降低腸內之表面張力以利脂肪等物質之消化 然而高濃度之膽鹽對腸內微生物(包括乳酸菌)具有抑制作用 因此動物 體腸道內的膽鹽是影響乳酸菌存活的因素之一(Gilliland and Walker, 1990) 大多數學者以接近人類膽汁的牛膽鹽進行試驗 濃度以 0.3 為 主(Chateau et al., 1994 Gi11iland and Walker, 1990) 本試驗為 將含有龍根菌的優酪乳接種於含有 0.3 ox gall 之 MRS broth 並與 0% ox gall MRS broth 之對照組的生長速率比較 以瞭解其對膽鹽之耐 受性 膽鹽耐受性試驗結果如表六及圖五所示 實驗結果顯示 不同優酪乳 經接種於含有 0.3 ox gall 之 MRS broth 並與 0% ox gall MRS broth 之對照組的生長速率比較後 結果顯示兩株菌種 Bifidobacterium longum B 對膽鹽之耐受性均很高為 69.76%~90.12% 尤其以 B. longum B6 在 牛奶 發酵乳對膽鹽之耐受性最高為 90.12% 兩株菌種 Bifidobacterium longum B 在 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 發酵乳對膽鹽之耐受性最低 分別為 69.76% Clark and Martin, (1994)報告指出在 2.0%或 4.0%的膽鹽中 B. longum 具最佳耐受性 其次是 B. bifidum 和 B. infantis 所以菌株對 膽鹽的耐受性是受其本身對膽鹽特異性之影響 和所屬的菌種沒有絕對的 關係 (六) 鈣含量測定 B. longum B6 及 在四種發酵乳中 48 小時的鈣含量之變化情形 如表七及圖七所示 兩株菌在四種發酵乳中的鈣含量之變化情形各相類 似 在發酵 0 小時時以在 牛奶 發酵乳中的鈣含量最高 分別為 ppm 遠比 豆奶 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+ 葡萄糖(1 ) 三種發酵乳中的鈣含量為高 但隨著發酵時間的增加 牛 奶 發酵乳中的鈣含量卻逐漸降低 在最終發酵(48 小時)之鈣含量 分別 為 ppm 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 發酵乳中的鈣 含量 在發酵 0 小時時分別為 ppm 遠比 牛奶 發酵乳中的 18

19 鈣含量為低 但隨著發酵時間的增加 發酵乳中的鈣含量先稍降再大幅增 加 在發酵 36 小時時鈣含量 分別為 ppm 超越 牛奶 發酵 乳中的鈣含量 ppm 豆奶+蜆殼粉(0.1 )+葡萄糖(1 ) 在 最終發酵(48 小時)之鈣含量 分別為 ppm 超越 牛奶 發酵 乳中的鈣含量 ppm 豆奶 發酵乳中的鈣含量 在發酵 0 小 時時分別為 ppm 在發酵 24 小時時下降至分別為 ppm 豆奶+蜆殼粉(0.1 ) 發酵乳中的鈣含量 在發酵 0 小時時分別為 ppm 在發酵 0~24 小時期間下降 24~48 小時期間再逐步上升 在最 終發酵(48 小時)之鈣含量 分別為 ppm 由實驗數據顯示 兩株菌在四種發酵乳中的鈣含量 豆奶中加入蜆殼 粉(0.1 )所顯示的鈣含量比豆奶中所顯示的鈣含量為高 兩者差異不顯 著 但豆奶中加入蜆殼粉(0.1 )再加入葡萄糖(1 )所顯示的鈣含量遠比 前兩者為高 差異顯著 因此龍根菌是適合以黑豆奶為發酵基質 加入蜆 殼粉需再加入葡萄糖 才能提高發酵乳中的鈣含量 來製作出接受度高的 活性鈣 黑豆奶優酪乳 三 結論與應用 Bifido. longum B 在四種發酵乳中以在 牛奶 發酵乳中 的生長菌數最多 ph 值最低 可滴定酸度( )最高 耐酸性(pH2.0 ph3.0) 最低 膽鹽之耐受性最高 含有豆奶的三種發酵乳的生長菌數 ph 值 可 滴定酸度( ) 膽鹽之耐受性較牛奶差 可能是受到蜆殼粉(0.1 )抑菌影 響 但在 0.1 濃度下 此抑菌作用的影響 差異不顯著 並且在未添加額 外醣類的情形下仍可生長 顯示其應該可利用豆奶中的醣類 而添加少量 的葡萄糖即可提高其生長菌數 降低 ph 值 提高可滴定酸度( ) 提高耐 酸性(pH2.0 ph3.0) 大幅提高鈣含量 使鈣含量超過 牛奶 發酵乳 所以龍根菌是適合以黑豆奶為發酵基質 加入蜆殼粉需再加入葡萄 糖 才能提高發酵乳中的鈣含量 來製作出接受度高的 活性鈣 黑豆奶 優酪乳 藉由乳酸菌發酵來溶解黃金蜆殼廢棄物 不僅可提高豆奶鈣的攝 取量 還能節能減碳 減少環境污染 伍 參考文獻 1. 林衫郁 2001 乳酸菌和雙叉桿菌益生特性之探討 國立中興大學畜產學系 台中 台灣 2. 林清騫 2001 食品化學與分析實習Ι ΙΙ 初版 雲林 文昌出版社 P.115~P 鄭品逸 2009 貝殼煅燒粉末之殺菌作用及其在水產品保鮮之應用 國立高 雄海洋科技大學 水產食品科學研究所 高雄 台灣 19

20 4. 紀典佑 2006 牡蠣殼開發利用之研究 中國文化大學 生活應用科學研究 所 台北 台灣 5. Wang C and Wixon R (1999) Phytochemicals in soybeans: their potential health benefits. Iform 10: Fuller, R. (1992). Probiotics. The Scientific Basis. Chapman and Hall. London. 陸 附圖 廢棄物-黃金蜆殼 煅燒後黃金蜆殼 Bifidobacterium longum B 黃金蜆殼粉末 黑豆 試驗樣品 20

21 Bifidobacterium longum 火焰式原子吸收光譜儀 生長菌數測定 耐酸試驗 耐膽鹽試驗 耐膽鹽試驗 21

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