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1 中 國 畜 牧 學 會 會 誌,38(4):283~294, 2009 β- 半 乳 糖 苷 酶 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 (1) 陳 俊 吉 (1) 曾 再 富 (2) 黃 建 榕 (2)(3) 陳 文 賢 本 研 究 旨 在 探 討 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 反 應 溫 度 (30 及 37 ) 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 試 驗 材 料 以 2% 之 褐 藻 酸 鈉 溶 液 固 定 β- 半 乳 糖 苷 酶 做 為 固 定 化 珠 體, 並 以 未 固 定 化 者 為 對 照, 分 別 加 入 牛 乳 中, 於 30 及 37 分 別 反 應 及 120 min 分 析 測 定 項 目 包 括 β- 半 乳 糖 苷 酶 活 性 葡 萄 糖 半 乳 糖 乳 糖 及 寡 醣 含 量 由 結 果 顯 示 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 酵 素 活 性 顯 著 高 於 固 定 化 處 理 組 (P < 0.05), 牛 乳 經 β- 半 乳 糖 苷 酶 處 理 後 20 min, 可 發 現 葡 萄 糖 半 乳 糖 及 寡 醣 之 存 在 由 本 試 驗 之 寡 醣 生 合 成 結 果 顯 示, 利 用 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30~37 反 應 20 min, 為 生 成 寡 醣 之 最 適 宜 的 條 件 ( 關 鍵 語 :β- 半 乳 糖 苷 酶 固 定 化 酵 素 寡 醣 ) β- 半 乳 糖 苷 酶 (β-galactosidase) 或 俗 稱 乳 糖 水 解 酶 (lactase), 常 被 食 品 工 業 運 用 於 水 解 牛 乳 中 的 乳 糖, 以 形 成 一 分 子 葡 萄 糖 及 一 分 子 半 乳 糖 ( 陳,1992), 可 製 造 低 乳 糖 牛 乳 產 品 或 用 於 寡 醣 (oligosaccharide) 之 生 合 成, 研 發 出 含 有 機 能 性 寡 醣 的 乳 製 品 寡 醣 是 指 3-10 個 單 醣 組 成 之 醣 類, 也 是 一 種 包 含 支 鏈 鍵 結 的 聚 合 物, 目 前 已 被 發 現 的 寡 醣 種 類 有 蜜 三 醣 (raffinose) 大 豆 寡 醣 (soybean oligosaccharide) 果 寡 醣 (fructooligosaccharide) 半 乳 寡 醣 (galactooligosaccharide), 因 無 法 被 胃 液 分 解 或 被 小 腸 消 化 吸 收, 得 以 通 過 小 腸 到 大 腸 中, 被 腸 道 有 益 菌 利 用 而 改 變 腸 道 菌 相 近 年 來 發 現 某 些 不 被 消 化 的 寡 醣 (non-digestible oligosaccharide, NOD) 具 有 改 善 腸 道 菌 叢 生 態 (Okazaki et al., 1990) 防 止 下 痢 及 便 秘 (Gumming et al., 1997) 及 改 善 控 制 血 壓 (Ide et al., 1991) 等 有 利 於 人 體 生 理 的 功 能 因 此 在 日 本, 寡 醣 已 廣 泛 應 用 於 飲 料 餅 乾 糖 果 穀 類 及 乳 類 食 品 (Tomomatsu, 1994) 固 定 化 酵 素 (immobilized enzyme) 應 用 範 圍 涵 蓋 有 機 合 成 反 應 食 品 工 業 機 能 性 寡 醣 之 生 產 製 藥 工 業 分 析 檢 驗 農 產 品 加 工 及 動 植 物 的 細 胞 培 養 等 許 多 報 告 已 成 功 將 固 定 化 酵 素 使 用 於 工 業 L- 胺 基 酸 的 製 造 (Chibata et al., 1974) 高 果 糖 糖 漿 之 連 續 生 產 製 程 (Mermelstein, 1975) 低 乳 糖 含 量 牛 乳 之 工 業 化 製 程 (Hartmeier, 1988) 及 活 酵 母 菌 (Saccharomyces cerivisiae) 固 定 於 多 (1) 國 立 嘉 義 大 學 動 物 科 學 系,600 嘉 義 市 學 府 路 300 號 (2) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 試 驗 所 加 工 組,712 台 南 縣 新 化 鎮 牧 場 路 112 號 (3) 通 訊 作 者, wschen@mail.tlri.gov.tw

2 284 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 38 卷 第 4 期 孔 性 陶 瓷 (porous ceramic solid) 以 生 產 啤 酒 (Tosa and Shibatani, 1995) 因 此, 本 試 驗 以 牛 乳 為 材 料, 添 加 固 定 或 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶, 於 不 同 的 溫 度 進 行 反 應, 探 討 β- 半 乳 糖 苷 酶, 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 ; 期 能 以 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 供 進 行 連 續 生 產 使 用 減 少 生 產 成 本 供 以 生 合 成 寡 醣 本 試 驗 所 使 用 的 鮮 乳 取 自 於 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所, 經 超 高 溫 瞬 間 殺 菌 (ultra-high temperature pasteurization, UHT) 處 理 之 牛 乳 参 考 張 等 (1994) 及 Ichiro et al.(1996) 之 方 法 進 行 取 300 mg 之 β- 半 乳 糖 苷 酶 添 加 經 滅 菌 的 50 ml 之 2% 褐 藻 酸 鈉 溶 液 中, 放 入 磁 石 置 於 加 熱 攪 拌 器 (MR-3001, Heidolph, Germany) 混 勻 後, 再 將 含 有 β- 半 乳 糖 苷 酶 的 褐 藻 酸 鈉 溶 液 裝 入 20 ml 玻 璃 注 射 筒 配 合 18G 1.5 吋 針 頭 (Terumo, Tokyo, Japan), 慢 慢 滴 入 於 500 ml 經 滅 菌 之 0.3 M 氯 化 鈣 溶 液 中, 使 形 成 直 徑 3 mm 珠 狀 膠 體, 滴 入 之 同 時 以 磁 石 緩 慢 攪 拌, 形 成 膠 體 後, 在 0.3 M 氯 化 鈣 溶 液 中 靜 置 1 hr, 使 鈣 離 子 滲 入 而 形 成 含 有 β- 半 乳 糖 苷 酶 褐 藻 酸 鈣 珠 體, 並 過 濾 以 無 菌 水 沖 洗 兩 次, 所 取 得 珠 體 以 濾 紙 吸 乾 後 備 用, 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 珠 體 之 外 觀 如 圖 1 試 驗 分 為 二 個 處 理 組 : 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 300 mg 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 300 mg 分 別 與 100 ml 的 牛 乳 作 用, 並 分 別 於 30 及 37 恆 溫 水 浴 槽 (BC-2D, Hipoint, Kaoshiung, Taiwan) 反 應 及 120 min, 分 別 取 經 反 應 後 之 樣 品 測 定 酵 素 活 性 及 分 析 寡 醣 含 量 圖 1 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 珠 體 之 外 觀 Figure 1 Appearance of beads containing immobilized β-galactosidase.

3 β- 半 乳 糖 苷 酶 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 285 :β- 半 乳 糖 苷 酶 之 活 性 分 析 依 Hekmat and McMahon(1992) 之 方 法 進 行 取 樣 品 1 ml 溶 於 50 ml 之 0.1 M 磷 酸 緩 衝 液 (ph 7.0)( 含 0.01 M MgSO M β-mercapto-ethanol), 再 取 稀 釋 液 1 ml 加 入 三 氯 甲 烷 2 ml 及 0.1% 硫 酸 十 二 酯 鈉 (sodium dedecyl sulfate, SDS)1 ml, 並 震 盪 10 sec, 置 於 28 水 浴 5 min, 再 加 入 0.2 ml 之 硝 基 酚 複 合 物 (O-Nitrophenyl β-d-galactopyranoside, ONPG) 震 盪 10 sec, 使 其 反 應 10 min 後, 加 入 0.5 ml 之 1 M Na 2 CO 3 (ph 11) 終 止 反 應, 再 以 16,266 g 離 心 15 min, 取 上 清 液 置 於 分 光 光 度 計 (UV-160, Shimadzu, Japan) 於 420 nm 處 測 其 吸 光 値 β- 半 乳 糖 苷 酶 活 性 (units/ml)= 1,000 A 420 / T V A = 波 長 為 420 nm 之 吸 光 値 T = 反 應 時 間 (min) V = 分 析 之 樣 品 量 (ml) : 參 考 岡 田 與 長 南 (1983) 之 方 法 萃 取 醣 類 樣 品, 再 參 考 黃 (1992) 之 方 法 以 薄 層 色 層 分 析 (thin layer chromatography, TLC) 進 行 寡 醣 之 定 性 分 析 醣 類 萃 取 方 法 為 取 樣 品 5.00 g 加 入 95% 酒 精 20 ml, 震 盪 混 勻 5 min, 以 高 速 冷 凍 離 心 機 (BC-2D, Hitachi, Tokyo, Japan) 於 10,3,000 rpm(rpr , Hitachi, Tokyo, apan) 離 心 10 min, 取 出 上 層 液 後, 下 層 物 再 加 入 80% 酒 精 20 ml, 再 震 盪 混 勻 5 min, 以 高 速 冷 凍 離 心 機 於 10,3,000 rpm 離 心 10 min, 取 出 上 層 液, 將 兩 次 上 層 液 混 勻, 加 入 30 ml 之 n-hexane 及 放 入 磁 石 置 於 加 熱 攪 拌 器 震 盪 混 勻 5 min, 靜 置 1 min 後 取 出 下 層 液, 下 層 液 以 真 空 濃 縮 機 進 行 濃 縮, 濃 縮 後 即 為 萃 取 之 醣 類 樣 品 萃 取 之 醣 類 樣 品 經 震 盪 混 勻 後, 以 0.22 μm 之 無 菌 過 濾 膜 過 濾, 取 得 濾 液 後 使 用 直 徑 0.8 mm 長 110 mm 的 毛 細 微 管 (Kimax-51) 吸 取 樣 品 滴 入 在 Silica gel 60 之 TLC 鋁 薄 片 (Art 5553, Merck, Darmstadt, Germany), 以 乙 酸 乙 酯 : 醋 酸 : 水 = 2:1:1(v/v) 之 溶 劑 為 展 開 溶 液, 並 採 用 5% 硫 酸 - 甲 醇 溶 液 為 檢 出 液, 噴 灑 鋁 薄 片 後, 將 鋁 薄 片 置 於 150 加 熱 5 min, 觀 察 鋁 薄 片 上 的 醣 類 顯 現 之 斑 點 上 述 材 料 與 方 法 中 所 使 用 之 分 析 試 藥, 均 為 Sigma 公 司 之 藥 品 : 參 考 岡 田 與 長 南 (1983) 之 方 法 萃 取 醣 類 樣 品, 再 參 考 Richmond et al. (1982) 之 方 法 以 高 效 能 液 相 層 析 儀 (HPLC) 進 行 寡 醣 之 定 量 分 析 萃 取 之 醣 類 樣 品 經 震 盪 均 勻 後, 以 0.22μm 之 無 菌 過 濾 膜 過 濾, 取 得 濾 液 後 注 入 高 效 能 液 相 層 析 儀 (L-7300, Hitachi, Tokyo, Japan), 配 合 CHO-620 分 離 管 柱 (Transgenomic, Ohama, NE) 操 作 操 作 條 件 如 下 : 移 動 相 為 去 離 子 水, 流 速 為 0.5 ml/min, 樣 品 注 入 量 為 0.25μL, 分 離 管 柱 溫 度 為 80, 檢 測 器 溫 度 為 室 溫 計 算 公 式 : 單 一 醣 類 百 分 率 (%)=( 單 一 醣 類 的 含 量 / 總 醣 類 含 量 ) 100% 測 定 項 目 所 得 的 數 據, 採 用 統 計 分 析 (SAS, 2002) 套 裝 軟 體 之 一 般 線 性 模 式 程 序 (general linear model procedure, GLM) 進 行 不 同 處 理 間 之 差 異 性 檢 定, 並 以 鄧 肯 氏 多 範 圍 檢 定 法 (Duncan's multiple range test) 進 行 處 理 均 値 差 異 性 比 較

4 286 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 38 卷 第 4 期 未 固 定 化 與 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 及 37 中 反 應 及 120 min 之 酵 素 活 性 變 化 列 於 圖 2 結 果 顯 示 未 固 定 化 與 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 分 別 於 30 反 應 及 120 min 之 酵 素 活 性 顯 著 較 37 條 件 下 處 理 者 為 高 (P < 0.05), 可 能 因 β- 半 乳 糖 苷 酶 在 30 及 ph 4.5 的 條 件 下 ( 原 料 乳 之 ph 為 6.5), 具 有 較 高 之 酵 素 活 性 (Bahl and Agrawal, 1969; Borooah et al., 1961) 此 外, 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 活 性 顯 著 較 固 定 化 處 理 者 為 高 (P < 0.05), 可 能 是 經 固 定 化 處 理 後, 固 定 在 珠 體 內 的 酵 素 釋 出 較 少, 致 其 酵 素 活 性 較 低 圖 3 及 圖 4 為 未 固 定 化 與 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 分 別 於 30 及 37 經 不 同 反 應 時 間 後, 對 牛 乳 中 總 醣 量 變 化 之 薄 層 色 層 分 析 圖, 各 處 理 組 的 顯 現 斑 點 和 標 準 品 比 對 結 果, 醣 類 由 上 而 下 依 序 為 葡 萄 糖 半 乳 糖 乳 糖 及 寡 醣 此 結 果 和 黃 (1992) Ohmiya et al.(1977) 及 Rabiu et al.(2001) 之 結 果 相 似 牛 乳 無 添 加 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 及 37 經 及 120 min 之 層 析 圖, 顯 示 只 有 乳 糖 之 斑 點 顯 現, 無 葡 萄 糖 半 乳 糖 及 寡 醣 之 斑 點 顯 現 ( 圖 3A 圖 4A) 未 固 定 化 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 ( 圖 3B 圖 3C) 及 37 ( 圖 4B 圖 4C)0 min 時, 並 無 葡 萄 糖 半 乳 糖 及 寡 醣 之 斑 點 顯 現, 而 經 及 120 min, 則 有 半 乳 糖 葡 萄 糖 及 寡 醣 之 顯 現 斑 點, 由 於 β- 半 乳 糖 苷 酶 與 牛 乳 中 乳 糖 進 行 轉 移 醣 苷 化 的 反 應, 水 解 成 半 乳 糖 葡 萄 糖 及 寡 醣 之 生 成 反 應 Enxzyme activity Enzyme activity(onpg (ONPG unit/min/ml) unit/min/ml) min. A B C D 圖 2 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 反 應 溫 度 對 酵 素 活 性 之 影 響 (Means ± SE) A: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;B: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 ;C: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;D: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 Figure 2 Enzyme activities of non-immobilized and immobilized β-galactosidase with different reaction temperatures (Means ± SE). A: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 30 ; B: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 37 : C: reaction of immobilized β-galactosidase at 30 ; D: reaction of immobilized β-galactosidase at 37.

5 β- 半 乳 糖 苷 酶 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 287 (A) 牛 乳 Glucose Galactose Lactose min. (B) 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 120 min Glucose Galactose Lactose Oligosaccharide (C) 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 120 min min. Glucose Galactose Lactose Oligosaccharide min. 圖 3 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 120 min 對 牛 乳 中 總 醣 量 之 生 合 成 薄 層 色 層 分 析 圖 Figure 3 Thin-layer chromatography (TLC) patterns of sugar content of milk reacted with non-immobilized and immobilizedβ-galactosidase at 30 for 120 min.

6 288 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 38 卷 第 4 期 (A) 牛 乳 Glucose Galactose Lactose min. (B) 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 120 min Glucose Galactose Lactose Oligosaccharide min. (C) 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 之 反 應 120 min Glucose Galactose Lactose Oligosaccharide min. 圖 4 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 120 min 對 牛 乳 中 總 醣 量 之 生 合 成 薄 層 色 層 分 析 圖 Figure 4 Thin-layer chromatography (TLC) patterns of sugar contents of milk reacted with non-immobilized and immobiliaedβ-galactosidase at 37 for 120 min.

7 β- 半 乳 糖 苷 酶 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 289 圖 5 為 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 乳 糖 進 行 轉 移 醣 苷 化 反 應 之 影 響 由 結 果 顯 示 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 處 理 之 乳 糖 減 少 的 量 顯 著 較 未 固 定 化 處 理 者 為 高 (P < 0.05), 然 而, 未 固 定 化 與 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 及 37 反 應 期 間, 乳 糖 含 量 並 無 顯 著 差 異, 此 結 果 同 Naganagouda and Mulimani (2006) 指 出 固 定 在 珠 體 內 的 酵 素 釋 出 較 少, 致 其 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 轉 移 醣 苷 化 反 應 較 緩 慢 所 導 致 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 葡 萄 糖 之 生 成 量 列 於 圖 6 結 果 顯 示 未 固 定 化 與 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 期 間 之 葡 萄 糖 含 量 顯 著 較 37 處 理 者 為 高 (P < 0.05), 可 能 因 β- 半 乳 糖 苷 酶 在 30 下, 有 較 高 之 水 解 能 力 (Ates and Mehmetoglu, 1997), 致 其 β- 半 乳 糖 苷 酶 加 入 牛 乳 中, 使 乳 糖 經 過 轉 移 醣 苷 化 反 應 中 產 生 葡 萄 糖 (Greenberg and Mahoney, 1982) 而 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 及 37 下 對 牛 乳 中 葡 萄 糖 之 生 成 皆 較 固 定 化 處 理 組 高 (P < 0.05), 此 可 能 因 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 具 有 保 護 及 緩 慢 釋 放 酵 素 與 乳 糖 進 行 轉 移 醣 苷 化 反 應, 致 其 葡 萄 糖 產 量 較 未 固 定 化 處 理 者 為 低 (Albayrak and Yang, 2002); 圖 7 為 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 半 乳 糖 生 成 之 影 響 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 期 間, 半 乳 糖 之 生 成 量 顯 著 較 37 處 理 者 為 高 (P < 0.05), 此 結 果 同 Ates and Mehmetoglu (1997) 及 Z'arate and L'opez-leiva (1990) 認 為 β- 半 乳 糖 苷 酶 在 30, 具 有 較 高 之 水 解 能 力, 致 β- 半 乳 糖 苷 酶 添 加 於 牛 乳 中, 使 乳 糖 經 過 轉 移 醣 苷 化 反 應, 進 行 半 乳 糖 之 生 成 此 外, 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 及 37 下 反 應, 對 牛 乳 中 半 乳 糖 之 生 成 量 皆 較 固 定 化 處 理 組 為 高 (P < 0.05) 固 定 及 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 之 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 寡 醣 之 生 成 影 響 列 於 圖 8 由 結 果 顯 示 未 固 定 化 與 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶, 於 30 反 應 之 寡 醣 生 成 顯 著 較 37 處 理 組 高 (P < 0.05) 此 外, 未 固 120 Lactose / Total carbohydrate content(%) min. A B C D 圖 5 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 反 應 溫 度 對 牛 乳 乳 糖 含 量 之 影 響 (Means ± SE) A: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;B: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 ;C: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;D: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 Figure 5 Changes of lactose contents of milk reacted with non-immobilized and immobilized β-galactosidase at 30 and 37 for 120 min. A: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 30 ; B: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 37 ; C: reaction of immobilizeβ-galactosidase at 37.

8 290 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 38 卷 第 4 期 Glucose / Total carbohydrate content(%) min. A B C D 圖 6 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 葡 萄 糖 含 量 之 影 響 (Means ± SE) A: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;B: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 ;C: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;D: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 Figure 6 Changes of glucose contents of milk reacted with non-immobilized and immobilized β-galactosidase at 30 and 37 for 120 min. A: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 30 ; B: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 37 ; C: reaction of immobilized β-galactosidase at 30 ; D: reaction of immobilized β-galactosidase at 37. Galactose / Total carbohydrate(%) min. A B C D 圖 7 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 半 乳 糖 含 量 之 影 響 (Means ± SE) A: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;B: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 ;C: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;D: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 Figure 7 Changes of galactose contents of milk reacted with non-immobilized and immobilized β-galactosidase at 30 and 37 for 120 min. A: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 30 ; B: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 37 ; C: reaction of immobilized β-galactosidase at 30 ; D: reaction of immobilized β-galactosidase at 37.

9 β- 半 乳 糖 苷 酶 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 Oligosaocharides / Total carbohydrate content (%) A B C D min. 圖 8 未 固 定 及 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 反 應 溫 度 對 牛 乳 中 寡 醣 之 生 合 成 影 響 (Means ± SE) A: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;B: 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 ;C: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30 反 應 ;D: 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 37 反 應 Figure 8 Changes of oligosaccharides contents of milk reacted with non-immobilized and immobilizrd β-galactosidase at 30 and 37 for 120 min. A: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 30 ; B: reaction of non-immobilized β-galactosidase at 37 ; C: reaction of immobilized β-galactosidase at 30 ; D: reaction of immobilized β-galactosidase at 37. 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 寡 醣 之 生 成 量 顯 著 較 固 定 化 處 理 者 為 高 (P < 0.05) 此 結 果 同 黃 (1992) 及 Naganagouda and Mulimani (2006) 指 出 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶, 具 有 保 護 及 緩 慢 釋 放 酵 素 與 乳 糖 進 行 轉 移 醣 苷 化 反 應, 致 其 寡 醣 之 生 成 量 較 未 固 定 化 處 理 組 低 一 般 在 低 乳 糖 含 量 時, 反 應 會 傾 向 於 乳 糖 的 水 解 作 用, 而 當 高 乳 糖 含 量 時, 乳 糖 中 的 半 乳 糖 端 碰 撞 轉 移 到 乳 糖 的 機 率 會 增 加, 反 應 會 傾 向 轉 移 醣 苷 化 反 應 而 有 助 於 寡 醣 之 形 成 (Z'arate and L'opez-leiva, 1990) 至 於 圖 8 中, 各 處 理 組 之 寡 醣 生 成 量 於 20 min 時, 幾 乎 達 到 最 高 量, 可 由 圖 3 及 圖 4 簿 層 色 層 分 析 圖 中, 經 20 min 反 應 後 之 寡 醣 斑 點 得 到 驗 證 考 量 到 經 濟 性 及 效 率 性, 牛 乳 中 乳 糖 的 減 量 方 式, 以 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30~37 作 用 40 min 之 條 件 最 佳 ; 而 若 要 增 加 牛 乳 中 寡 醣 之 生 成 量, 利 用 未 固 定 化 β- 半 乳 糖 苷 酶 於 30~37 反 應 20 min, 為 生 成 寡 醣 之 最 適 宜 的 條 件

10 292 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 38 卷 第 4 期 陳 國 誠 1992 微 生 物 酵 素 工 程 學, 第 頁 藝 軒 圖 書 出 版 社, 台 北 市 黃 建 榕 1992 Aspergillus oryzae β-galactosidase 於 乳 糖 水 解 過 程 寡 醣 類 之 生 合 成 畜 產 研 究 25: 張 勝 善 李 忠 正 沈 華 山 洪 連 欉 鄭 祝 菁 1994 固 定 化 酵 母 菌 應 用 於 全 蛋 液 之 除 糖 中 畜 會 誌 23: 岡 田 迪 德 長 南 龍 夫 1983 高 速 液 體 クロマトグラフィ-によゐ 牛 乳 中 の 乳 糖 定 量 日 畜 會 報 54: Albayrak, N., and S. T. Yang Immobilization of Aspergillus oryzae β-galactosidase on tosylated cotton cloth. Enzyme Microbiol. Tech. 31: Ates, S., and U. Mehmetoglu A new method for immobilization of β-galactosidase and its utilization in a plug flow reactor. Process Biochem. 32: Bahl, O. P., and K. M. L. Agrawal Enzymatic assay of β-galactosidase. J. Biol. Chem. 244: Borooah, S., D. H. Leaback, and P. G. Walker Enzymatic assay of β-galactosidase. Biochem. J. 78: Chibata, I., T. Tosa, T. Sato, R. Sano, K. Yamamoto, and Y. Matuo Immobilizedl-aspartic acid. Methods Enzy. 34: Greenberg, N. A., and R. R. Mahorey Production and characterization of β-galactosidase from Streptococcus thermophilus. J. Food Sci. 47: Gumming, J. H., M. B. Roberfroid, H. Andersson, C. Barth, A. Ferro-Luzzi, Y. Pascal, and A. G. S. Voragen A newlook at dietary carbohydrate: chemistry physiology and health. Eur. J. Clin. Nutr. 51: Hartmeier, W Industrial application. Page in Immobilized Biocatalysts. Heidelberg. New York City. Hekmat, S., and D. J. Mcmahon Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum in ice cream for use as a probiotic food. J. Dairy Sci. 75: Ichiro, C., T. Tosa, and T. Sato Methods of cell immobilization. Page in Manual Industrial Microbiology and Biotechnology. Mermelstein, N. H Immobilized enzymes produces high-fructose corn. Food Technol. 29: Naganagouda, K., and V. H. Mulimani Gelatin blends with alginate: Gel fibers for α-galactosidase immobilization and its application in reduction of non-digestible oligosaccharides in soymilk. Process Biochem. 41: Ohmiya, K., O. Hiroshi, K. Takeshi, and S. Shoichi Hydrolysis of Lactose by immobilized microorganisms. Appl. Environ Microbiol. 34: Okazaki, M., S. Fujikawa, and N. Matsumomo Effect of xylool oligosaccharides on the growth of bifidobacteria. Bifidobacteria Microflora 9: Rabiu, B. A., J. J. Andrew, R. G. Glenn, and A. R. Robert Synthesis and fermentation properties of novel galactooligosaccharides by β-galactosidases from Bifidobacterium species. Appl. Environ Microbiol. 54:

11 β- 半 乳 糖 苷 酶 對 牛 乳 中 寡 醣 生 成 之 影 響 293 Richmond, M. L., D. L. Barfuss, B. R. Harte, J. I. Gray, and C. M. Stine Separation of carbohydrates in dairy products by high performance liquid chromatograph. J. Dairy Sci. 65: SAS SAS Procedure Guide for Personal Computers. 6 th Ed. SAS Institute, Inc., Cary, NC. Tosa, T., and T. Shibatani Industrial application of immobilized biocatalysts in Japan. Ann. New York Acad. Sci. 750: Tomomatsu, H Health effects of oligosaccharide. Food Technol. 148: Z'arate, S., and M. H. L'opez-leiva Oligosaccharide formation during enzymatic lactose hydrolysis: A literature review. J. Food Protect. 53:

12 J. Chin. Soc. Anim. Sci. 38(4):283~294, 2009 Effects of β-galactosidase on oligosaccharides yield in milk Chun-Chi Chen (1), Tsai-Fuh Tseng (1), Chien-Jung Huang (2) and Wen-Shyan Chen (2)(3) ABSTRACT The purpose of this study was to compare the effects of non-immobilized and immobilized β-galactosidase at different temperature (30 and 37 ) on oligosaccharides yield in milk. Na-alginate solution (2%) was used to produce immobilized β-galactosidase beads. The immobilized and non-immobilized β-galactosidase were added in milk respectively, and their effects on oligosaccharides formation at 0, 20, 40, 60, 80, 100, and 120 min were determined. Treatments were evaluated for five parameters: enzyme activity of β-galactosidase, glucose, galactose, lactose and oligosaccharides content. The results showed that non-immobilized β-galactosidase had higher enzyme activities than those of immobilized β-galactosidase (P < 0.05). Glucose, galactose, lactose, and oligosaccharides were found when milk was treated with β-galactosidase for 20 min. According to the results of oligosaccharides contents, the optimum condition for oligosaccharides yield was set at 30~37 for 20 min. (Key Words: β-galactosidase, Immobilized enzyme, Oligosaccharide) (1) Department of Animal Science, National Chiayi University, 300 Syuefu Road, Chiayi City 600, Taiwan. (2) Animal Products Processing Division, Livestock Research Institute, Council of Agriculure, Execute Yuan, 112 Fram Road, Hsinhua, Tainan 712, Taiwan. (3) Corresponding author, wschen@mail.tlri.gov.tw

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