章名 標題1 (上36/下12, Alt-F1)

Transcription

1 Purification and Identification of Expressed Protein 第 四 章 表 現 蛋 白 質 之 純 化 與 檢 定 台 灣 大 學 生 化 科 技 學 系 莊 榮 輝 表 現 目 標 基 因 得 到 蛋 白 質 後, 可 以 進 行 各 種 純 化 方 法 ( 蛋 白 質 抽 取 膠 体 過 濾 法 離 子 交 換 法 親 和 層 析 法 等 ), 以 便 分 離 出 目 標 蛋 白 質 ; 同 時 並 檢 定 其 各 種 基 本 生 化 性 質 ( 如 蛋 白 質 定 量 酵 素 活 性 分 析 膠 体 電 泳 免 疫 轉 印 等 ) 本 章 是 以 表 現 蛋 白 質 GUS 為 例, 說 明 其 純 化 及 檢 定 方 法 ; 因 為 各 種 蛋 白 質 的 性 質 差 異 很 大, 因 此 每 種 蛋 白 質 都 有 其 特 定 的 純 化 或 檢 定 條 件, 必 須 個 別 去 找 出 其 自 身 的 條 件 本 章 整 體 實 驗 流 程 如 圖 4.1 所 示 4.1 蛋 白 質 純 化 方 法 利 用 蛋 白 質 間 生 化 特 性 的 差 異, 可 以 分 離 並 純 化 出 各 種 蛋 白 質 純 化 蛋 白 質 的 方 法 主 要 是 以 色 層 分 析 法 進 行, 但 是 利 用 蛋 白 質 分 子 物 理 或 化 學 特 性 的 沈 澱 方 法, 也 是 相 當 簡 單 有 效 而 且 經 濟 蛋 白 質 抽 取 蛋 白 質 在 細 菌 中 表 現 後, 以 反 覆 的 冷 凍 - 解 凍 方 法 打 破 細 胞, 再 用 硫 酸 銨 把 蛋 白 質 沉 澱 下 來, 此 步 驟 可 以 去 除 大 部 份 核 酸 多 醣 脂 質 等 雜 物 儀 器 用 具 : 恆 溫 震 盪 培 養 箱 37 高 速 冷 凍 離 心 機 及 離 心 管 ( 使 用 20,000 rpm 離 心 陀 ) 使 用 高 速 離 心 機 要 注 意 : 離 心 機 及 離 心 陀 的 溫 度 要 預 冷 完 全, 相 對 位 置 的 兩 隻 離 心 管 要 平 衡 好, 離 心 陀 轉 速 絕 對 不 能 超 過 最 高 速 限 液 態 氮 及 冰 筒 37 溫 水 浴 藥 品 試 劑 : 轉 型 菌 株 pqg11/m15 [prep] 單 一 菌 落 LB/amp/kan 及 IPTG (1 M stock) Lysis buffer (50 mm Na 3 PO 4 12H 2 O, ph 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mm EDTA; 0.2% Triton X-100) 使 用 前 添 加 成 10 mm β-mercaptoethanol, 25 μg/ml PMSF, 40 μg/ml lysozyme Buffer A-0 (50 mm Na 3 PO 4, ph 7.0) 使 用 前 每 1 L 添 加 70 μl β-mercaptoethanol 成 為 10 mm 最 終 濃 度 Buffer A-150: Buffer A-0 再 加 有 0.15 M NaCl 硫 酸 銨 ( 要 烘 乾 並 以 研 砵 磨 碎 ) 生 物 技 術 方 法 卷 一 67

2 Protein Purification 各 實 驗 進 行 流 程 圖 Extraction Transformants 大 量 培 養 XT 定 量 及 活 性 Ammonium sulfate fractionation TP 全 蛋 白 白 質 質 Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography GF IEX AF 分 子 量 測 定 XT TP GF IEX AF 樣 本 收 集 optional 抗 体 檢 定 Western transfer 轉 印 SDS-PAGE 定 量 及 活 性 比 較 純 化 效 果 圖 4.1 蛋 白 質 純 化 與 檢 定 實 驗 操 作 的 流 程 68 Methods in Biotechnology Vol 1

3 方 法 步 驟 : 1) 挑 取 培 養 皿 上 單 一 菌 落, 培 養 在 15 ml 之 LB/amp/kan 液 體 培 養 基 中, 以 120 rpm 轉 速 震 盪, 在 37 下 培 養 過 夜 2) 取 上 述 菌 液 6 ml 加 入 300 ml 新 鮮 LB/amp/kan 培 養 基 中, 以 120 rpm 37 培 養 至 A 600 = 0.6 後, 加 入 IPTG 成 為 1 mm 濃 度, 繼 續 以 120 rpm 在 37 震 盪 培 養 4 h 3) 將 菌 液 倒 入 50 ml 離 心 管 (conical tube) 中 離 心 10 min (5,000 rpm) 4) 倒 去 上 清, 可 將 菌 塊 連 同 離 心 管 置 -20 冰 箱 貯 存 5) 取 出 含 菌 塊 之 離 心 管 置 碎 冰 上, 待 菌 塊 溶 解 後, 以 殘 存 液 體 均 勻 懸 濁 之 再 加 入 10 ml lysis buffer 輕 輕 懸 浮 之 6) 將 菌 液 放 在 液 態 氮 中 冷 凍 1 min, 然 後 在 37 水 浴 中 搖 盪 溶 解 之 如 此 反 覆 三 次, 儘 量 不 要 產 生 大 量 氣 泡 將 離 心 管 的 內 容 物 倒 入 50 ml 高 速 離 心 機 的 離 心 管 內 7) 離 心 20 min (12,000 rpm, 4 ) 取 上 清 共 ml, 稱 為 粗 抽 取 液 (XT); 預 留 100 μl 以 便 日 後 一 起 進 行 分 析 此 後 樣 本 均 得 放 置 碎 冰 上, 以 低 溫 進 行 實 驗 8) 此 上 清 加 入 5 ml buffer A-0 混 勻 後 倒 入 燒 杯, 置 碎 冰 上 放 冷, 不 時 攪 拌 並 緩 緩 加 入 固 體 硫 酸 銨 gm, 使 成 為 70% 飽 和 度, 加 完 後 再 攪 拌 10 min 參 照 表 4.1 找 出 該 體 積 所 要 加 的 固 體 硫 酸 銨, 以 達 70% 飽 和 度 9) 離 心 20 min (12,000 rpm, 4 ) 後 小 心 倒 去 上 清, 取 白 色 沈 澱 部 份 10) 沈 澱 加 以 2 ml buffer A-150 均 勻 懸 濁 之, 再 以 桌 上 型 離 心 機 去 除 不 溶 物 質, (10,000 rpm, 5 min), 共 得 ml, 稱 為 全 蛋 白 質 (TP); 預 留 100 μl, 連 同 上 述 XT 置 4 冷 藏 11) 其 餘 溶 液 部 份 準 備 進 行 膠 體 過 濾 層 析, 標 示 清 楚 後 置 4 冷 藏 註 解 討 論 : a. 緩 衝 液 中 為 何 還 要 添 加 某 些 藥 品 或 試 劑? ( 例 如 硫 酸 銨, NaCl, EDTA, PMSF, Triton X-100, β-mercaptoethanol 等 ) b. 以 下 處 理 的 意 義 何 在 : 為 何 要 冰 浴 分 別 取 沉 澱 或 上 清 冷 藏 或 凍 藏? c. 為 何 反 覆 冷 凍 - 解 凍 可 以 把 細 菌 打 破? 還 有 哪 些 方 法 可 以 打 破 菌 體? d. 以 lysis buffer 破 菌 時, 如 何 得 知 你 的 細 胞 確 實 有 破 裂? e. 在 細 胞 打 破 之 後, 想 像 你 的 目 標 樣 本 或 蛋 白 質, 會 處 在 何 種 環 境? f. 蛋 白 質 沈 澱 時 為 何 要 緩 緩 加 入 硫 酸 銨? 若 加 太 快 會 有 何 種 後 果? g. 若 你 的 目 標 蛋 白 質 不 會 被 飽 和 硫 酸 銨 沈 澱 下 來, 你 將 如 何 繼 續 實 驗? 這 給 你 何 種 訊 息? 生 物 技 術 方 法 卷 一 69

4 表 4.1 百 分 飽 和 濃 度 硫 酸 銨 之 添 加 量 硫 酸 銨 起 始 百 分 飽 和 濃 度 0 最 終 硫 酸 銨 百 分 飽 和 濃 度 加 入 1 L 溶 液 中 之 固 態 硫 酸 銨 克 數 本 表 數 據 來 自 Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291, 而 該 表 原 始 資 料 又 來 自 Data for Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press. 70 Methods in Biotechnology Vol 1

5 4.1.2 膠 体 過 濾 法 不 同 大 小 的 蛋 白 質 分 子 進 入 膠 體 過 濾 管 柱, 可 依 其 分 子 量 差 異 分 離 ; 是 一 種 廣 泛 應 用 的 partition 色 析 法 (Pharmacia 操 作 手 冊, Gel Filtration) 儀 器 設 備 : 色 析 管 柱 (Pharmacia C column, cm) 鐵 架 鐵 夾 及 水 平 儀 此 種 管 柱 的 底 面 積 是 2 cm 2, 因 此 其 總 體 積 為 200 ml 分 劃 收 集 器 (fraction collector, 需 準 備 乾 淨 試 管 約 100 支 ) 收 集 分 劃 有 滴 數 體 積 時 間 三 種 選 擇, 因 為 我 們 不 使 用 輸 液 幫 浦, 因 此 只 能 用 滴 數 分 劃, 請 先 定 好 若 干 滴 收 一 個 體 積 分 劃 濃 縮 用 離 心 機 ( 低 速 5,000 rpm) 一 般 細 胞 實 驗 用 的 離 心 機 即 可, 若 用 高 速 離 心 機 則 以 低 速 轉 動, 但 無 法 蓋 上 離 心 陀 的 蓋 子, 離 心 過 程 要 特 別 小 心 濃 縮 用 離 心 管 Centriprep-30 (Amicon 4322) 請 注 意 其 使 用 方 法 Centriprep 系 列 是 利 用 離 心 力 壓 擠 小 分 子, 使 之 濾 過 超 微 薄 膜 上 的 小 孔 洞, 是 一 種 超 微 過 濾 法 (ultrafiltration);centriprep-30 可 濾 過 30 kd 以 下 的 分 子, 因 此 可 以 把 水 分 子 濾 走, 以 達 濃 縮 效 果 藥 品 試 劑 : 膠 體 Sephacryl S-300 (Pharmacia): a. 預 先 以 緩 衝 液 buffer A-150 平 衡 好, 並 且 使 完 全 沈 降 後 的 膠 體 體 積, 佔 全 部 體 積 的 七 至 八 成 ; 要 先 預 估 好 膠 體 的 使 用 量 b. 膠 體 溫 度 要 與 操 作 場 所 的 溫 度 一 致, 否 則 溫 度 變 化 會 產 生 氣 泡 c. Sephacryl 系 列 膠 體 有 相 當 大 的 吸 附 力, 因 此 要 在 緩 衝 液 加 入 0.15 M 以 上 的 NaCl 以 除 去 非 專 一 性 吸 附 一 般 膠 體 過 濾 法 均 在 冷 房 內 操 作, 但 為 方 便 起 見, 本 實 驗 均 在 室 溫 下 操 作 ; 要 儘 量 保 持 室 溫 的 恆 定, 否 則 膠 體 溫 度 的 變 化 會 造 成 氣 泡 的 生 成 Buffer A-150: 注 意 使 用 時 的 溫 度 要 與 管 柱 膠 體 的 溫 度 一 致 標 準 分 子 量 組 合 (Bio-Rad ): 溶 於 1 ml 後 每 組 取 0.4 ml 含 有 thyroglobulin (670 kd), bovine gamma globulin (158 kd), chicken ovalbumin (44 kd), equine myoglobin (17 kd), vitamin B 12 (1,350) 除 了 上 述 標 準 分 子 量 的 各 種 蛋 白 質 外, 也 可 加 入 目 標 酵 素 一 起 進 行 膠 體 過 濾, 並 以 活 性 分 析 定 出 目 標 酵 素 的 溶 離 體 積 方 法 步 驟 : 管 柱 裝 填 : 1) 以 純 水 沖 洗 玻 璃 管 柱 ( 以 純 水 上 下 沖 洗 即 可, 嚴 禁 使 用 試 管 刷 ); 並 請 了 解 管 柱 的 構 造 與 拆 裝 方 法, 垂 直 架 好 管 柱, 以 軟 管 連 接 分 劃 收 集 器, 並 以 buffer A-150 試 看 管 路 是 否 通 暢 ; 可 以 用 止 血 鉗 或 長 尾 文 書 夾 夾 住 出 口 軟 管, 則 可 控 制 溶 離 的 進 行 注 意 系 統 的 擺 設 要 適 當, 不 要 裝 置 於 交 通 要 衝 生 物 技 術 方 法 卷 一 71

6 頂 端 端 蓋 膠 柱 底 端 端 蓋 2) 依 預 估 量 取 出 Sephacryl 膠 體, 注 意 膠 體 的 溫 度 與 緩 衝 液 是 否 已 平 衡 ; 將 瓶 中 的 膠 體 上 下 震 盪, 使 之 完 全 懸 浮, 但 勿 產 生 太 多 氣 泡 3) 在 管 柱 內 加 入 約 10 cm 高 緩 衝 液, 然 後 將 膠 體 慢 慢 沿 著 管 壁 倒 入 管 柱, 一 直 加 到 管 柱 頂 端, 開 始 流 洗 後 膠 體 沈 降 很 快 當 膠 體 上 方 的 液 面 逐 漸 降 低 時, 可 於 頂 端 添 加 膠 體, 以 達 所 要 高 度 ; 膠 體 高 度 約 90 cm 4) 膠 體 完 全 沈 降 後, 小 心 以 buffer A-150 加 滿 管 柱, 關 閉 出 口, 裝 上 頂 端 端 蓋 並 連 通 緩 衝 液 瓶, 打 開 出 口 以 重 力 流 洗 調 整 緩 衝 液 瓶 高 度, 使 流 速 約 每 五 ~ 六 秒 一 滴, 並 設 定 收 集 體 積 為 2.5 ml/tube 5) 膠 柱 流 洗 約 100 ml 後, 關 閉 出 口, 拆 開 頂 端 端 蓋, 先 以 滴 管 吸 出 膠 體 上 方 的 溶 液 到 剩 約 1 cm 高, 注 意 勿 破 壞 膠 體 表 面 平 整 ; 然 後 打 開 出 口, 使 液 面 下 降 至 膠 體 面, 再 關 閉 出 口, 準 備 注 入 樣 本 樣 本 色 析 進 行 : 6) 以 微 量 吸 管 或 滴 管 吸 取 樣 本 ( 樣 本 體 積 不 得 超 過 膠 體 總 體 積 的 3%), 沿 著 膠 體 上 方 管 壁 緩 慢 加 入, 注 意 切 勿 破 壞 膠 體 的 平 整 表 面! ( 樣 本 確 實 體 積 ml) 7) 打 開 出 口, 同 時 開 啟 分 劃 收 集 器 ; 當 樣 本 完 全 沒 入 膠 體 時, 關 閉 出 口, 緩 緩 加 入 與 樣 本 相 等 體 積 的 buffer A-150, 打 開 出 口 待 其 慢 慢 進 入 膠 體 中, 如 此 重 複 二 次 不 得 擾 動 膠 體 表 面, 造 成 凹 陷 8) 暫 時 關 閉 出 口, 將 液 面 高 度 加 滿 至 管 柱 頂 端, 並 把 頂 端 端 蓋 鎖 上 ; 然 後 打 開 出 口 開 始 溶 離, 調 整 緩 衝 液 瓶 的 高 度, 使 流 速 為 6 s 一 滴 9) 要 留 心 觀 察 前 面 幾 個 分 劃, 確 定 整 個 系 統 運 轉 無 礙, 小 心 分 劃 收 集 器 最 容 易 出 問 題 管 柱 預 計 將 流 洗 過 夜, 收 集 約 80 管 10) 收 集 分 劃 試 管, 進 行 蛋 白 質 定 量 分 析 以 及 GUS 活 性 測 定, 並 請 作 圖 蛋 白 質 定 量 及 GUS 活 性 分 析 方 法, 請 見 下 面 數 節 (4.2.1, 4.2.2) 11) 收 集 GUS 活 性 區, 以 Centriprep-30 濃 縮 至 10 ml 後, 加 buffer A-0 稀 釋 至 20 ml, 再 次 濃 縮 至 ml (GF), 保 留 100 μl 12) 管 柱 請 再 以 buffer A-150 流 洗 100 ml 後, 小 心 放 置 一 旁, 準 備 以 後 進 行 分 子 量 測 定 在 此 期 間, 請 注 意 不 要 讓 管 柱 膠 體 乾 掉, 也 要 注 意 膠 體 溫 度 不 可 變 化 太 大, 否 則 膠 體 內 將 會 產 生 氣 泡, 無 法 再 用, 必 須 重 新 裝 填 分 子 量 測 定 : 13) 進 行 分 子 量 測 定 前 一 天, 請 先 以 buffer A-150 流 洗 100 ml, 並 檢 查 膠 柱 內 有 無 氣 泡 產 生, 若 有 嚴 重 的 氣 泡 或 乾 裂, 必 須 重 新 裝 填 管 柱 14) 取 標 準 分 子 量 溶 液 0.4 ml, 加 上 純 質 目 標 酵 素 0.5 ml ( 以 親 和 層 析 法 所 得 之 AF 部 份 ), 如 上 法 注 入 管 柱 中, 立 刻 開 始 進 行 膠 體 過 濾, 並 收 集 各 分 劃 請 依 循 上 述 所 有 管 柱 及 分 劃 收 集 器 的 操 作 要 點 15) 收 集 所 得 的 各 分 劃, 進 行 蛋 白 質 定 量 分 析, 可 定 出 數 個 蛋 白 質 尖 峰, 以 作 為 分 子 量 依 據 ; 另 以 目 測 法, 決 定 紅 色 高 峰 的 管 數, 則 可 定 出 vitamin B 12 的 溶 離 管 數 利 用 以 上 數 據, 可 畫 出 分 子 量 與 溶 離 管 數 間 的 直 線 關 係, 作 為 分 子 量 判 定 的 標 準 校 正 線 72 Methods in Biotechnology Vol 1

7 16) 同 樣 的 一 批 分 劃, 請 進 行 酵 素 活 性 分 析 (GUS), 則 可 定 出 酵 素 的 溶 離 體 積, 對 照 上 述 標 準 校 正 線, 則 可 求 出 酵 素 的 分 子 量 拆 除 管 柱 及 保 存 膠 體 : 17) 若 管 柱 長 期 不 用, 應 當 自 管 柱 中 取 出 膠 體, 以 緩 衝 液 清 洗 後, 置 冷 藏 室 中 保 存, 但 絕 對 不 要 放 在 冷 凍 箱 中 膠 體 若 裝 填 太 緊, 有 時 可 能 不 易 取 出, 要 有 耐 心 地 以 緩 衝 液 慢 慢 沖 出 來 18) 膠 體 可 以 加 0.01% NaN 3 防 止 霉 菌 生 長, 但 使 用 前 記 得 要 洗 去 ; 再 度 使 用 時, 請 檢 查 膠 體 中 有 無 灰 黑 色 霉 菌 顆 粒, 若 有 結 塊 而 不 易 打 散 者, 也 不 要 使 用 註 解 討 論 : a. 在 裝 填 管 柱 之 前, 要 先 估 計 所 要 的 膠 體 體 積 多 少, 如 何 預 估? b. Sephacryl 膠 體 層 析 之 操 作, 要 緊 密 裝 填 管 柱 膠 體, 為 何 要 如 此 做? c. 在 實 際 操 作 裝 填 管 柱 之 前, 請 先 以 空 的 管 柱 模 擬 整 個 過 程 d. 何 謂 色 層 分 析 法? 為 何 膠 體 過 濾 法 是 一 種 partition 色 析 法? e. 本 實 驗 班 所 使 用 到 的 色 層 分 析 用 具, 雖 已 經 相 當 齊 全, 但 離 正 式 研 究 需 求, 仍 有 一 點 距 離 以 下 列 出 一 般 常 用 的 色 析 純 化 設 備 ( 如 圖 4.2): (1) 梯 度 製 造 器 可 在 離 子 交 換 法 時, 拉 出 各 種 溶 離 梯 度 (2) 輸 液 幫 浦 可 以 穩 定 而 有 效 地 輸 送 緩 衝 液 進 入 管 柱 (3) 管 柱 可 以 加 裝 reservoir 以 便 一 次 完 成 膠 體 的 裝 填 ; 也 可 在 膠 體 裝 填 完 成 之 後, 在 膠 面 上 方 接 一 adaptor 以 便 消 除 無 效 空 間 (4) 監 視 及 記 錄 器 可 同 步 監 視 管 柱 溶 離 出 來 的 物 質, 且 忠 實 記 錄 (5) 分 劃 收 集 器 可 收 集 所 有 的 溶 離 分 劃, 是 最 不 可 缺 的 用 具 梯 度 製 造 器 (1) (2) 幫 浦 adaptor (3) (4) 記 錄 器 緩 衝 液 A reservoir 膠 體 裝 填 管 柱 膠 體 監 視 器 (5) 分 劃 收 集 器 圖 4.2 色 析 法 的 全 套 設 備 及 裝 置 生 物 技 術 方 法 卷 一 73

8 4.1.3 離 子 交 換 法 各 種 蛋 白 質 分 子 上 可 能 帶 有 不 同 的 電 性, 經 過 離 子 交 換 管 柱, 可 依 其 分 子 帶 電 性 的 差 異 而 分 離 開 來 (Pharmacia 操 作 手 冊, Ion Exchange) 儀 器 設 備 : 塑 膠 管 柱 (Bio-Rad Econo-Pac column , cm) 分 劃 收 集 器 (fraction collector, 另 需 準 備 乾 淨 試 管 約 60 支 ) 濃 縮 用 離 心 機 ( 低 速 5,000 rpm) 及 濃 縮 離 心 管 Centriplus 藥 品 試 劑 : DEAE Sephacel ( 膠 體 體 積 約 15 ml, 預 先 以 緩 衝 液 Buffer A-0 平 衡 好 ) Buffer A-0 ( 如 上 述 配 法 ) Buffer A-300 溶 離 液 :Buffer A-0 加 有 0.3 M NaCl Buffer A-500 溶 離 液 :Buffer A-0 加 有 0.5 M NaCl 方 法 步 驟 : 1) 將 Econo-Pac 管 柱 架 好, 並 將 三 向 閥 及 軟 管 等 組 合 完 成 2) 震 盪 DEAE Sephacel 膠 體 使 之 懸 浮, 小 心 倒 入 管 柱 中, 讓 膠 體 慢 慢 沈 降, 在 沈 降 過 程 中 隨 時 加 入 buffer A-0, 勿 使 膠 體 乾 掉 3) 待 膠 體 沈 降 完 全 後, 高 度 應 在 15 cm 左 右 膠 柱 以 buffer A-0 一 直 流 洗, 流 速 快 慢 可 以 不 考 慮 ; 連 接 好 收 集 器, 每 試 管 收 2.5 ml 離 子 交 換 法 的 膠 體 平 衡 極 為 重 要, 可 測 流 出 液 的 ph 或 離 子 濃 度, 看 是 否 與 buffer A-0 相 同, 若 不 一 樣 則 需 要 再 流 洗 之 4) 樣 本 的 添 加 方 法 同 上 述 膠 體 過 濾 法, 並 啟 動 分 劃 收 集 器 開 始 收 集, 當 樣 本 全 部 沒 入 膠 體 後, 再 加 入 同 體 積 buffer A-0 以 buffer A-0 流 洗 50 ml 後, 去 除 膠 體 上 方 的 緩 衝 液, 但 勿 使 膠 體 乾 掉 5) 然 後 依 序 以 buffer A-300, buffer A-500 溶 離 之, 每 批 次 流 洗 各 50 ml, 注 意 更 換 濃 度 時, 膠 體 上 方 勿 殘 存 上 一 種 溶 液 6) 收 集 所 有 分 劃, 進 行 蛋 白 質 定 量 分 析 以 及 GUS 活 性 測 定, 結 果 作 圖 7) 收 集 GUS 活 性 區, 並 以 Centriprep-30 濃 縮 至 ml (IEX), 記 得 要 保 留 100 μl 8) 離 子 交 換 膠 體 以 buffer A-0 洗 過 50 ml 後, 收 起 來 交 回 註 解 討 論 : a. 離 子 交 換 膠 體 一 定 要 平 衡 在 緩 衝 液 中, 如 何 確 知 膠 體 已 平 衡 完 全? b. 為 何 要 逐 漸 升 高 鹽 濃 度? 其 作 用 機 理 為 何? c. 蛋 白 質 分 子 大 多 帶 有 電 荷, 此 種 性 質 是 如 何 形 成 的? d. 在 實 際 操 作 裝 填 管 柱 之 前, 請 先 在 心 中 或 紙 上 模 擬 整 個 實 驗 過 程 74 Methods in Biotechnology Vol 1

9 4.1.4 親 和 層 析 法 若 表 現 蛋 白 質 上 含 有 一 段 六 個 His 的 片 段, 而 親 和 吸 著 劑 膠 體 上 接 有 鎳 離 子, 此 蛋 白 質 會 專 一 性 地 結 合 到 吸 著 膠 體 ; 洗 去 雜 質 後 可 用 imidazole 溶 離 純 質 蛋 白 質 (Pharmacia 操 作 手 冊, Affinity Chromatography) 儀 器 設 備 : 親 和 層 析 管 柱 (Bio-Rad Poly-Prep column, cm) 分 劃 收 集 器 ( 另 需 準 備 乾 淨 試 管 約 25 支 ) 藥 品 試 劑 : 金 屬 螯 合 親 和 層 析 膠 體 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 ml 在 洋 菜 膠 粒 上 接 有 nitrilotriacetic acid (NTA) 官 能 基, 可 以 螯 合 鎳 離 子 ; 使 用 前 先 以 鎳 離 子 飽 和 之 Buffer B-300/0 (50 mm Na 3 PO 4, ph 8.0; 0.3 M NaCl) 使 用 前 才 添 加 成 10 mm β-mercaptoethanol Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加 有 20 mm imidazole Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加 有 250 mm imidazole 方 法 步 驟 : 1) 親 和 層 析 膠 體 1 ml 已 經 裝 填 在 管 柱 內, 成 為 一 淡 藍 色 膠 柱 請 把 管 柱 架 直 在 鐵 架 上, 去 除 下 方 的 填 塞 物, 用 buffer B-300/0 流 洗 20 ml 後 塞 住 出 口, 準 備 注 入 樣 本 2) 除 去 膠 面 上 方 的 緩 衝 液, 並 取 出 樣 本 (IEX) 使 其 回 到 室 溫, 慢 慢 用 滴 管 加 到 親 和 膠 體 上, 小 心 勿 弄 亂 膠 體 表 面 ; 讓 樣 本 沒 入 膠 體 中, 同 時 收 集 流 出 液 每 管 2.5 ml 3) 待 樣 本 全 部 進 入 膠 體 後, 關 閉 出 口, 再 慢 慢 加 入 buffer B-300/20, 打 開 出 口 收 集 流 出 液 ;buffer B-300/20 共 流 洗 30 ml 4) 接 著 以 buffer B-300/250 流 洗 30 ml, 方 法 同 上, 收 集 各 分 劃 5) 所 有 分 劃 均 定 量 蛋 白 質 並 測 定 酵 素 活 性, 收 集 酵 素 活 性 最 高 的 數 個 分 劃, 共 得 ml (AF), 保 留 100 μl 以 供 分 析 註 解 討 論 : a. 離 子 交 換 法 及 親 和 層 析 法 操 作 時, 當 你 要 換 用 另 一 種 溶 離 液 時, 膠 體 表 面 上 能 不 能 留 有 原 來 的 緩 衝 液? b. 目 標 蛋 白 質 GUS 是 如 何 接 到 親 和 膠 體 上? 又 是 如 何 被 溶 離 下 來 的? c. 若 你 發 現 蛋 白 質 無 法 結 合 到 Ni-NTA 親 和 膠 體 上 去, 但 你 確 定 蛋 白 質 上 有 His 片 段, 則 如 何 解 釋 之? d. 親 和 層 析 法 的 種 類 非 常 多, 只 要 兩 種 物 質 間 有 專 一 性 的 親 和 力, 就 可 設 計 以 親 和 法 來 進 行 純 化 工 作, 請 儘 量 舉 出 你 所 知 道 的 各 種 例 子 生 物 技 術 方 法 卷 一 75

10 4.2 蛋 白 質 檢 定 方 法 蛋 白 質 定 量 分 析 Bradford 的 dye-binding method 是 利 用 Coomassie brilliant blue G-250 (CBG) 可 與 蛋 白 質 結 合 而 變 色 的 特 性 來 定 量 (Bradford, 1976); 若 試 樣 中 的 蛋 白 質 量 較 多, 則 結 合 到 蛋 白 質 而 變 色 的 CBG 也 多, 因 而 呈 色 較 深 下 例 是 以 一 組 標 準 蛋 白 質 為 對 象, 製 作 一 條 蛋 白 質 量 與 吸 光 度 的 標 準 校 正 線 儀 器 用 具 : ELISA 光 度 計 (Dynatech) 可 在 一 分 鐘 內 測 完 一 片 滴 定 盤 微 量 滴 定 盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb ) Micro test tubes, 大 頭 針 或 噴 火 槍 藥 品 試 劑 : (a) Buffer A-0 (b) BSA 標 準 品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/ml) (c) 未 知 濃 度 樣 本 (unknown BSA, 0.8 ml, 由 教 師 調 配 發 給 ) (d) Dye Reagent (Bio-Rad ) 先 以 水 稀 釋 四 倍 備 用 以 染 料 Coomassie brilliant blue G-250 配 製 的 溶 液, 勿 與 膠 體 電 泳 染 色 用 的 CBR-250 混 淆, 各 有 其 使 用 上 的 特 色, 不 要 互 用 標 準 品 及 樣 本 : 標 準 品 系 列 : 使 用 小 試 管 準 備 一 組 BSA (b) 標 準 品 的 系 列 稀 釋 : Label BSA (b) Buffer A-0 Final Conc. #5 500 μl 0 μl 100 μg/ml 混 合 均 勻 #4 400 μl 100 μl 80 μg/ml 混 合 均 勻 #3 300 μl 200 μl 60 μg/ml 混 合 均 勻 #2 200 μl 300 μl 40 μg/ml 混 合 均 勻 #1 100 μl 400 μl 20 μg/ml 混 合 均 勻 #0 0 μl 500 μl 0 μg/ml 混 合 均 勻 配 製 一 定 要 精 準, 否 則 校 正 直 線 不 會 很 準 確 ; 各 種 試 劑 的 添 加, 若 自 稀 往 濃 取 樣, 則 可 以 不 用 換 吸 管 頭 未 知 樣 本 : 再 以 上 述 unknown BSA (c) 準 備 兩 種 未 知 樣 本 : Label 未 知 樣 本 (c) Buffer A-0 Final Conc. X1 500 μl 0 μl 2 混 合 均 勻 X2 250 μl 250 μl 1/2 混 合 均 勻 76 Methods in Biotechnology Vol 1

11 一 般 樣 本 : 1) 通 常 由 色 析 法 所 收 集 到 的 各 分 劃 樣 本, 都 可 以 直 接 進 行 蛋 白 質 定 量 分 析 ; 但 若 其 中 含 有 某 些 干 擾 因 子 ( 如 含 有 Triton), 或 樣 本 的 濃 度 太 濃, 都 必 須 將 樣 本 稀 釋 後 再 測 2) 同 一 樣 本 的 若 干 不 同 稀 釋 濃 度, 所 測 出 來 的 最 終 蛋 白 質 濃 度 會 有 差 異, 通 常 是 以 稀 釋 度 大 者 較 為 準 確 方 法 步 驟 : 1) 每 槽 先 加 好 50 μl 標 準 品 (#0, #1... #5) 或 未 知 樣 本 (X1, X2), 以 二 重 複 加 入 96 孔 滴 定 盤 中, 如 圖 4.3 所 示 200 μl CBG Dye (d) 50 μl Sample (f or g) 圖 4.3 微 量 滴 定 盤 的 使 用 blank for ELISA reader in duplicate A X B X C X D X E X F X G X H X 2) 每 槽 再 加 入 200 μl Dye-Reagent (d), 在 全 部 樣 本 槽 加 完 前, 不 要 中 斷 添 加 ; 同 時 小 心 避 免 氣 泡 產 生 本 步 驟 是 實 驗 成 敗 的 關 鍵! 3) 輕 拍 滴 定 盤 一 側, 使 添 加 的 各 成 份 均 勻 混 合, 注 意 Dye-Reagent 密 度 較 大, 很 容 易 沉 積 在 下 方 而 分 層 若 還 有 小 氣 泡, 小 心 以 大 頭 針 刺 破, 大 量 時 可 用 噴 火 槍 火 燄 燒 破 4) 靜 置 室 溫 10 min 5) 以 ELISA reader 測 量 570 nm ( 或 595 nm) 的 吸 光 值 #5 #4 #3 #2 #1 #0 X1 X2 註 解 討 論 : a. 在 作 圖 紙 上 畫 出 標 準 品 的 校 正 線, 並 決 定 未 知 樣 本 的 濃 度 ( 如 圖 4.4) b. 請 說 明 本 分 析 方 法 的 原 理, 並 特 別 以 蛋 白 質 構 造 來 說 明 c. 一 般 緩 衝 液 或 試 劑 中, 何 種 添 加 物 會 影 響 Bradford 法 的 呈 色? d. 請 列 出 本 分 析 方 法 的 各 操 作 步 驟 中, 哪 些 會 影 響 分 析 的 準 確 度? e. 還 有 哪 些 蛋 白 質 的 定 量 方 法? 並 請 比 較 其 優 劣 點 Absorbance, 570 nm 0 Protein 圖 4.4 繪 製 標 準 品 校 正 線 生 物 技 術 方 法 卷 一 77

12 4.2.2 酵 素 活 性 分 析 法 表 現 出 來 的 酵 素 GUS 可 以 水 解 其 基 質 衍 生 物 pnpg, 所 產 生 的 黃 色 生 成 物 p-nitrophenol, 可 供 活 性 測 定 (Jefferson et al, 1986); 催 化 反 應 如 下 式 : + H2O GUS + p-nitrophenyl β-d-glucuronide (pnpg) β-d-glucuronic acid p-nitrophenol (yellow color) 儀 器 用 具 : ELISA 光 度 計 (Dynatech) 微 量 滴 定 盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb ) 藥 品 試 劑 : 基 質 溶 液 (GUS reaction buffer): pnpg (p-nitrophenyl β-d-glucuronide, Sigma N-1627) 31.5 mg 溶 於 Buffer A ml 終 止 液 (stop buffer):2.5 M 2-amino-2-methyl propanediol (Sigma A-9754) 方 法 步 驟 : 1) 吸 取 20 μl 的 蛋 白 質 樣 本, 小 心 注 入 微 量 滴 定 盤 中, 避 免 氣 泡 產 生 2) 每 一 樣 品 槽 加 入 200 μl 基 質 液, 混 合 均 勻 ; 可 用 燒 熱 的 接 種 環 去 除 氣 泡 3) 靜 置 約 1~2 min, 顏 色 開 始 加 深, 然 後 加 入 30 μl 終 止 液 反 應 時 間 的 長 短, 要 以 樣 本 中 的 酵 素 活 性 大 小 來 做 調 整 因 為 我 們 只 測 定 色 析 法 各 分 劃 的 相 對 酵 素 活 性, 因 此 並 不 加 終 止 液 4) 以 ELISA 光 度 計 測 定 波 長 415 nm 之 吸 光 值 酵 素 活 性 單 位 的 測 定 : a. 以 上 步 驟, 只 可 測 定 GUS 活 性 的 相 對 大 小, 對 色 析 法 所 得 到 的 各 個 分 劃 進 行 偵 測, 相 當 方 便, 但 並 非 酵 素 絕 對 活 性 單 位 的 測 定 方 法 b. 若 要 測 定 酵 素 的 絕 對 活 性 單 位, 要 使 用 最 適 當 的 酵 素 用 量, 使 酵 素 在 反 應 一 段 固 定 的 時 間 後, 其 生 成 物 的 呈 色 吸 光 度, 落 在 光 度 計 的 可 測 範 圍 之 內 ; 然 後 計 算 此 段 時 間 內, 每 分 鐘 所 產 生 的 吸 光 度 增 加 量, 轉 換 成 生 成 物 的 莫 耳 數, 即 可 求 得 其 真 正 的 活 性 單 位 c. 因 此 酵 素 的 活 性 單 位 定 義 為 : 每 分 鐘 所 能 催 化 生 成 物 之 μmole 數 註 解 討 論 : a. 實 驗 之 前 先 規 畫 好 各 樣 本 在 滴 定 盤 上 的 分 佈 位 置, 並 做 好 標 示 b. 以 微 量 滴 定 盤 進 行 活 性 測 定 時, 能 否 使 得 每 一 槽 的 反 應 時 間 一 致? c. 化 學 反 應 最 重 要 的 操 作 要 點 之 一, 是 要 使 所 加 入 的 各 種 成 份 均 勻 混 合, 在 使 用 微 量 滴 定 盤 時, 你 如 何 使 所 加 的 液 體 混 合 均 勻? 78 Methods in Biotechnology Vol 1

13 4.2.3 膠 体 電 泳 法 電 泳 的 高 解 析 力 使 其 成 為 生 化 技 術 中 最 有 效 力 的 一 門 分 析 利 器, 以 下 簡 略 說 明 各 種 電 泳 的 形 式 及 其 應 用 a. 不 連 續 膠 體 電 泳 (disc-page) 是 以 原 態 蛋 白 質 進 行 電 泳, 一 般 用 作 純 度 檢 定 或 活 性 分 析,SDS- 膠 體 電 泳 (SDS-PAGE) 則 用 為 次 體 分 子 量 之 測 定, 梯 度 (gradient) 電 泳 則 可 輔 助 原 態 蛋 白 質 分 子 量 之 決 定 結 合 SDS 及 梯 度 兩 種 特 性 的 SDS- 梯 度 膠 體 電 泳, 其 解 析 力 最 高 b. 電 泳 形 式 早 期 使 用 圓 柱 狀 膠 體, 演 變 成 直 立 式 的 平 板 膠 片 (16 18 cm), 最 後 改 成 迷 你 電 泳 膠 片 (8 10 cm), 電 泳 時 間 只 約 一 小 時, 而 其 解 析 力 不 變 現 在 柱 狀 膠 體 電 泳 只 用 在 等 電 焦 集 法, 以 進 行 二 次 元 電 泳 ; 而 大 型 平 板 電 泳 則 多 用 在 製 備 式 電 泳, 一 般 電 泳 大 多 以 迷 你 膠 片 進 行 之 c. 膠 體 材 質 的 種 類 很 多, 但 用 在 蛋 白 質 者 則 以 聚 丙 烯 醯 胺 (polyacrylamide) 為 主 ; 聚 丙 烯 醯 胺 電 泳 是 蛋 白 質 應 用 最 廣 的 電 泳 分 析 方 式 也 有 少 數 使 用 洋 菜 膠 體 (agarose gel), 多 用 在 測 定 pi 較 廣 的 異 構 酵 素 群 d. 泳 動 率 : 在 ph 8.8 的 電 泳 條 件 下, 大 部 分 pi 小 於 8.8 的 分 子 均 能 往 正 極 泳 動 ; 蛋 白 質 的 泳 動 率 與 所 帶 電 荷 成 正 比, 而 與 其 分 子 量 成 反 比 ; 若 分 子 量 一 樣, 但 形 狀 越 不 規 則, 或 體 積 越 鬆 散 者, 泳 動 率 越 小 e. 聚 丙 烯 醯 胺 電 泳 雖 然 分 有 原 態 的 disc- 及 變 性 的 SDS-PAGE 兩 種, 但 兩 者 除 了 SDS-PAGE 在 整 個 系 統 含 有 0.1% SDS 之 外, 其 餘 完 全 相 同, 且 其 鑄 膠 及 電 泳 方 法 均 屬 大 同 小 異 f. 原 態 disc-page 中 的 樣 本 蛋 白 質, 因 電 泳 系 統 中 不 含 界 面 活 性 劑 SDS, 其 活 性 多 能 保 持, 可 以 在 膠 體 上 做 活 性 染 色 若 目 標 酵 素 沒 有 方 便 的 活 性 染 色 法, 則 可 把 膠 體 一 片 一 片 切 下, 做 每 一 片 膠 體 的 活 性 測 定 儀 器 用 具 : 迷 你 電 泳 槽 (Hoefer Mighty Small SE 250) 鑄 膠 器 (Hoefer SE 245 可 鑄 造 兩 片 迷 你 膠 片 ) 鑄 膠 三 明 治 組 合 : ( 每 一 片 膠 片 ) (1) 玻 璃 板 (8 10 cm) 小 心 易 破 裂 1 片 (2) 白 色 氧 化 鋁 板 小 心 易 破 裂 1 片 (3) Spacer 間 隔 條 (0.75 mm) 小 心 易 遺 失 2 條 (4) Comb 樣 本 齒 模 (0.75 mm) 小 心 易 遺 失 1 隻 電 泳 樣 本 專 用 微 量 吸 管 頭 ( 尖 端 較 長 且 扁 ) 供 電 器 ( 可 供 應 200 V 電 壓 及 500 ma 電 流 者 均 可 使 用 ) 塑 膠 染 色 盒 ( 比 膠 片 稍 大 且 要 能 密 蓋 ) 旋 轉 搖 盪 器 (rotary shaker) 看 片 箱 (light box) 護 貝 機 及 護 貝 膜 ( 可 護 貝 如 膠 片 大 小 者 ) 生 物 技 術 方 法 卷 一 79

14 膠 片 乾 燥 組 合 : (1) 玻 璃 板 ( 至 少 要 比 膠 片 大, 約 cm, 厚 度 約 3~4 mm) (2) 玻 璃 紙 (cellophane, 年 糕 紙, 比 上 面 玻 璃 板 每 邊 多 出 5 cm 以 上 ) 以 下 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 電 泳 所 使 用 的 試 劑 及 方 法 乃 根 據 Laemmli (1970) 的 方 法 藥 品 試 劑 : 由 於 鑄 膠 溶 液 非 常 重 要 且 多 樣, 因 此 下 面 把 所 有 電 泳 溶 液 的 配 置 方 法 仔 細 列 出, 希 望 能 在 每 一 個 實 驗 室 成 功 進 行 電 泳 ; 但 使 用 者 一 定 要 明 白 其 配 製 的 原 理 與 各 種 濃 度 的 算 法, 而 不 是 只 會 依 配 方 泡 製 而 已 A 液 : 丙 烯 醯 胺 液 (total 30%, cross-linking 2.6%) 丙 烯 醯 胺 (acrylamide, Merck 10784) 29.2 gm Bis 架 橋 劑 (Sigma M-7256) 0.8 gm 加 純 水 溶 解 至 100 ml A 液 也 有 商 品 已 經 配 製 好 溶 液 者, 若 實 驗 課 採 用 Ameresco 的 40% 溶 液 (T40%, C2.6%), 配 法 有 些 變 動, 請 特 別 注 意 Bis 是 N,N -methylene-bis(acrylamide) 的 簡 稱, 可 看 成 是 兩 分 子 acrylamide 連 在 一 起, 作 為 架 橋 物, 以 便 成 為 立 體 的 膠 體 以 30 加 熱 助 溶, 有 不 溶 物 質 須 過 濾 去 除 ; 若 丙 烯 醯 胺 品 質 不 佳 或 久 貯, 在 溶 成 100 ml 後, 可 加 一 些 離 子 交 換 樹 脂 Dowex MR-3 攪 拌, 放 過 夜 並 過 濾 後 置 4 保 存 注 意 acrylamide 溶 液 有 神 經 毒 性! 不 要 直 接 接 觸, 凝 膠 後 毒 性 消 失, 但 膠 體 無 法 達 到 百 分 之 百 凝 膠, 因 此 也 要 小 心 處 理 膠 片 B 液 : 分 離 膠 體 緩 衝 液 (running 或 separation buffer) Tris (Tris base, 1.5 M) 90.8 gm TEMED (Sigma T-8133) 1.8 ml 溶 入 300 ml 水, 以 l M HCl 119 ml 調 ph 到 8.8 再 加 水 至 500 ml TEMED (tetramethylenediamine) 可 幫 助 自 由 基 傳 導, 是 催 化 劑 C 液 : 焦 集 膠 體 緩 衝 液 (stacking buffer) Tris (Tris base, 0.5 M) 6.0 gm TEMED (Sigma T-8133) 0.4 ml 溶 入 40 ml 水, 加 l M HCl 47 ml 調 ph 至 6.8, 加 水 至 100 ml D 液 : 電 泳 緩 衝 液 (chamber buffer),5 溶 液 Tris (Tris base, 0.05 M 5) 30.3 gm 甘 胺 酸 (glycine, 0.38 M 5) gm 溶 入 800 ml 水,pH 調 到 8.3 後 再 加 水 至 1 L 使 用 時 稀 釋 5 倍 甘 胺 酸 是 電 泳 緩 衝 液 的 主 要 分 子, 是 造 成 電 泳 樣 本 焦 集 的 原 因 ; 近 來 多 改 用 boric acid ( 下 面 F 液 ), 應 自 行 試 用 何 者 為 佳 E 液 :SDS-PAGE 樣 品 溶 液,2 溶 液 Tris (Tris base, 125 mm 2) 3.0 gm EDTA 2Na (2 mm 2) 14.8 mg 80 Methods in Biotechnology Vol 1

15 SDS (2% 2) 4.0 gm β-mercaptoethanol (5% 2, Sigma M-6250) 10.0 ml 加 水 80 ml 溶 之,pH 調 到 6.8, 再 加 水 至 100 ml F 液 : 通 用 電 泳 緩 衝 液,5 溶 液 Tris (Tris base, 90 mm 5) 54.5 gm Boric acid (80 mm 5) 24.8 gm EDTA 2Na (2.5 mm 5) 4.7 gm 加 水 800 ml 溶 之,pH 調 到 8.4, 再 加 水 至 1,000 ml 使 用 時 稀 釋 5 倍 本 溶 液 在 disc- 或 SDS-PAGE 均 通 用, 後 者 要 加 SDS 至 0.1% SDS 水 溶 液 (10%) SDS 粉 末 很 輕, 揚 起 來 很 容 易 吸 入 肺 部, 在 肺 泡 溶 解 產 生 界 面 活 性 的 作 用, 使 得 肺 部 細 胞 無 法 進 行 氧 分 子 交 換, 非 常 危 險 APS 溶 液 ( 過 硫 酸 銨, 5%) : APS (ammonium persulfate, Bio-Rad ) 50 mg 溶 於 l ml 水 中, 使 用 前 才 配 製 好, 隔 日 不 可 再 用 APS 是 自 由 基 (free radical) 的 產 生 者, 可 誘 發 acrylamide 的 連 鎖 聚 合 反 應, 因 此 是 整 個 凝 膠 反 應 的 起 始 者 冬 天 可 增 至 10%, 夏 天 可 減 至 2% 注 意 APS 固 體 很 容 易 分 解, 應 密 蓋 貯 於 乾 燥 皿 ; 鑄 膠 無 法 凝 結 的 毛 病, 多 出 自 APS 的 品 質 不 良 追 蹤 染 料 (tracking dye) : Bromophenol blue (Sigma B-6896) l mg 溶 於 5 ml 水, 再 加 5 ml 甘 油 均 勻 混 合 加 在 樣 本 蛋 白 質 中, 可 增 加 樣 本 密 度 並 賦 予 顏 色, 方 便 目 視 以 注 入 膠 片 的 樣 本 槽 染 色 液 (CBR 染 液 ) : Coomassie brilliant blue R-250 (CBR, Sigma B-0149) 1 gm 溶 於 250 ml 水 後, 再 加 入 250 ml 甲 醇 及 50 ml 醋 酸 混 合 均 勻, 充 分 溶 解 CBR, 若 有 不 溶 物 質, 則 須 過 濾 後 裝 瓶 密 蓋 Coomassie blue 有 許 多 種 不 同 的 相 關 化 合 物, 不 要 取 用 作 為 蛋 白 質 定 量 用 的 Coomassie blue G-250 來 染 色, 效 果 稍 差 脫 色 液 (20% 甲 醇 及 10% 醋 酸 ): 在 一 1 L 量 筒 中, 先 到 入 200 ml 甲 醇 及 100 ml 醋 酸, 再 加 水 至 1 L, 混 合 均 勻 後 密 蓋 備 用 甲 醇 濃 度 可 提 高 到 30%, 則 可 增 加 脫 色 速 度, 但 小 心 脫 色 過 度 標 準 分 子 量 組 合.. Pharmacia 有 高 低 兩 種 分 子 量 的 標 準 蛋 白 質 組 合, 專 供 SDS-PAGE 使 用 : 高 分 子 量 組 : Thyroglobulin (669kD, 330 kd), ferritin (440 kd, 220 kd, 18.5 kd), catalase (232 kd, 36 kd), albumin (67 kd) 生 物 技 術 方 法 卷 一 81

16 低 分 子 量 組 : Phosphorylase (94 kd), albumin (67 kd), ovalbumin (43 kd), carbonic anhydrase (30 kd), trypsin inhibitor (20 kd), lactalbumin (14.4 kd) 另 外 Novel 有 預 先 染 好 藍 色 的 SeeBlue (LC5625) 標 準 蛋 白 質 組 合, 除 了 一 般 電 泳 外, 更 可 用 在 轉 印, 檢 查 轉 印 是 否 成 功 : SeeBlue: Myosin (250 kd), albumin (98 kd), glutamic dehydrogenase (64 kd), alcohol dehydrogenase (50 kd), carbonic anhydrase (36 kd), myoglobin (30 kd), lysozyme (16 kd), aprotinin (6 kd), insulin B chain (4 kd) 方 法 步 驟 : SDS 平 板 膠 片 鑄 造.. 1) 整 理 出 兩 組 玻 璃 片 及 白 板 鑄 膠 組 合, 先 用 酒 精 拭 淨, 並 選 擇 合 適 的 間 隔 條 (0.75 mm) 組 合 起 來 請 熟 悉 鑄 膠 三 明 治 組 合 的 正 確 組 裝 方 式, 以 免 灌 入 的 膠 液 漏 出 來 2) 三 明 治 組 合 後 直 立 站 好, 準 備 所 要 濃 度 的 SDS 膠 體 溶 液 如 表 4.2 兩 片 0.75 mm 厚 的 平 板 膠 片 約 需 10 ml 分 離 膠 體 溶 液, 以 及 5 ml 焦 集 膠 體 溶 液 APS 液 到 最 後 才 加 入, 未 加 APS 以 前 可 在 真 空 中 抽 去 溶 液 中 的 氣 體 表 4.2 配 製 兩 片 0.75 mm 膠 片 所 需 膠 體 (ml) 分 離 膠 體 焦 集 膠 體 膠 體 百 分 比 5% 7.5% 10% 12.5% 15% 20% 10% 4% 4% A 液 (40%) A 液 (30%) B 液 C 液 % SDS 液 純 水 APS 液 總 體 積 上 表 反 白 部 份 為 使 用 40% A 液 製 備 的 配 方 3) 以 上 分 離 膠 體 各 成 份 在 小 燒 杯 中 混 合 均 勻 後, 可 直 接 沿 著 玻 璃 一 側 倒 入 鑄 膠 組 合 到 預 定 高 度 ( 約 八 成 高 ), 勿 陷 住 氣 泡 ; 再 輕 輕 加 上 一 層 isopropanol 也 可 使 用 滴 管 慢 慢 加 入 膠 體, 同 樣 勿 注 入 氣 泡 4) 約 30 min 可 凝 結, 以 濾 紙 吸 去 isopropanol, 同 法 倒 入 焦 集 膠 體 溶 液, 要 加 到 滿 ; 儘 快 插 入 樣 品 槽 齒 模, 注 意 不 可 有 氣 泡 陷 在 膠 體 中 一 般 在 凝 膠 完 成 後, 膠 體 與 所 加 的 水 層 之 間, 會 出 現 清 楚 的 直 線 界 面, 但 因 為 背 景 為 白 色, 較 不 易 觀 察 之 5) 再 度 凝 結 後 取 下 齒 模 即 可 使 用 若 不 立 刻 使 用, 則 把 整 個 膠 片 組 合 用 保 鮮 膜 包 好, 膠 面 上 方 加 一 水 層, 勿 使 乾 掉, 在 4 約 可 放 1~2 週 電 泳 方 法.. 6) 若 膠 片 組 合 保 存 於 4, 則 要 等 待 膠 片 完 全 回 復 室 溫, 才 架 到 電 泳 槽 膠 片 一 定 要 完 全 回 溫, 否 則 在 進 行 電 泳 時, 玻 璃 會 因 熱 脹 而 破 裂 82 Methods in Biotechnology Vol 1

17 7) 取 F 液 稀 釋 成 一 倍 溶 液, 並 加 SDS 成 為 0.1%; 先 倒 入 下 方 的 正 極 槽, 注 意 不 可 有 氣 泡 黏 在 膠 體, 然 後 倒 入 上 方 的 負 極 槽 用 微 量 針 筒 或 微 量 吸 管 一 個 一 個 清 洗 樣 本 槽, 除 去 殘 留 在 槽 內 的 膠 體 ( 刷 牙 ) 刷 牙 的 動 作 很 重 要, 而 且 要 徹 底, 否 則 注 入 樣 本 時, 會 有 大 麻 煩 又 因 為 白 色 氧 化 鋁 板 乃 白 色 背 景, 不 容 易 看 出 樣 本 槽 的 位 置, 可 用 Hoefer 所 附 的 透 明 樣 本 槽 位 置 模 板, 作 為 指 引, 順 便 可 練 習 樣 本 添 加 的 動 作 8) 取 蛋 白 質 樣 本 溶 液, 加 入 同 體 積 E 液, 以 及 適 量 追 蹤 染 料 bromophenol blue, 混 勻 後 在 100 加 熱 10 min 放 冷 短 暫 離 心 後 即 可 依 次 以 微 量 吸 管 注 入 樣 本 槽, 樣 本 體 積 可 自 斟 酌, 但 要 記 好 位 置 及 體 積 ; 通 常 都 使 用 5~15 μl 注 入 樣 本 時, 儘 量 把 針 頭 或 吸 管 伸 到 樣 本 槽 底 部, 但 不 要 觸 到 樣 本 槽 底 的 膠 面, 則 可 以 使 得 樣 本 所 佔 的 體 積 最 小, 分 離 效 果 較 好 9) 裝 上 電 源 蓋, 以 100~150 V 進 行 電 泳, 最 高 可 加 至 200 V, 視 實 驗 的 緊 急 程 度, 以 及 膠 片 發 熱 的 情 形 而 定 通 電 後 兩 極 附 近 會 立 刻 產 生 無 數 細 微 氣 泡, 是 通 電 的 特 徵 10) 追 蹤 染 料 很 快 進 入 膠 體, 開 始 焦 集 成 藍 色 細 線, 並 向 下 泳 動, 大 約 1 h 可 泳 動 到 底 邊, 中 止 電 泳, 除 去 電 源 蓋 有 些 分 子 量 較 大 的 樣 本, 或 使 用 濃 度 較 高 的 膠 片, 可 以 等 到 藍 色 細 線 泳 出 膠 體 才 停 止 膠 片 染 色 法 : 11) 取 出 膠 片 組 合, 使 玻 璃 板 向 上, 先 除 去 兩 側 間 隔 條, 再 以 扁 形 藥 匙 輕 輕 撬 起 玻 璃, 膠 片 則 留 在 白 板 上 切 除 焦 集 膠 體, 並 在 分 離 膠 片 的 右 上 方 截 角 做 記 號 ( 區 別 膠 片 的 左 右 ) 12) 取 染 色 盤 ( 大 約 比 膠 片 稍 大 ), 倒 入 CBR 染 色 液, 在 染 色 盤 上 方 把 上 述 白 板 倒 翻 過 來, 挑 起 膠 片 一 角, 利 用 重 力 使 膠 片 掉 落 到 染 色 缸 中 若 要 進 行 蛋 白 質 轉 印, 則 膠 片 不 能 染 色, 要 浸 入 轉 印 緩 衝 液 中 13) 在 CBR 中 染 色 約 30 min, 染 色 盤 要 加 密 蓋, 置 於 旋 轉 平 台 慢 速 50 rpm 搖 盪 之 ; 要 注 意 膠 片 是 否 完 全 沒 入 染 色 液 中, 否 則 會 造 成 染 色 不 均 勻 14) 染 色 後 小 心 把 CBR 染 劑 倒 回 原 來 瓶 中, 整 塊 膠 片 變 成 藍 色, 先 用 自 來 水 洗 掉 殘 餘 的 染 色 液, 再 倒 入 約 20 ml 脫 色 液, 加 密 蓋 後 再 放 回 旋 轉 平 台 搖 盪 染 色 脫 色 過 程 請 戴 手 套, 否 則 會 在 膠 片 上 留 下 指 紋 15) 膠 片 的 藍 色 背 景 漸 漸 脫 掉, 待 脫 色 液 轉 成 藍 色 後, 可 以 換 新 脫 色 液 ; 如 此 脫 色 數 次, 在 一 小 時 內 應 可 看 到 蛋 白 質 的 藍 色 色 帶 出 現 用 過 的 脫 色 液, 請 回 收 倒 在 有 機 溶 液 的 廢 液 桶 中 16) 待 膠 片 背 景 完 全 透 明 後, 染 色 脫 色 完 成 倒 去 脫 色 液, 改 用 50% 甲 醇 液 洗 一 兩 次, 待 膠 片 縮 至 大 約 原 來 的 尺 寸, 則 可 準 備 乾 燥 之 膠 片 乾 燥 法 : 17) 把 玻 璃 紙 cellophane 先 用 水 浸 溼, 平 鋪 在 乾 燥 用 的 玻 璃 片 上, 玻 璃 紙 會 比 玻 璃 片 大, 因 此 四 週 有 多 出 來 的 部 份 18) 把 膠 片 平 鋪 在 玻 璃 紙 中 央, 膠 片 與 玻 璃 紙 間 不 要 有 任 何 氣 泡 除 了 氣 泡 之 外, 若 膠 片 沒 有 回 復 原 來 的 大 小, 或 者 膠 片 的 四 邊 有 傷 痕, 都 生 物 技 術 方 法 卷 一 83

18 很 容 易 造 成 膠 片 乾 燥 後 的 龜 裂 現 象 19) 在 膠 片 上 再 加 一 層 浸 溼 的 玻 璃 紙, 也 不 要 陷 有 氣 泡 在 內 ; 把 玻 璃 紙 多 出 來 的 部 份 反 摺 到 玻 璃 背 面, 用 手 抹 平 表 面 水 份, 並 用 紙 巾 吸 乾 20) 把 此 乾 片 三 明 治 組 合 放 在 桌 上, 次 日 即 可 得 到 已 經 乾 燥 好 的 膠 片, 用 電 風 扇 或 冷 氣 機 吹 之, 可 以 加 快 乾 片 速 度 乾 片 後 用 指 甲 尖 輕 敲 膠 片, 若 還 可 以 看 到 指 甲 所 留 下 的 痕 跡, 表 示 膠 片 並 未 完 全 乾 燥, 要 再 等 候 21) 待 膠 片 完 全 乾 燥 後, 以 美 工 刀 或 剪 刀 去 除 多 餘 的 玻 璃 紙, 再 加 以 護 貝, 則 可 永 久 保 存 之 免 疫 染 色 的 轉 印 紙, 也 可 以 護 貝 保 存 蛋 白 質 轉 印 法 蛋 白 質 經 SDS-PAGE 後, 膠 片 浸 入 轉 印 緩 衝 液, 蛋 白 質 可 被 轉 印 到 硝 化 纖 維 紙 (nitrocellulose) 上, 先 經 尿 素 洗 去 SDS, 並 使 蛋 白 質 回 復 原 態 抗 原 性, 可 使 用 抗 體 進 行 免 疫 染 色 (Towbin et al, 1979) 儀 器 用 具 : 電 泳 轉 印 槽 (Hoefer Transphor TE 52): 轉 印 槽 ( 可 容 納 4 個 轉 印 三 明 治 ) 轉 印 三 明 治 ( 轉 印 夾 方 形 海 綿 墊 2 片 ) 轉 印 紙 : 早 期 使 用 硝 化 纖 維 紙, 現 在 多 用 尼 龍 材 質 者 Immobilon P (Millipore IPUH , 0.45 μm, PVDF 材 質 ) 濾 紙 (Whatman #1, 3MM) 兩 張, 裁 成 比 轉 印 紙 稍 大 者 供 電 器 ( 可 供 400~500 ma 者 ) 方 形 培 養 皿 ( 轉 印 紙 清 洗 用 ) 旋 轉 搖 盪 器 (rotary shaker) 藥 品 試 劑 : 轉 印 緩 衝 液 (Blotting buffer):10 溶 液 Tris (Tris base, 25 mm 10) 60.6 gm 甘 胺 酸 (0.192 M 10) 288 gm 加 水 1,500 ml 溶 之,pH 以 HCl 調 到 8.3, 加 水 至 2,000 ml 使 用 時 取 500 ml 倒 入 一 5 L 桶 中, 加 500 ml 甲 醇 後, 加 水 到 5 L, 均 勻 攪 拌 之 如 此 配 成 者, 含 10% 甲 醇 ; 若 是 轉 印 胜 或 是 蛋 白 質 的 分 子 量 太 小, 可 提 高 到 20% 甲 醇 ( 用 來 潤 溼 尼 龍 材 質 的 轉 印 紙 ) PBST 洗 液 : PBST 為 ph 7.0 的 PBS (phosphate buffered saline) 緩 衝 液, 另 加 有 0.05% Tween-20, 用 來 清 洗 轉 印 紙, 以 去 除 非 專 一 性 的 蛋 白 質 吸 附 尿 素 洗 液 (6M Urea-PBST) : 尿 素 180 gm 溶 在 300 ml PBST 中, 加 溫 攪 拌 溶 解, 再 加 PBST 至 500 ml 84 Methods in Biotechnology Vol 1

19 方 法 步 驟 : 全 程 請 戴 手 套 操 作, 以 免 污 染 轉 印 紙! 1) 電 泳 後 SDS-PAGE 膠 片 浸 在 轉 印 緩 衝 液 中, 洗 2~3 次, 每 次 10 min 2) 取 出 轉 印 槽, 先 小 心 放 一 攪 拌 子 在 底 部, 再 倒 一 半 轉 印 緩 衝 液 攪 拌 子 千 萬 不 能 丟 到 轉 印 槽 內, 會 打 破 轉 印 槽 底 部 的 陶 瓷 散 熱 片 3) 取 轉 印 紙 切 成 約 如 膠 片 大 小, 先 在 方 形 培 養 皿 中 以 少 許 甲 醇 浸 溼 數 秒 鐘, 再 置 入 轉 印 槽 中 的 緩 衝 液 10 min 後 使 用 另 取 兩 張 濾 紙, 以 及 兩 片 方 形 海 綿 墊, 都 放 在 轉 印 槽 的 緩 衝 液 中 備 用 4) 取 出 轉 印 夾 打 開 平 放, 先 墊 一 張 方 形 海 棉 墊, 舖 上 一 張 溼 濾 紙, 小 心 疊 上 已 潤 溼 的 轉 印 紙, 其 間 勿 陷 入 氣 泡 ; 轉 印 紙 再 滴 上 數 滴 緩 衝 液 後, 小 心 平 舖 膠 片 上 去, 加 蓋 一 層 濾 紙, 及 另 一 張 海 綿, 也 都 不 可 陷 入 氣 泡, 即 可 把 整 個 轉 印 三 明 治 卡 夾 裝 好 膠 片 疊 到 轉 印 紙 時, 最 好 一 次 成 功, 不 要 重 作, 否 則 蛋 白 質 色 帶 可 能 會 印 上 去, 最 後 產 生 重 疊 影 像 5) 將 轉 印 三 明 治 置 入 已 經 放 有 一 半 轉 印 緩 衝 液 的 轉 印 槽 中, 注 意 有 轉 印 紙 的 那 一 面 向 正 極 ( 紅 色 ), 膠 片 那 面 向 負 極 ( 黑 色 ) 6) 當 三 明 治 都 放 入 轉 印 槽 後, 以 轉 印 緩 衝 液 蓋 滿 所 有 的 三 明 治, 小 心 動 一 動 卡 夾, 除 去 附 在 卡 夾 內 外 的 氣 泡, 蓋 上 蓋 子, 放 到 一 攪 拌 器 上, 打 開 攪 拌 器 開 始 攪 拌, 同 時 接 好 電 源, 裝 置 完 成 後 放 置 10 min 7) 以 400 ma 開 始 轉 印, 溫 度 會 漸 漸 上 升, 轉 印 1.5 h 後 中 止 轉 印, 取 出 轉 印 三 明 治, 打 開 後 依 次 取 出 轉 印 紙 及 膠 片 上 述 轉 印 條 件 會 使 溫 度 上 升 至 70~90, 若 有 冷 卻 系 統, 可 把 溫 度 控 制 設 在 5 ; 轉 印 槽 內 應 該 加 以 攪 拌, 以 便 使 整 個 溫 度 分 佈 均 勻 8) 轉 印 後 的 膠 片 可 以 繼 續 進 行 CBR 染 色, 看 有 無 蛋 白 質 殘 留 若 電 泳 時 加 有 藍 色 標 準 蛋 白 質 marker (SeeBlue), 則 可 在 轉 印 紙 上 看 到 藍 色 的 色 帶, 確 定 轉 印 成 功, 並 可 評 估 轉 印 效 率 9) 轉 印 紙 浸 在 約 15 ml 尿 素 洗 液 中 浸 洗 過 夜, 期 間 換 三 次 尿 素 洗 液, 並 且 要 溫 和 搖 盪 之 10) 若 不 做 免 疫 染 色, 則 轉 印 後 不 用 尿 素 洗 液 清 洗, 以 清 水 沖 過 後 改 用 amido black (l % 溶 於 10% 甲 酸 ) 染 色 1 h, 再 以 10% 甲 酸 脫 色, 沖 水 後 晾 乾 即 可, 但 其 靈 敏 度 較 低 註 解 討 論 : a. 轉 印 時 槽 內 的 水 溫 並 不 均 勻, 液 面 的 溫 度 比 底 部 要 高, 電 流 也 就 不 會 均 勻, 注 意 轉 印 效 果 因 此 會 有 差 異 ; 最 好 加 以 攪 拌 使 水 溫 均 勻 b. 膠 片 及 轉 印 紙 應 切 角 做 記 號, 以 分 辨 左 右 或 正 反 面, 免 得 呈 色 後 分 不 清 樣 本 的 次 序 c. 甲 醇 可 提 高 到 20%, 一 般 分 子 量 越 小, 所 用 甲 醇 的 含 量 越 高 ; 但 甲 醇 含 量 太 高, 可 能 會 使 分 子 量 太 大 者 不 易 泳 離 膠 體 生 物 技 術 方 法 卷 一 85

20 4.2.5 免 疫 染 色 法 : 轉 印 到 紙 上 的 蛋 白 質 抗 原, 可 與 其 專 一 性 抗 體 結 合, 再 以 二 次 抗 體 - 酵 素 結 合 體 (2nd Ab-HRP) 或 Protein A-HRP 呈 色 ; 可 在 一 群 轉 印 色 帶 中, 專 一 性 地 挑 出 目 標 蛋 白 質, 是 最 有 用 的 檢 定 工 具 (Burnett,1981) 藥 品 試 劑 : 抗 體 溶 液 : 可 用 傳 統 抗 血 清 或 單 株 抗 體, 其 最 適 使 用 濃 度, 隨 抗 體 效 價 不 同 而 異, 以 下 為 一 般 適 用 範 圍 的 參 考, 均 以 明 膠 -NET 稀 釋 之 a. 傳 統 抗 血 清 : 1:100 到 1:1,000 b. IgG ( 冷 凍 乾 燥 品 ): 10~50 μg/ml c. 單 株 抗 體 ( 小 白 鼠 腹 水 ) : 1:200 到 1:5,000 d. 單 株 抗 體 ( 細 胞 培 養 液 ): 原 液 或 1:10 明 膠 -NET: 用 來 稀 釋 抗 體 溶 液 或 酵 素 連 結 體 明 膠 gelatin (Merck 4070, 0.25%) 5.0 gm NaCl (0.15 M) 17.5 gm EDTA (5 mm) 3.6 gm Tween-20 (0.05%) 1.0 ml Tris (Tris base, 50 mm) 12.1 gm 加 熱 溶 解 於 1,800 ml 純 水 後 ph 調 到 8.0, 再 加 水 到 2,000 ml 酵 素 連 結 體 : 可 使 用 2nd Ab-HRP 或 Protein A-HRP, 使 用 濃 度 每 家 商 品 不 同, 約 為 1:1,000 到 1:5,000 之 間, 以 明 膠 -NET 稀 釋 之 PBST 洗 液 DAB 基 質 溶 液 : DAB (diaminobenzidine, Sigma D-5637) 5 mg 溶 於 100 ml Buffer A-0, 再 加 10 μl H 2 O 2, 新 鮮 配 製, 避 光 貯 存 DAB 為 致 癌 物 質, 稱 量 時 勿 吸 入 DAB 細 塵, 並 小 心 處 理 秤 量 紙 方 法 步 驟 : 1) 尿 素 洗 過 夜 的 轉 印 紙 再 以 10 ml PBST 洗 三 次, 每 次 約 10 min, 均 在 上 述 方 形 培 養 皿 中 進 行 2) 轉 印 紙 放 在 明 膠 NET 溶 液 中 反 應, 置 室 溫 中 反 應 1 h 一 般 使 用 方 形 培 養 皿 當 容 器, 但 亦 可 裝 入 塑 膠 袋 中 反 應, 較 節 省 試 劑 用 量 3) 反 應 後, 以 PBST 浸 洗 二 次 4) 把 轉 印 紙 放 在 抗 體 溶 液 中 反 應, 置 室 溫 反 應 1 h 5) 反 應 後 以 PBST 洗 三 次, 改 用 酵 素 連 結 體 反 應, 在 室 溫 下 反 應 1 h 6) 以 PBST 洗 四 至 五 次, 注 意 容 器 也 要 洗 乾 淨 7) 加 入 DAB 基 質 溶 液 約 10 ml 呈 色, 儘 量 避 光, 並 且 不 時 搖 動 呈 色 液 8) 數 分 鐘 內 可 呈 色, 在 背 景 加 深 前 倒 去 DAB, 以 水 沖 過 數 次 後 晾 乾 86 Methods in Biotechnology Vol 1

21 註 解 討 論 : a. 非 專 一 性 的 呈 色 經 常 會 造 成 困 擾, 此 問 題 可 用 尿 素 洗 液 解 決, 尿 素 可 洗 去 SDS, 且 使 蛋 白 質 或 胜 回 復 其 構 形 或 抗 原 性 b. DAB 呈 色 時, 應 含 有 一 不 會 呈 色 之 負 對 照 組 作 為 比 較 ; 當 樣 本 含 有 標 準 分 子 量 的 組 合 時, 其 蛋 白 質 色 帶 應 不 會 呈 色 參 考 文 獻 : Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248~254 Burnett WN (1981) Anal Biochem 112: 195~203 Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT ed (2005) Current protocols in protein science (Vol. 1) John Wiley & Sons, Inc. Deutscher MP ed (1990) Guide to protein purification (Methods in Enzymology, Vol. 182) Academic Press, Inc. Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447~8451 Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680~685 Protein Liquid Chromatography (2000) Kastner M ed, J Chromatography Library Vol 61, Elsevier Scopes RK (1994) Protein purification - Principles and practice, 3rd ed, Springer-Verlag Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350~4354 莊 榮 輝 主 編 (2005) 酵 素 化 學 實 驗 台 灣 大 學 生 化 科 技 學 系 參 考 網 頁 : 酵 素 純 化 與 分 析 ( 致 謝 : 感 謝 台 大 生 化 所 張 震 東 教 授 對 於 本 章 內 容, 以 及 在 教 學 與 技 術 上 的 建 議 及 指 正 生 物 技 術 方 法 卷 一 87

22 88 Methods in Biotechnology Vol 1