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1 福 建 农 林 大 学 硕 士 学 位 论 文 转 基 因 棉 花 对 土 壤 根 际 微 生 物 多 样 性 的 影 响 姓 名 : 刘 颖 申 请 学 位 级 别 : 硕 士 专 业 : 微 生 物 指 导 教 师 : 胡 开 辉 ; 关 雄

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47 转 基 因 棉 花 对 土 壤 根 际 微 生 物 多 样 性 的 影 响 作 者 : 刘 颖 学 位 授 予 单 位 : 福 建 农 林 大 学 相 似 文 献 (9 条 ) 1. 学 位 论 文 孙 锋 Bt 蛋 白 试 剂 盒 的 制 备 及 抗 虫 棉 Bt 蛋 白 时 空 表 达 的 研 究 2006 转 Bt 基 因 抗 虫 棉 在 我 国 应 用 最 广, 它 对 鳞 翅 目 害 虫 具 有 较 强 的 抗 性 利 用 基 因 工 程 技 术 转 入 棉 花 中 的 Bt 基 因 可 以 在 棉 花 各 组 织 器 官 中 高 效 表 达, 合 成 对 鳞 翅 目 害 虫 具 有 高 效 毒 杀 作 用 的 Bt 蛋 白 但 若 在 生 产 上 仍 用 常 规 栽 培 管 理 法, 品 种 的 产 量 潜 力 就 不 能 正 常 发 挥, 甚 至 在 不 同 的 生 态 棉 区 造 成 产 量 显 著 降 低 本 文 以 市 售 Bt 杀 虫 粉 剂 为 原 料, 纯 化 结 晶 出 高 纯 度 的 Bt 晶 体 蛋 白, 依 此 得 到 Bt 蛋 白 抗 体, 制 备 出 Bt 蛋 白 试 剂 盒, 并 对 转 Bt 基 因 抗 虫 棉 与 常 规 非 抗 虫 棉 进 行 了 棉 花 在 不 同 时 空 的 抗 虫 性 研 究, 旨 在 为 抗 虫 棉 的 检 测 提 供 快 速 有 效 的 检 测 方 法, 并 为 抗 虫 棉 的 田 间 管 理 提 供 理 论 基 础 其 研 究 结 果 如 下 : 1. 以 市 售 的 Bt 蛋 白 粉 剂 为 原 料, 采 用 碱 解 层 析 和 乙 醇 沉 淀 的 生 物 化 学 的 方 法 提 取 纯 化 Bt 晶 体 蛋 白 结 果 表 明, 在 ph10.5 时, 碱 解 程 度 最 高, 采 用 60% 饱 和 度 的 硫 酸 铵 沉 淀 可 以 去 除 大 多 数 的 多 糖,G-50 层 析 柱 将 Bt 蛋 白 (130KD) 与 其 他 蛋 白 分 开, 上 清 用 倍 的 95% 乙 醇 沉 淀, 即 可 得 到 晶 体 状 Bt 蛋 白, 冻 干 称 重, 得 率 为 1.338g/KgBt 蛋 白 粉 剂 考 马 斯 亮 蓝 法 测 定 蛋 白 纯 度 为 91%,SDS-PAGE 测 定 晶 体 蛋 白 的 分 子 量 为 130KD 2. 采 用 实 验 室 饲 养 棉 铃 虫 的 方 法, 棉 铃 虫 的 初 孵 虫 一 铃 虫 二 铃 虫 48 小 时 的 死 亡 率 为 100%, 三 铃 虫 48 小 时 的 死 亡 率 为 88%, 四 铃 虫 48 小 时 的 死 亡 率 为 76%, 生 物 活 性 达 18000IU/mg 3. 实 验 用 2Kg 重 的 新 西 兰 大 白 兔, 采 用 免 疫 学 制 备 抗 体 的 方 法, 由 兔 血 清 以 饱 和 硫 酸 铵 沉 淀 提 取 蛋 白, 再 以 A-50 层 析 后, 加 冷 的 95% 乙 醇 沉 淀 制 备 抗 体, 所 得 抗 体 的 滴 度 为 32( 琼 脂 凝 胶 扩 散 法 ), 完 全 可 作 为 试 剂 盒 使 用 ( 要 求 滴 度 不 低 于 16) 4. 所 制 备 的 Bt 蛋 白 试 剂 盒 与 进 口 的 Agdia 试 剂 盒 做 实 验 对 比, 结 果 表 明 : 自 制 试 剂 盒 Bt 蛋 白 浓 度 线 性 范 围 为 1750~28000ng ml-1, 而 Agdia 试 剂 盒 Bt 蛋 白 浓 度 线 性 范 围 为 2250~36000ng ml-1, 可 见 自 制 试 剂 盒 检 测 灵 敏 度 比 Agdia 试 剂 盒 的 检 测 灵 敏 度 稍 高, 但 检 测 范 围 比 Agdia 试 剂 盒 稍 窄 自 制 试 剂 盒 的 精 确 度 稍 差, 稳 定 性 不 是 很 好, 有 待 进 一 步 实 验 探 索 5. 对 转 Bt 基 因 抗 虫 棉 与 非 抗 虫 棉 在 不 同 时 间 和 不 同 的 器 官 进 行 取 样, 用 自 制 的 Bt 蛋 白 试 剂 盒 检 测 ( 棉 花 叶 取 主 干 茎 叶 ), 结 果 显 示, 同 一 时 期, 同 一 棉 株 上, 倒 1 叶 Bt 毒 蛋 白 含 量 较 低, 倒 2 叶 较 高, 倒 3 叶 最 高, 而 倒 5 叶 较 倒 3 4 叶 又 有 所 下 降, 表 明 Bt 基 因 在 叶 片 中 的 表 达 产 物 随 叶 龄 的 变 化 而 变 化 在 不 同 的 生 长 时 期, 随 着 幼 苗 的 生 长,Bt 蛋 白 的 表 达 量 也 随 之 增 加, 均 可 达 到 抗 虫 的 最 低 限 度, 特 别 是 蕾 期 和 结 铃 期, 棉 花 叶 中 的 Bt 蛋 白 含 量 最 高, 但 到 吐 絮 期 以 后,Bt 蛋 白 的 表 达 量 逐 渐 降 低, 棉 花 叶 中 的 Bt 蛋 白 含 量 最 低, 已 经 低 于 抗 虫 所 要 求 的 最 低 限 度, 不 同 生 长 时 期 棉 花 叶 Bt 蛋 白 表 达 趋 势 为 : 初 花 期 > 蕾 期 > 花 铃 期 > 苗 期 > 吐 絮 期 9 种 组 织 对 棉 铃 虫 初 孵 幼 虫 的 抗 性 顺 序 为 : 功 能 叶 > 嫩 叶 > 幼 蕾 > 幼 铃 > 幼 叶 > 花 瓣 > 花 蕊 > 苞 叶 > 老 叶 6. 同 一 位 置 不 同 时 期 的 棉 花 叶 子 ( 倒 2 叶, 完 全 展 开 功 能 叶 ), 经 ELISA 检 测 结 果 显 示 : 抗 虫 棉 在 生 长 初 期, 棉 花 叶 子 中 Bt 蛋 白 的 表 达 就 开 始 活 跃, 随 着 棉 株 的 不 断 生 长, 抗 虫 棉 的 表 达 能 力 也 逐 步 加 强, 到 棉 花 的 蕾 期 花 期 达 到 最 高 点 但 到 了 絮 期 以 后, 抗 虫 棉 的 表 达 量 又 开 始 快 速 下 降, 后 期 对 Bt 蛋 白 的 表 达 水 平 远 远 低 于 抗 虫 棉 生 长 初 期 的 该 蛋 白 表 达 平 均 水 平 2. 期 刊 论 文 孙 锋. 张 宽 朝. 林 毅.Sun Feng.Zhang Kuanchao.Lin Yi 转 基 因 棉 花 中 Bt 蛋 白 鉴 定 方 法 的 研 究 现 状 - 中 国 农 学 通 报 2006,22(7) 转 基 因 棉 花 是 推 进 中 国 棉 花 产 业 发 展, 造 福 广 大 棉 农 的 必 然 举 措, 然 而, 如 何 确 定 和 建 立 一 种 简 单 快 速 方 便 的 转 Bt 基 因 棉 花 检 测 鉴 定 方 法 成 为 制 约 其 推 广 应 用 的 关 键. 文 章 对 生 物 测 定 法 酶 联 免 疫 法 (EL1SA 法 ) 和 SDS-PAGE 电 泳 法 等 三 种 当 前 常 用 的 Bt 基 因 棉 花 鉴 定 方 法 进 行 了 归 纳 分 析 与 讨 论, 并 指 出 了 各 方 法 存 在 的 问 题 及 不 足, 同 时, 还 对 已 有 研 究 报 道 的 Dot-ELISA 法 协 同 凝 集 反 应 抗 生 素 抗 性 鉴 定 法 等 进 行 了 简 单 阐 述, 为 进 一 步 推 动 转 Bt 基 因 棉 花 鉴 定 方 法 的 研 究 奠 定 基 础. 3. 学 位 论 文 刘 蔸 蔸 转 基 因 抗 虫 棉 Bt 蛋 白 残 留 及 对 土 壤 生 物 的 影 响 2009 本 研 究 以 江 苏 省 盐 城 市 南 洋 镇 转 基 因 棉 田 为 试 验 地, 选 择 同 一 类 型 三 个 处 理 ( 连 续 2 年 连 续 6 年 和 连 续 10 年 种 植 转 基 因 抗 虫 棉 ) 的 棉 田 土 壤 为 研 究 对 象 根 据 棉 花 的 不 同 生 长 期, 分 四 次 采 集 棉 田 表 层 (0-20cm) 土 壤 研 究 了 各 处 理 棉 田 土 壤 中 小 型 无 脊 椎 动 物 的 数 量 和 种 群 结 构 微 生 物 数 量 以 及 细 菌 的 多 样 性, 测 定 了 各 处 理 棉 田 土 壤 中 Bt 蛋 白 残 留, 同 时 在 实 验 室 研 究 了 Bt 蛋 白 在 土 壤 中 的 降 解 规 律 研 究 结 果 表 明 :<br> 1. 三 个 处 理 转 基 因 棉 田 土 壤 中 的 可 培 养 细 菌 真 菌 反 硝 化 和 亚 硝 化 细 菌 数 量 随 季 节 性 的 变 化 差 异 显 著 但 它 们 的 数 量 随 着 转 基 因 棉 花 种 植 年 限 的 增 加 没 有 显 著 变 化 固 氮 菌 数 量 在 棉 花 苗 期 和 花 蕾 期 随 种 植 年 限 变 化 有 显 著 差 异 <br> 2. 对 细 菌 多 样 性 的 分 析 发 现, 三 个 处 理 土 壤 中 细 菌 优 势 类 群 相 同, 但 随 着 转 基 因 棉 花 种 植 年 限 的 增 加, 两 种 优 势 类 群 的 数 量 比 例 发 生 一 致 变 化 2 年 抗 虫 棉 田 土 样 中 Shannon-Wiener 指 数 Simpson 指 数 和 均 匀 度 均 高 于 6 年 和 10 年 抗 虫 棉 田 土 样 <br> 3. 各 处 理 中 动 物 总 数 随 着 采 样 时 间 的 变 化 有 一 致 性 变 化 三 个 处 理 的 Shannon-Wiener 指 数 Simpson 指 数 均 匀 度 均 随 着 种 植 年 限 的 增 加 而 升 高, 但 丰 富 度 随 着 种 植 年 限 的 增 加 而 降 低 <br> 4. 转 基 因 棉 田 土 壤 中 Bt 蛋 白 的 残 留 量 很 低 纯 Bt 蛋 白 进 入 土 壤 以 后 会 在 短 期 内 迅 速 被 降 解 随 着 时 间 的 延 长, 降 解 速 度 逐 渐 变 慢 4. 学 位 论 文 李 利 红 转 基 因 植 物 中 CryIAc 蛋 白 的 重 组 噬 菌 体 辅 助 检 测 1999 为 获 得 与 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 CryIAc 蛋 白 特 异 结 合 的 多 肽, 首 先 构 建 了 Bt 蛋 白 的 表 达 载 体 pqebt, 经 SDS-PAGE 凝 胶 电 泳 及 考 马 斯 亮 蓝 染 色 结 果 表 明 外 源 基 因 在 E.coli M15 中 得 到 高 表 达,Western Blot 印 迹 分 析 进 一 步 确 证 了 所 表 达 的 是 Bt 蛋 白. 进 一 步 优 化 了 表 达 条 件, 超 声 波 处 理 菌 体 细 胞,SDS-PAGE 凝 胶 电 泳 分 析 确 定 了 Bt 蛋 白 由 于 大 量 表 达 而 以 包 涵 体 的 形 式 存 在 于 菌 体 细 胞 中. 通 过 Ni-NTA 亲 和 层 析 纯 化 了 表 达 蛋 白, 纯 度 达 到 90% 以 上. 以 LRP 和 非 转 基 因 棉 花 叶 片 总 蛋 白 为 本 底 蛋 白, 纯 化 的 Bt 蛋 白 为 目 的 蛋 白, 利 用 噬 菌 体 展 示 技 术 从 噬 菌 体 的 随 机 七 肽 库 中 筛 选 了 与 Bt 蛋 白 特 异 性 结 合 的 七 肽.ELISA 检 测 表 明 经 过 三 轮 淘 筛 过 程, 与 Bt 蛋 白 CryIAc 特 异 结 合 的 多 肽 富 集 了 倍. 将 筛 选 出 的 重 组 七 肽 噬 菌 体 PH5 作 为 Bt 蛋 白 的 " 类 抗 体 " 用 于 抗 虫 转 基 因 植 物 的 检 测, 初 步 建 立 了 一 种 新 的 检 测 方 法 ; 与 Bt 蛋 白 特 异 结 合 的 多 肽 对 研 究 Bt 杀 虫 蛋 白 的 功 能 域 结 构 也 将 具 有 重 要 意 义. 5. 会 议 论 文 周 秋 菊. 米 湘 成. 魏 伟. 马 克 平 长 江 流 域 棉 区 转 基 因 抗 虫 棉 品 系 Bt 蛋 白 含 量 及 其 遗 传 特 性 的 研 究 2004 本 文 比 较 了 来 自 美 国 盂 山 都 公 司 的 转 基 因 抗 虫 棉 品 种 32B DP104 和 国 内 新 近 开 发 的 一 个 新 品 系 99-1 之 间 在 苗 期 和 花 铃 期 顶 端 叶 片 的 Bt 蛋 白 的 含 量 变 异, 发 现 Bt 含 量 在 品 种 ( 系 ) 间 的 差 异 并 不 大, 但 花 铃 期 的 Bt 含 量 显 著 地 高 于 苗 期 的 该 研 究 结 果 与 有 些 报 道 比 较 一 致, 但 也 有 的 研 究 报 道 认 为, 苗 期 的 Bt 蛋 白 含 量 要 明 显 高 于 花 铃 期 的 同 时, 我 们 还 研 究 了 在 长 江 流 域 棉 区 的 推 广 品 种 32B 及 其 自 交 后 代 中 Bt 蛋 白 的 变 化, 研 究 发 现, 各 代 间 的 可 溶 性 植 物 总 蛋 白 含 量 没 有 显 著 差 异 有 意 思 的 是 原 种 的 Bt 含 量 要 小 于 自 交 1 代 植 株 的, 但 差 异 不 显 著 另 外, 本 研 究 还 以 转 基 因 抗 虫 棉 410B 为 母 本 与 常 规 棉 进 行 杂 交, 研 究 & 基 因 在 后 代 中 的 分 离 规 律, 发 现 F2 代 中 阳 性 植 株 的 Bt 蛋 白 表 达 含 量 的 降 低, 并 且 阳 性 和 阴 性 植 株 在 F2 代 中 呈 现 近 于 3:1 的 比 例, 但 由 于 重 复 较 少, 谨 慎 的 结 论 需 要 进 一 步 的 实 验 来 证 明 6. 学 位 论 文 孙 善 君 转 双 价 抗 虫 基 因 棉 花 的 获 得 检 测 和 基 因 表 达 研 究 2005 本 实 验 利 用 花 粉 管 通 道 方 法 将 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bt) 杀 虫 蛋 白 基 因 和 雪 花 莲 外 源 凝 集 素 (gna) 基 因 转 化 到 棉 花 中, 提 高 棉 花 对 鳞 翅 目 害 虫 的 抗 性 和 对 桃 蚜 的 耐 性 以 棉 花 品 系 SN 为 材 料, 将 pbsgs1m 质 粒 转 入 受 体 大 肠 杆 菌 DH5 α 中, 扩 增 后 提 取 质 粒 DNA, 待 棉 花 盛 花 期 时, 利 用 花 粉 管 通 道 转 化 法 将 质 粒 DNA 注 射 到 授 粉 20h 左 右 的 子 房 中 将 收 获 的 种 子 浸 泡 萌 发 后 植 于 温 室, 经 过 田 间 卡 那 霉 素 筛 选, 获 得 了 12 株 转 基 因 植 株 PCR Southern blotting 检 测 结 果 表 明,Bt 和 gna 基 因 已 经 整 合 到 棉 花 基 因 组 中 对 转 化 植 株 进 行 虫 试 的 结 果 表 明, 受 试 植 株 上 的 棉 铃 虫 在 5d 内 的 校 正 死 亡 率 超 过 了 80%, 而 且 存 活 幼 虫 的 生 长 发 育 受 到 明 显 的 抑 制 ; 转 化 植 株 具 有 较 强 的 抗 蚜 活 性, 平 均 能 够 抑 制 桃 蚜 60% 以 上 的 蚜 口 密 度, 最 高 的 高 达 70% 结 果 表 明, 利 用 改 造 的 抗 虫 基 因 转 化 棉 花 植 株 已 获 得 既 抗 虫 又 耐 蚜 的 转 基 因 的 棉 花

48 对 转 基 因 棉 花 的 苗 期 倒 3 叶 苗 期 倒 5 叶 现 蕾 期 功 能 叶 花 期 功 能 叶 根 茎 皮 铃 皮 铃 内 容 物 花 苞 片 花 瓣 进 行 三 明 治 ELISA 检 测, 结 果 表 明 转 基 因 植 株 均 有 不 同 程 度 的 Bt 杀 虫 蛋 白 表 达 外 源 基 因 在 植 株 各 部 位 或 不 同 的 组 织 器 官 表 达 有 显 著 的 差 异, 其 中 在 现 蕾 期 功 能 叶 达 到 ng/g 鲜 重 另 外, 外 源 基 因 的 表 达 量 存 在 时 间 和 空 间 的 不 同 分 布 转 化 用 的 表 达 载 体 上 添 加 了 一 个 分 泌 信 号 肽 编 码 序 列, 可 使 表 达 的 Bt 蛋 白 分 泌 到 细 胞 外 利 用 本 试 验 探 索 出 的 棉 花 细 胞 间 隙 液 的 提 取 方 法 提 取 细 胞 间 隙 液, 通 过 ELISA 检 测, 细 胞 间 隙 液 中 Bt 蛋 白 的 量 为 53.57ng/g 鲜 重, 可 以 初 步 确 定 Bt 蛋 白 分 泌 到 了 胞 外, 在 此 基 础 上 进 一 步 探 索 Bt 表 达 蛋 白 在 转 基 因 棉 花 细 胞 中 的 定 位 7. 学 位 论 文 陈 瑞 剑 农 户 知 识 种 子 市 场 和 政 府 管 理 政 策 对 转 基 因 抗 虫 棉 经 济 效 益 的 影 响 研 究 2009 我 国 政 府 十 分 重 视 现 代 转 基 因 生 物 技 术 对 农 业 发 展 的 推 动 作 用, 在 过 去 现 在 和 将 来 都 有 着 宏 伟 的 发 展 计 划 转 基 因 抗 虫 棉 作 为 我 国 首 例 实 行 大 规 模 商 业 化 的 农 作 物, 取 得 的 成 功 引 起 了 世 界 的 瞩 目 然 而, 转 基 因 抗 虫 棉 的 效 益 是 否 得 到 了 充 分 的 利 用, 仍 然 存 在 一 些 质 疑 本 研 究 的 总 目 标 就 是 分 别 从 农 户 层 面 技 术 市 场 层 面 以 及 政 府 的 相 关 管 理 政 策 层 面, 分 析 了 我 国 在 推 广 采 用 转 基 因 Bt 抗 虫 棉 过 程 中 充 分 利 用 技 术 潜 力 的 影 响 因 素 并 就 研 究 的 结 果, 讨 论 其 对 于 更 加 有 效 地 利 用 转 基 因 生 物 技 术 发 展 我 国 农 业 生 产 的 政 策 含 义 为 此, 本 研 究 以 2006 和 2007 年 的 两 轮 农 户 调 查 2007 年 河 南 山 东 河 北 三 省 的 种 子 市 场 调 查 以 及 Bt 蛋 白 检 测 等 4 套 数 据 集 为 基 础, 综 合 运 用 统 计 描 述 分 析 和 计 量 经 济 模 型 分 析 方 法, 对 以 上 问 题 进 行 了 较 为 深 入 的 探 讨 根 据 本 文 的 研 究 结 果, 得 出 以 下 结 论 和 政 策 含 义 <br> 首 先, 虽 然 转 基 因 Bt 技 术 已 经 全 面 推 广, 但 是 农 户 对 于 有 效 利 用 该 技 术 的 知 识 和 信 息 仍 然 有 限 这 也 是 造 成 农 户 过 量 施 用 农 药 的 重 要 原 因 农 户 知 识 信 息 水 平 的 提 高 将 会 显 著 减 少 杀 虫 剂 的 施 用 量 因 此, 农 业 技 术 推 广 体 系 需 要 加 强 农 户 虫 害 防 治 知 识 培 训, 从 而 进 一 步 提 高 转 基 因 生 物 技 术 的 经 济 效 益 <br> 其 次, 种 子 行 业 的 商 业 化 改 革 的 确 消 除 了 种 子 市 场 的 垄 断, 引 入 了 竞 争 机 制, 然 而, 当 前 的 种 子 市 场 的 规 范 整 合 和 透 明 程 度 仍 然 较 低, 农 户 难 以 利 用 市 场 价 格 等 信 息 判 断 种 子 的 质 量 信 息 市 场 一 卜 种 子 质 量 的 不 确 定 性, 造 成 了 农 户 并 没 有 随 着 种 子 行 业 商 业 化 改 革 的 推 进 而 越 来 越 多 地 利 用 市 场 获 取 种 子 和 技 术, 自 留 种 的 采 用 比 例 一 直 居 高 不 下, 且 略 有 上 升 势 头 造 成 这 种 现 象 的 原 因, 事 实 上 和 当 前 种 子 市 场 的 特 征 密 切 相 关 商 业 化 改 革 一 方 面 使 地 方 种 了 市 场 上 经 营 单 位 的 增 多, 使 农 户 购 买 种 子 的 便 利 性 大 大 提 高, 鼓 励 了 农 户 的 市 场 参 与 ; 另 一 方 面, 品 种 的 不 断 翻 新, 在 市 场 缺 乏 监 管 和 信 息 透 明 度 的 状 况 下, 会 使 农 户 的 品 种 搜 寻 成 本 大 大 增 加, 从 而 抵 消 了 市 场 竞 争 对 农 户 参 与 市 场 的 促 进 作 用 很 多 农 户 宁 愿 承 受 自 留 种 造 成 的 产 量 和 抗 虫 性 性 状 的 部 分 退 化, 而 不 愿 应 对 市 场 上 种 子 质 量 的 不 确 定 件 带 来 的 风 险 这 对 现 代 生 物 技 术 的 充 分 利 用 是 一 个 挑 战, 同 时 也 不 利 于 整 个 种 子 市 场 的 扩 张 和 发 展 <br> 第 三, 良 种 补 贴 总 体 上 难 以 达 到 促 进 技 术 的 转 化 利 用 提 高 良 种 覆 盖 率 的 目 的 政 府 2007 年 的 棉 花 良 种 补 贴 项 目 虽 然 有 着 良 好 的 补 贴 目 的, 采 取 了 一 系 列 保 障 措 施, 也 确 实 起 到 了 节 省 农 户 购 种 投 入 的 作 用 然 而, 仍 有 一 定 比 例 的 农 户 因 为 喜 欢 的 种 子 没 有 列 入 补 贴 范 围 等 原 因 而 没 有 接 受 补 贴 因 此, 仅 从 减 少 种 子 成 本 这 一 方 面 来 看, 补 贴 款 难 以 全 部 被 农 户 吸 收 利 用, 也 就 难 以 达 到 政 策 宣 传 的 节 省 购 种 成 本 的 规 模 更 重 要 的 是, 研 究 结 果 显 示, 本 研 究 样 本 中 补 贴 种 子 和 非 补 贴 种 子 的 表 现 没 有 显 著 的 差 别, 也 就 是 说, 良 种 补 贴 总 体 上 难 以 达 到 促 进 技 术 转 化, 提 高 良 种 覆 盖 率 的 目 的 因 此, 对 于 转 基 因 生 物 技 术 的 利 用 也 难 以 起 到 促 进 作 用 另 外, 分 地 区 考 查 政 策 效 果 的 研 究 结 果 显 示, 该 政 策 对 于 很 多 地 区 的 棉 花 生 产 和 技 术 利 用 还 是 有 显 著 影 响 的, 但 是 有 趣 的 是, 这 些 影 响 可 正 可 负 这 也 许 就 是 良 种 补 贴 之 所 以 造 成 较 大 争 议 的 原 因 也 意 味 着 良 种 补 贴 政 策 的 效 果 很 大 程 度 上 受 到 地 方 政 策 执 行 情 况 的 影 响 农 业 部 和 财 政 部 2009 年 对 于 良 种 补 贴 政 策 新 的 实 施 意 见 对 于 以 上 问 题 进 行 了 有 针 对 性 的 调 整 和 部 署, 将 对 于 改 善 补 贴 效 果 具 有 正 面 影 响 但 其 彻 底 性 仍 有 待 进 一 步 的 观 察 和 研 究 <br> 第 四, 我 国 虽 然 非 常 重 视 转 基 因 农 业 生 物 安 全 管 理, 并 按 照 国 际 惯 例, 制 定 了 一 系 列 的 管 理 法 规 和 条 例, 然 而, 调 查 数 据 表 明, 农 户 采 用 的 转 基 因 品 种 中 仍 然 有 相 当 比 例 没 有 获 得 生 物 安 全 审 批 事 实 上, 转 基 因 农 业 生 物 安 全 管 理 对 保 证 转 基 因 Bt 棉 花 抗 虫 效 率 仍 然 起 着 积 极 的 作 用 如 果 更 加 有 效 地 执 行 生 物 安 全 管 理, 杜 绝 非 法 品 种 的 流 入, 则 转 基 因 Bt 技 术 的 效 益 还 能 够 得 到 进 一 步 提 高 8. 期 刊 论 文 石 宏. 张 立 富. 花 保 祯. 米 湘 成. 魏 伟. 张 永 军. 马 克 平 二 级 营 养 级 水 平 上 Bt 蛋 白 的 杀 虫 活 性 - 科 学 通 报 2006,51(5) 用 ELISA 方 法 检 测 了 Bt (Bacillus thuringiensis) 蛋 白 在 转 基 因 抗 虫 棉 (Gossypium hirsutum) 中 的 表 达 量 以 及 在 非 靶 标 害 虫 甜 菜 夜 蛾 (Spodoptera exigua) 体 内 和 粪 便 中 的 存 留, 利 用 Bt 蛋 白 敏 感 的 初 孵 棉 铃 虫 (Helicoverpa armigera) 幼 虫, 检 测 了 摄 食 转 基 因 抗 虫 棉 后 的 甜 菜 夜 蛾 体 内 及 其 粪 便 中 Bt 蛋 白 的 杀 虫 活 性. 结 果 表 明, 不 同 发 育 阶 段 上 转 基 因 抗 虫 棉 功 能 叶 中 Bt 蛋 白 表 达 差 异 较 大, 同 一 生 长 期 相 同 部 位 不 同 植 株 功 能 叶 中 Bt 含 量 差 异 达 显 著 水 平. 与 转 基 因 棉 花 叶 片 中 Bt 蛋 白 的 浓 度 相 比, 尽 管 甜 菜 夜 蛾 体 内 及 其 粪 便 中 的 Bt 蛋 白 的 浓 度 降 低 了 97.5%~99%, 但 对 初 孵 棉 铃 虫 幼 虫 仍 然 有 致 死 活 性. 研 究 表 明, 二 级 营 养 级 水 平 上 残 留 的 Bt 蛋 白 具 有 杀 虫 活 性. 9. 学 位 论 文 陈 利 珍 棉 铃 虫 中 肠 Cry1A 结 合 蛋 白 分 离 鉴 定 及 其 与 抗 性 的 关 系 2008 转 基 因 棉 花 的 大 规 模 种 植 对 控 制 棉 花 害 虫 的 危 害 发 挥 了 重 要 作 用, 但 害 虫 长 期 处 于 转 基 因 作 物 Bt 毒 蛋 白 的 高 压 选 择 下, 害 虫 对 Bt 作 物 抗 性 问 题 将 不 容 忽 视 昆 虫 对 Bt 毒 素 的 抗 性 机 制 是 复 杂 和 多 样 的, 但 中 肠 结 合 位 点 的 改 变 是 最 主 要 的 一 种 机 制 棉 铃 虫 中 已 知 的 受 体 有 氨 肽 酶 N 和 钙 粘 蛋 白 保 存 在 本 实 验 室 的 高 抗 Cry1A 蛋 白 的 棉 铃 虫 品 系 经 前 人 研 究 未 发 现 该 品 系 存 在 钙 粘 蛋 白 基 因 的 缺 失 失 活, 比 较 抗 感 品 系 棉 铃 虫 的 钙 粘 蛋 白 APN 序 列, 只 发 现 少 量 氨 基 酸 的 变 异, 因 此 该 棉 铃 虫 品 系 对 Cry1A 产 生 抗 性 很 可 能 与 受 体 蛋 白 表 达 水 平 变 化 相 关 或 存 在 其 它 的 受 体 蛋 白 本 文 首 先 比 较 了 两 种 双 向 电 泳 系 统 以 及 几 种 BBMV 提 取 方 法 对 双 向 电 泳 的 影 响, 建 立 了 棉 铃 虫 中 肠 Bt 结 合 蛋 白 蛋 白 质 组 学 的 研 究 方 法, 利 用 蛋 白 质 组 学 的 方 法 分 离 和 分 析 了 棉 铃 虫 中 肠 Cry1A 毒 素 的 结 合 蛋 白, 比 较 了 抗 感 品 系 棉 铃 虫 中 Cry1Ac 结 合 蛋 白 的 变 化, 探 讨 该 棉 铃 虫 品 系 对 Bt 毒 蛋 白 产 生 抗 性 的 可 能 机 制 并 比 较 了 抗 感 品 系 棉 铃 虫 中 与 不 同 Bt 毒 蛋 白 作 用 的 结 合 蛋 白 的 差 异 在 国 内 首 次 开 展 了 利 用 蛋 白 质 组 学 研 究 棉 铃 虫 的 中 肠 Bt 结 合 蛋 白 及 其 与 抗 性 的 关 系 主 要 结 果 如 下 : 1 方 法 的 建 立 : 比 较 ISO-DALT 和 IPG-DALT 两 种 双 向 电 泳 系 统, 发 现 这 两 种 系 统 都 可 以 用 于 棉 铃 虫 Cry1Ac 结 合 蛋 白 的 分 离,ISO-DALT 对 结 合 蛋 白 的 分 离 效 果 虽 比 IPG-DALT 更 好, 尤 其 对 高 分 子 量 蛋 白 的 分 离 明 显 优 于 IPG-DALT 法, 但 由 于 上 样 量 少, 因 此 对 后 续 的 质 谱 分 析 非 常 不 利 ;IPG-DALT 虽 较 昂 贵 但 有 利 于 进 行 后 续 试 验, 因 此 本 文 选 用 IPG-DALT 系 统 进 行 双 向 电 泳 比 较 已 报 道 的 这 三 种 BBMV 提 取 方 法 :Wolfersberger 法 English-Readdy 法 Abdul- Rauf 法, 结 果 显 示 这 三 种 方 法 对 分 离 Cry1Ac 结 合 蛋 白 的 种 类 没 有 影 响, 但 这 三 种 方 法 获 得 的 蛋 白 量 不 一 样 结 果 总 结 三 种 方 法 的 优 点, 建 立 了 一 种 新 的 综 合 BBMV 提 取 方 法, 获 得 了 高 量 的 蛋 白, 通 过 双 向 电 泳 和 结 合 试 验 证 明 该 方 法 适 合 双 向 电 泳 Cry1A 结 合 蛋 白 研 究 2 利 用 双 向 电 泳 结 合 Western 杂 交 以 及 生 物 质 谱 的 方 法, 研 究 了 棉 铃 虫 中 肠 Cry1Ac 结 合 蛋 白, 首 次 鉴 定 得 到 棉 铃 虫 中 肠 四 种 新 的 Cry1Ac 结 合 蛋 白 :V-ATPase 亚 基 B 热 激 蛋 白 肌 动 蛋 白 以 及 一 种 未 知 的 新 蛋 白 肌 动 蛋 白 和 V-ATPase 亚 基 A 己 报 道 为 烟 芽 夜 蛾 中 Cry1Ac 结 合 蛋 白, 热 激 蛋 白 和 未 知 新 蛋 白 为 首 次 报 道 的 昆 虫 中 肠 Cry1Ac 结 合 蛋 白 3 用 蛋 白 质 组 学 的 方 法 比 较 了 抗 感 棉 铃 虫 中 肠 结 合 蛋 白 的 数 量 和 表 达 量, 结 果 发 现 结 合 蛋 白 种 类 无 差 异, 但 其 中 一 种 新 的 结 合 蛋 白 在 抗 性 品 系 中 表 达 量 至 少 下 降 了 6.49 倍 前 人 的 研 究 说 明, 碘 标 记 结 合 试 验 证 明 结 合 位 点 或 受 体 数 目 减 少 是 该 抗 性 品 系 对 Cry1A 毒 蛋 白 产 生 抗 性 的 主 要 原 因 结 合 前 人 研 究 和 本 文 结 果, 本 文 新 结 合 蛋 白 表 达 量 严 重 降 低 可 能 是 该 抗 性 品 系 产 生 抗 性 的 原 因 之 一 4 初 步 比 较 Cry1Ac Cry1Ab 和 Cry1Ah 作 用 于 敏 感 品 系 和 抗 性 品 系 的 结 合 蛋 白 结 果 发 现 无 论 是 抗 性 品 系 和 敏 感 品 系 Cry1Ab 的 结 合 都 是 最 少 的, 在 敏 感 品 系 中,Cry1Ab 未 结 合 肌 动 蛋 白 和 V-ATPase, 而 Cry1Ac 和 Cry1Ah 对 肌 动 蛋 白 和 V-ATPase 结 合 强, 说 明 新 蛋 白 和 热 激 蛋 白 对 毒 素 的 作 用 过 程 来 说 可 能 是 必 需 的, 肌 动 蛋 白 和 V-ATPase 可 能 与 毒 力 相 关 前 人 研 究 Cry1Ab 和 Cry1Ah 对 Cry1Ac 毒 蛋 白 抗 性 品 系 存 在 一 定 的 交 互 抗 性, 各 个 Bt 蛋 白 在 Cry1Ac 抗 性 品 系 和 敏 感 品 系 中 结 合 蛋 白 的 差 异 还 是 存 在 于 新 蛋 白 的 表 达 量 上, 新 蛋 白 表 达 量 下 降 可 能 与 交 互 抗 性 产 生 有 关, 也 可 能 存 在 其 他 的 原 因 本 文 链 接 : 授 权 使 用 : 南 京 农 业 大 学 图 书 馆 (wfnjny), 授 权 号 :d613e900-a9e5-4c4a-b0e9-9e9f c 下 载 时 间 :2011 年 3 月 7 日

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