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燃尻栾
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!"#$## %&'&!& 基础研究不同浓度诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究刘源王海萍吕洋王浩宇霍艳丽河北北方学院组织学与胚胎学教研室河北张家口 # 人体解剖学教研室河北张家口 # 摘要目的探讨 $ % 体外诱导骨髓间充质干细胞 &'' 分化为心肌样细胞的最适浓度方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠 &'' 取第代 &'' 培养后进行定向诱导根据 $ % 终浓度的不同分为组 )*& 组 )* 组 )* 和组空白对照组诱导后更换为完全培养液继续培养周组仅用完全培养液培养倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化运用流式细胞仪检测技术对 &'' 表面联合标记物进行鉴定各组细胞培养至第周时运用免疫细胞化学染色技术检测结蛋白 ")+ 间隙连接蛋白, "+ 及心肌肌钙蛋白 -. - 的表达情况运用透射电镜观察分化细胞的超微结构变化实时荧光定量多聚核苷酸链式反应 /"0%+)"!0+0+",)"/0"0+ /"0+,.% 检测各组细胞在诱导后培养第周时心肌早期转录因子.%2# 及 %'3 的表达结果原代 &'' 于第周形成集落多呈梭形星形少数形状不规则传代后细胞体积变大诱导后细胞多为长梭形呈一致性生长流式细胞仪检测技术对 &'' 表面联合标记物的鉴定结果显示 # 的阳性表达率分别为 55 和 #5 免疫细胞化学染色技术检测结果显示诱导后常规培养至第周组 & 组组细胞胞质均呈阳性表达 ")+, "+ 和. - 而组细胞呈弱阳性或阴性表达 & 组细胞的阳性表达率均最高差异具有统计学意义 # 透射电镜结果显示各诱导组细胞于诱导后常规培养至第周胞质内可见平行排列的肌丝及亚细胞结构如线粒体粗面内质网和核糖体.% 检测结果显示 &'' 经诱导后常规培养第周时各诱导组细胞均表达.% 及 2# 基因在第周时表达减弱在第周时表达增强就基因表达而言三个诱导组相比较 & 组明显优于其他两组 #%'3 基因在诱导后常规培养期间均不表达对照组细胞在常规培养期间.% 及 2# 基因的表达量为而不表达 %'3 基因结论 $ % 可在体外诱导大鼠 &'' 定向分化为心肌样细胞其诱导分化最适浓度为 )* 关键词骨髓间充质干细胞 $ % 心肌样细胞细胞分化中图分类号文献标志码 6#!!" #$%&#&#'!!%%&&# *-7 8!0 $ 30+%+ *9 80 $ 30,%! 37: 80%+ "0/)",;3+,,0)/,,"0/)",;3!)0 0,) 3""+,/7 +"/+0+02,!#+0 )## "#" ) # #*!!$+#" #,#&*!!$+) " ) $- ) ) # "&.#" *!!$+#")/""#""#&*"## *!!$+)"""0. 0* 0+ "0-,#&."##)#"# " ),)# 收稿日期 6 修回日期 66 基金项目河北省自然科学基金 '&## 河北北方学院创新培育项目 '&++# 河北省教育厅重大项目 '& 河北省自然科学基金 '&## $" '$##" # '&#### + ' '&++#"!23"#+#'& 通讯作者王海萍 &36&# 优先出版 )))&#,&,#"6&&&&&&!"!

2 西安交通大学学报医学版第卷 0- )#" # "& ##)"" ###&$#*!!$+)"" ) # &#) #" ),-+"#)"#" ## &!) # # ) " # ##& '. #"###0..',&#"!+*!!$+)"#" 5+ " ),"#& *!!$+"## ),#) ")")&"#) #&."##"")"& )# ""#*!!$++-+-#"+-) &6&6 "&#6# &*!!$+"#" )#"),- #"+ ) ""#&,# ) 0* )&#&# ## "#"###") )# ##"#&"" )" #&#"##"0.."',&#)," "#"#"),#"), "#0*)# )"#&#& 0.."',&# 0 - )!+ )""#"& #"#"*!!$+#" #,#" ## & *+, ) # # #" #,##" 随着大众生活水平的提高饮食结构的改变心肌梗死等缺血性心脏病在我国的发病率呈逐年上升的趋势尤其是心肌梗死近期及远期并发症不仅威胁人类生命还严重影响人们的生活质量众所周知在成熟的个体中心肌属终末分化细胞一旦受损自身不能经由再生修复只能由疤痕组织替代因此临床上治疗心肌梗死旨在挽救非梗死区域的心肌细胞近年来细胞移植技术的快速发展为治疗心肌梗死提供了新的方法也成为心肌梗死治疗的研究热点在坏死区域移植具有收缩功能的细胞能在一定程度上增强心肌收缩力改善心功能目前用于研究的靶细胞多为具有多向分化潜能的各类干细胞骨髓间充质干细胞,")0//, )"")0") "&'' 因有多向分化潜能较强的自我更 % 新能力免疫耐受调节宿主细胞存活及易于获取且不受伦理学限制等优点已作为心肌组织工程中倍 %# 受瞩目的种子细胞随研究的不断深入已有研究表明 $ % 可诱导大鼠 &'' 分化为心肌样 6 细胞然而目前关于 $ % 在体外诱导实验应用中没有较为统一的浓度标准本实验探讨诱导剂 $ % 对 &'' 增殖与诱导分化能力的影响筛选出对 &'' 诱导分化较强的最适浓度材料与方法实验动物和主要试剂清洁级健康雄性大鼠周龄质量 ## 由河北医科大学动物实验中心提供实验过程中对动物的处置均符合伦理学准则 -''-,"',+;+"!",'"+!) 培养液美国 -&: 公司胎牛血清澳大利亚 -&: 公司 $ % 美国公司大鼠抗体 % #%-.%%.' 美国 & 公司兔多克隆抗体 ")+, "+.- 美国 0) 公司兔免疫细胞化学染色试剂盒北京中杉金桥 /+)"% /+.'. '0"/'+ 日本.000 公司 8& /")+.' 中国.000 公司 -.//)# 的原代分离培养及传代采用颈椎脱臼法处死大鼠取其四肢长骨置于 #)** 乙醇中浸泡 #)+ 于超净台中无菌条件下剥除肌肉筋膜分离出股骨及肱骨放入含 %302 液青霉素 % 链霉素的缓冲液中浸洗次剪除骨骺端暴露骨髓腔用 -'' 完全培养液含 # )** & )**"%/")),*!0)+" 反复冲洗骨髓腔将其缓慢加入 #)* 离心管中室温离心弃上清液加入完全培养液充分吹打混匀制成单细胞悬液后接种于无菌培养瓶中置入饱和湿度体积分数为 #)**: 的细胞培养箱中培养后首次换液以弃除不贴壁的悬浮细胞此后每换液次待贴壁细胞长至 55 融合时胰酶消化以 = 或 = 的比例传代培养至第或代备用 -0//)# 形态学观察每日于倒置相差显微!"!

3 期刘源王海萍吕洋等不同浓度 $ % 诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究镜下观察细胞传代及诱导前后的生长状态和形态变化并拍照记录 -//)# 表面联合标记物的鉴定取第代 &'' 弃除原培养液 & 浸洗次胰酶消化 -'' 完全培养液终止消化充分吹打混匀后移至 #)* 无菌离心管中室温离心弃上清液 & 浸洗次离心浸洗次细胞重悬并计数调整细胞密度为 > )* 分装至 # 支 #)* 离心管中每管 * 依次加入 % 抗体 #*#%-. 抗体 *%%.' 抗体 #*% 抗体 #*?#%-. 抗体 *?%%.' 抗体 #* 阴性对照加入适量 & 避光孵育 )+ 室温离心弃上清液 & 浸洗次离心浸洗次测定组与对照组均加入 #*& 混匀制成单细胞悬液运用流式细胞仪技术鉴定 &'' 表面联合标记物 -//)# 体外诱导分化取第代 &'' 消化后调整细胞密度至 > 6 )* 接种于无菌培养瓶中第代 &'' 培养后进行定向诱导根据 $ % 终浓度的不同分为组 )*& 组 )* 组 )* 和组空白对照组诱导后更换为完全培养液继续常规培养周倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化培养期间每换液次细胞融合达 5#5 时胰酶消化以 = 或 = 的比例传代每日倒置相差显微镜下观察其生长状态及形态变化诱导组与对照组细胞培养周后进行爬片待细胞长至 55 融合时 & 浸洗次 * 多聚甲醛固定保存备用 - 诱导分化的 //)# 免疫细胞化学检测取 * 多聚甲醛固定的细胞爬片 #)**./+,% & 浸洗 #)+ > 次 )** 过氧化氢 % 甲醇室温表实时荧光定量 ) 所需的基因引物避光孵育 )+ #)**./+,%& 浸洗 #)+ > 次 & 浸洗 #)+ > 次加适量内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育 #)+ & 浸洗 #)+ > 次加适量非特异性染色阻断剂室温孵育 #)+ 加适量 ")+ = 稀释, "+ 及. - 抗体均为 = 稀释过夜阴性对照组用 & 代替一抗复温 )+ & 浸洗 #)+ > 次加生物素标记的羊抗兔 - 室温孵育 )+ & 浸洗 #)+ > 次加链霉卵白素 % 过氧化物酶孵育 #)+ & 浸洗 #)+ > 次二氨基联苯胺 & 液显色室温 )+ 自来水冲洗苏木精复染 )** 盐酸乙醇分化梯度乙醇脱水二甲苯透明中性树胶封固光镜下观察阳性结果为胞质呈棕黄色于光镜下随机选取个非重叠视野计算 ")+, "+ 及. - 的阳性细胞所占百分比每个视野内标记物阳性细胞数 + 每个视野内的总细胞数 >5 - 透射电镜观察将诱导后培养至周的细胞消化充分吹打混匀制成细胞悬液移至 #)* 离心管中室温离心弃上清液 & 浸洗次重复离心浸洗次室温离心使之形成细胞团块将细胞团块置于 #)** 戊二醛固定 & 浸洗 #)+ > 次 )** 锇酸固定随后 & 浸洗 )+ > 次梯度丙酮脱水, 进行包埋超薄切片机切片透射电镜下观察各组细胞的超微结构变化 -) 检测 23.- 及 /5) 的表达提取各组细胞的总按适用于.% 的.000 试剂盒说明及引物的反应条件进行反转录和目的基因.%2# 及 %'3 扩增 3 为内参对照然后进行数据处理与分析判断各目的基因于 ) 水平的表达情况表.0/+)"/ """;,/.% 基因上游引物序列下游引物序列.% #A%...%A #A%...%A 2# #A%...%A #A%..%A %'3 #A%...%A #A%..%A 3 #A%...%A #A%...%A 6 统计学分析采用软件对各组实验数据进行统计学分析各组数据均以 B 表示采用卡方检验对各相关标记物阳性率进行比较实时荧光定量数据分析采用检验 # 为差异具有统计学意义. 结果.-//)# 的分离培养与形态学观察及其表面联合标记物的鉴定倒置相差显微镜下观察到接种至培养瓶中的原代 &'' 呈圆形在培养液中呈悬浮状态图后开始贴壁后明显贴壁后几乎所有细胞均已贴壁多数细胞呈短梭形也!"!

西安交通大学学报医学版第卷有三角形不规则形部分细胞自胞体伸出长短不一的突起图 & 细胞于首次换液后生长迅速左右细胞数量增加多呈长梭形细胞融合可达

实验结果显示的阳性表达率为 5 阳性表达率为 #5 而 # 阳性表达率为 5 证明运用全骨髓贴壁法获取大鼠 &'' 经传代培养增殖能够获得纯化的 &'' 图图

"/+"/" 0"%,/0)+/,,"> 即刻分离的原代骨髓间充质干细胞 & 原代骨髓间充质干细胞培养原代骨髓间充质干细胞培养.-.

少数形状不规则图常规培养周时多数细胞呈长梭形不规则形细胞逐渐减少图 & 常规培养周时相邻细胞间联系紧密排列规则生长方向趋于一致

"+ 及.- 其中 & 组的阳性表达均最强图 & 组中 ")+, "% + 及.- 均为弱阳性或阴性表达图经统计学分析各诱导组与对照组 ")+, "+ 及.

-+ " /"0)"/,!0,/,/,! B6 组别 ")+, "+. - 组 #B#6 #B# #B6 图.

4 西安交通大学学报医学版第卷有三角形不规则形部分细胞自胞体伸出长短不一的突起图 & 细胞于首次换液后生长迅速左右细胞数量增加多呈长梭形细胞融合可达 5 #5 图传代后细胞体积较原代细胞大多呈长梭形混杂少量三角形或不规则形细胞对第代 &'' 进行鉴定运用流式细胞仪技术鉴定其表面联合标记物 # 及实验结果显示的阳性表达率为 5 阳性表达率为 #5 而 # 阳性表达率为 5 证明运用全骨髓贴壁法获取大鼠 &'' 经传代培养增殖能够获得纯化的 &'' 图图倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态学变化 + ',/,,+00",;," )0//, )"")0") " &'',"/"!"/+"/" 0"%,/0)+/,,"> 即刻分离的原代骨髓间充质干细胞 & 原代骨髓间充质干细胞培养原代骨髓间充质干细胞培养.-.//)# 经诱导后的形态学观察及免疫细胞化学检测结果第代 &'' 经不同浓度 $ % 诱导后常规培养周时细胞形态及排列逐渐变为均一规则的长梭形少数形状不规则图常规培养周时多数细胞呈长梭形不规则形细胞逐渐减少图 & 常规培养周时相邻细胞间联系紧密排列规则生长方向趋于一致部分细胞形成漩涡样结构图各组 &'' 经 $ % 诱导后常规培养期间均未出现自发性搏动现象经 $ % 诱导后常规培养周时各组细胞均呈阳性表达 ")+, "+ 及.- 其中 & 组的阳性表达均最强图 & 组中 ")+, "% + 及.- 均为弱阳性或阴性表达图经统计学分析各诱导组与对照组 ")+, "+ 及.- 的阳性率相比差异均具有统计学意义均 # 表表.0 种标志物在诱导组与对照组的阳性细胞表达率的比较.0,++"/0",;")+, " " /"0)"/,!0,/,/,! B6 组别 ")+, "+. - 组 #B#6 #B# #B6 图. 骨髓间充质干细胞表面联合标记物的表达 +,++""/"+,,;!/;0"0+",;&'' 骨髓间充质干细胞表面标记物 # 阳性表达率 5 骨髓间充质干细胞表面标记物阳性表达率 5 骨髓间充质干细胞表面标记物阳性表达率 #5 & 组 ##6B 6B B6 组 6B66 #B #B6# 组 B B B 与 & 组相比较 # 与组相比较!"!

5 #期刘 " 源& 王海萍& 吕 " 洋& 等+ 不同浓度 62 7 % %诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究 #$! 图 " 倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞经诱导后常规培养期间的形态学变化 ^!?Y 2-3 D2&AD D@ ' 2@ D Y D0 K -32 2K -)' 7 D2 A D )'D?#骨髓间充质干细胞经诱导后&常规培养 % 周% 8#骨髓间充质干细胞经诱导后&常规培养 # 周% ;#骨髓间充质干细胞经诱导后&常规培养 > 周' 图 " 骨髓间充质干细胞经诱导后的免疫细胞化学染色检测结果 ^ >EAA32D. D 'A 2 2@D Y ;# 8 组 = A 2 ;D22/ 2>! F2 E表达% = Z ^# = 组 = A 2 ;D22/ 2>! F2 E表达' F+ " 骨髓间充质干细胞经诱导后的透射电镜观察结果 " 透射电镜结果显示&经 62 7 %% 诱导后&常规培养至第 > 周时&各诱导组部分细胞形态已发生变化& 质内可见平行排列的肌丝&含粗面内质网线粒体及呈短圆柱状'位于中央的细胞核较大&呈卵圆形'胞维细胞样特点' 核糖体等细胞器&超微结构具有发育过程中的类心肌细胞样的特点!图 5"&对照组中细胞的形态多呈成纤图 J" 骨髓间充质干细胞经诱导后的透射电镜观察结果 ^ 5F 2A D2 D2A D D).D Y ; 分别为? 组分化细胞含细胞器&细胞核呈卵圆形&单个% 8 组分化细胞的胞质内可见线粒体粗面内质网及平行排列的肌丝% ; 组分化细胞的胞质内可见平行排列的肌丝' $$***+ $$.//0+ ' -./0+ 2%' / )#, )#,

6 西安交通大学学报医学版第卷.-) 检测各实验组 23.- 及 /5) 的表达第代 &'' 经 $ % 诱导培养在诱导后常规培养第周时各诱导组细胞均表达.% 及 2# 基因在第周时表达减弱在第周时表达增强就基因表达而言个诱导组相比较进行统计学分析 & 组明显优于其他两组 # 对照组细胞在常规培养期间.% 及 2# 基因的表达量为各组细胞在常规培养期间均不表达 %'3 基因图 6 图实时荧光定量 ) 检测骨髓间充质干细胞经诱导后 23.- 及 /5) 在 3 水平的表达 +6.")"/"+,,;.%2#0% '3+ $ %+!"&''!0+0+"/"0%+)" 组 )* $ %& 组 )* $ % 组 )* $ % 组空白对照组第周组和组与 & 组比较 # 0 讨论 &'' 于体外诱导可分化为心肌样细胞且可用于细胞移植为心肌梗死等缺血性心脏病晚期并发症的防治带来新的曙光其中 #% 氮胞苷 #%00 为常见的诱导剂但它的细胞毒性作用使之应用于临床的愿景较难实现故而寻求一种更安全有效的诱导剂成为这一领域亟待解决的问题已有研究表明 $ % 在正常心脏发育及心肌细胞形成的不同阶段起重要作用但是目前国内关于 $ % 诱导 &'' 向心肌样细胞分化的实验研究不多且没有关于其最适诱导浓度的研究 $ % 属 $ 家族成员的一份子 $ 家族在细胞增殖与迁移神经系统与心脏发育干细胞分化及 % 更新等多种生理过程中起着重要的调节作用其中 $ 信号转导通路的作用机制可分为 % 连环素 % 0"+ 依赖性的 $ %0"+ 经典通路和 %0"+ 非依赖性的非经典通路 $ % 代表非经典 $ 参 % # 与心脏的发育与形成 8 等的研究表明 $ % 的表达对胚胎心室肌的发育有直接和早期的 6 作用近期 &-: 等的研究结果表明非经典 $ % 信号转导通过半胱天冬蛋白酶介导的经典 $ % 连环蛋白的抑制促进心脏的形成此外 :% *- 等指出在心肌梗死的环境中 $ % 表达上调引起移植的干细胞分化本实验使用 $ % 对 &'' 进行诱导使其向心肌样细胞分化形态学结果显示 &'' 经 $ % 诱导后在常规培养期间细胞形态及排列逐渐变为均一规则的长梭形不规则形细胞逐渐减少相邻细胞间联系紧密生长方向趋于一致呈类心肌样细胞的形态改变为进一步验证 $ % 诱导 &'' 分化为心肌样细胞的有效性运用免疫细胞化学技术对所培养的细胞进行检测结蛋白 ")+ 是一种细胞骨架蛋白在胞内的作用为机械性支撑在胞外的作用是维持胞外基质联结同时参与信号转导心肌细胞收缩再生线粒体功能调节等已有研究证实在骨骼肌与心肌发育过程中 ")+ 是重要的标志及功能蛋白心肌肌钙蛋白 -. - 在心肌收缩过程中调节粗细肌丝间的相对滑行. - 被赋予高度的心肌特异性间隙连接蛋白, "+ 是形成心肌间隙连接不可或缺的蛋白它的正常表达与分布可维持间隙连接通道电偶联功能正常及保持心脏正常电活动与协调舒缩本实验结果显示上述种蛋白在经 $ % 诱导后的细胞中均呈阳性表达而对照组三者均为弱阳性或阴性表达差异均具有统计学意义 ")+ 阳性率较高标志着大部分细胞已获得肌细胞表型. - 与, "+ 阳性率稍低. - 阳性率在 $ % 浓度为 )* 时最高标志着部分细胞已获得心肌细胞表型这一结果表明 &'' 大部分被诱导分化为成肌细胞一部分则分化为心肌样细胞而且是先分化为成肌细胞继而向心肌样细胞分化此外透射电镜结果同样印证了经 $ % 诱导的 &'' 具有类似发育过程中的心肌细胞样的超微结构特点!"!

7 期刘源王海萍吕洋等不同浓度 $ % 诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究 #.% 为心脏前体细胞的一个最早期标志是心脏细胞分化发育期间不可或缺的转录因子已有研究证实.% 能够促进细胞向心肌细胞分化在脊椎动物心脏发育期间 2# 最早表达它是一个关键性的转录因子可以显著影响心脏发育肌球蛋白重链 ),+ "00+ '3 是组成肌纤维的不可或缺的成分分为 %'3 和 % '3%'3 多在成熟心肌细胞中表达而 %'3 多在胚胎型心肌细胞中表达在一定程度上两者的含量可以反映出心肌细胞的分化程度本实验对第代 &'' 进行诱导培养后其常规培养第周时各诱导组细胞均表达.% 及 2# 基因在第周时表达减弱在第周时表达增强就基因表达而言个诱导组相比较 & 组明显优于其他两组 # 对照组细胞在常规培养期间.% 及 2# 基因的表达量为各组细胞在常规培养期间均不表达 %'3 基因进一步证实经 $ % 诱导后 &'' 已向心肌样细胞分化综上所述根据诱导后细胞的形态学改变结合蛋白的表达超微结构的观察及心脏早期转录因子基因的表达等相关分析证明 $ % 能够于体外诱导 &'' 定向分化为心肌样细胞且分化的细胞具有心肌细胞的特性其最适诱导浓度为 )* 至于 $ % 的诱导机制尚待进一步研究参考文献张军辉李媛曹礼庭等 & 解剖! 型超声心动图对骨髓间充质干细胞移植前后心脏结构和功能的研究 & 川北医学院学报 6#&..7!%'+3'.$..$.$& # *!" " # #!$+) " #" & * +#6#6##6#& '03 *.-3 '&$# ##" #"#" # 5 ##"# &. +## & +3' :+3'.' &$#)0 0"# 0 " #"&*# * +##& # !9! &"# 2#" )"# ##&. +###6& 637$&"# # #"#"# &$ +-&.-73!.7-.&3# &*.#"'!"& 张勇程敬亮李华丽等 & 大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养 & 中国医学工程 & 贾敏曾秋棠王永奎等 & 骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化 & 郑州大学学报医学版 6&.* $3$& #" #" #"" ##&!+*6 & 7887$9..!$7.& ",#&* # *+6#& 9.87$!73'8.!.!77 &3 ##")### #"&+#6 66& +73'3.' 8!7$383& #"#" ")&-## & 7 '!.!-..&!" ##5.+3* ""## 0& '0#& #' & ## #"" ' #" " # &+"# #& 6*$$7'!$*. &#" ##) "#"# "#"""".9 &-*#6& $.+!3'$&*) ##" #"&' 6#& 9$.8.!.!77!99+.&0" """# " "#&.$# 6& '. 9.!$.+3 +%3!7&- #"#"""## &+;#6#6& $++9.'+3$+7!%.*. 0&9# ) #9+'3## ) $9+':&#" '.#"$#"$.##66& 编辑韩维栋!"!

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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