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围东
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1 896 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (6): 液质联用分析 rhtnk-tpa 的一级结构陶磊, 丁有学, 郭莹, 饶春明 * *, 王军志 ( 中国食品药品检定研究院, 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室, 北京 ) 摘要 : 液质联用分析重组人组织型纤溶酶原激活物变构体 (TNK-tPA) 的一级结构用糖苷酶切除其糖基, 测定质谱分子量 ; 对其进行还原烷基化胰蛋白酶酶解, 测定液质肽图及串联质谱图, 通过质谱图的解析对氨基酸序列进行验证, 并对翻译后修饰进行鉴定该蛋白氨基酸序列与理论一致, 其中约 5% 的 M207 发生氧化 ; 约 80% 的 T61 发生岩藻糖化修饰 ; N103 N448 N184 ( 约 15%) 存在 N- 糖基化修饰, 糖型均为复杂型 N- 糖液质联用结合适当的样品前处理方式, 可快速准确地对该蛋白的一级结构进行鉴定关键词 : 液质联用 ; TNK-tPA; 一级结构中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : (2013) Characterization of the primary structure of TNK-tissue plasminogen activator using LC-MS TAO Lei, DING You-xue, GUO Ying, RAO Chun-ming *, WANG Jun-zhi * (Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, National Institute for Food and Drug Control, Beijing , China ) Abstract: The primary structure of TNK-tissue plasminogen activator (TNK-tPA) was characterized using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Firstly, the molecular mass of deglycosylated protein was measured. Then peptide mass mapping and MS/MS of the reduced, alkylated and trypsin-digested sample were tested and analyzed so as to verify its amino acid sequence and identify post-translational modifications. Results show that the amino acid sequence was consistent with designed structure; about 5% of M207 was oxidized; T61 was fucosylated with ~80% occupancy; N103, N448 and N184 (~15% occupancy) were glycosylated with complex-type oligosaccharides. LC-MS coupled with proper sample pretreatment is approved to be a rapid and powerful approach to characterize the primary structure of TNK-tPA. Key words: LC-MS; TNK-tPA; primary structure 血栓是影响人类健康的一类重大疾病, 已上市或研究中的溶栓药主要是纤溶酶原激活剂类药物, 包括链激酶 (SK) 葡激酶 (SaK) 尿激酶 (UK) 和组织型纤溶酶原激活剂 (tissue-type plasminogen 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 十二五科技重大专项生物技术药物质量标准和质量控制技术平台资助项目 (2012ZX ). * 通讯作者 Tel: , Fax: , raocm@nicpbp.org.cn Tel: , Fax: , wangjz@nicpbp.org.cn [1, activator, t-pa) 等 2] 重组人组织纤溶酶原激活物变构体 (TNK-tPA) 是 t-pa 的突变体, 属于第 3 代溶栓药物, 2000 年获得 FDA 批准用于治疗急性心肌梗死 [3] TNK-tPA 含 527 个氨基酸残基, 分子质量约 60 kd, 存在 17 对二硫键, 在 3 个部位发生氨基酸突变 : T103N N117Q KHRR ( ) 均变为 A 突变后的 TNK-tPA 血浆清除速度下降, 与纤维蛋白结合能力增强, 具有更长的半衰 [4, 期和更强的特异性 5] TNK-tPA 是用基因工程生产的治疗用蛋白药物,

2 陶磊等 : 液质联用分析 rhtnk-tpa 的一级结构 897 其结构是否与理论预期一致是质量控制中的关键问题, 因此对产品尤其是理化对照品的结构进行鉴定非常必要 TNK-tPA 分子量大, 结构复杂, 分析存在一定困难本文用液质联用方法对 TNK-tPA 进行了一级结构分析, 包括质谱分子量的测定氨基酸序列的验证以及翻译后修饰的鉴定测定液相参数 : 柱温为 50 ; 样品保存温度为 8 ; 流速 0.2 ml min 1 ; 上样量 10 μl; 使用 80 min 连续梯度, 流动相 B 由 5%~50%; 质谱参数毛细管电压 : V; Cone 电压 : 30 V; 去溶剂气体温度 : 200 ; 源温 : 80 ; 去溶剂气体流速 : 800 L h 1 ; 扫描范围 : m/z 100~2 500; MS e 模式采集材料与方法试剂与仪器超纯水 (Milli-Q); 乙腈 ( 色谱纯 ); 甲酸碳酸氢铵二硫苏糖醇 (DTT) 碘乙酰胺 (IAM) 均为分析纯 ; Trypsin 试剂盒 (Calbiochem); 糖苷酶 PNGase F (NEW ENGLAND); 流动相 A (0.2% 甲酸水溶液 ); 流动相 B (0.2% 甲酸乙腈溶液 ) 透析膜 (Milli-Q); 离心机 (BECHMAN); 高效液相色谱系统 (Waters Alliance 2695); 二极管阵列检测器 (Waters2996); 色谱柱 (Symmetry 300, C18, 2.1 mm 150 mm); 质谱仪 (Q-TOF Micro); Masslynx4.0 操作软件 ; 超高效液相色谱系统 (Waters ACQUITY H-Class); 色谱柱 (BEH300 C18, 1.7 µm, 2.1 mm 150 mm); 质谱仪 (Xevo G2 QTof); Masslynx4.2 操作软件 ; Biopharmalynx 数据处理软件分子量测定取供试品溶液 100 µl, 加入 0.1 mol L 1 DTT 1 µl, 37 水浴 1 h, 加入糖苷酶 5 µl, 37 水浴 3 h 用 Waters Alliance 2695 及 Q-TOF Micro 进行测定, 方法参照文献 [6] 液质肽图测定用 0.5 ml 超纯水重溶样品至质量浓度约 3 mg ml 1, 对 50 mmol L 1 碳酸氢铵溶液透析过夜取 200 µg 分装冻干, 按说明书步骤对冻干样品进行胰蛋白酶酶解, 完毕后平分为两份, 一份加入糖苷酶 10 µl, 一份加入糖苷酶缓冲液 10 µl, 37 孵育 3 h, 置 4 备用用 Waters Alliance 2695 及 Q- TOF Micro 进行测定上样量 30 μl; 使用 80 min 连续梯度, 流动相 B 由 5%~45%; 质谱扫描范围 : m/z 100~3 000; 其余条件同分子量测定串联质谱分析样品前处理同液质肽图测定, 用 Waters ACQUITY H-Class 及 Xevo G2 QTof 结果 1 分子量测定结果显示存在 2 种相对分子质量 : , 二者差值 , 与岩藻糖残基相对分子质量 (146.74) 很接近, 提示部分蛋白可能发生岩藻糖化修饰, 后续结果证实部分蛋白第 61 位苏氨酸 (T61) 存在岩藻糖化修饰该蛋白有无岩藻糖修饰的理论相对分子质量分别为 , 测定误差分别为和氨基酸序列验证对氨基酸序列的验证在 2 个层次进行 : 一级质谱和二级质谱一级质谱的验证过程是将液质肽图中各肽段的实测分子量与理论酶切肽段分子量进行匹配, 如果误差较小且有一定的信号强度, 则认为该肽段序列正确, 但只能对已知序列的高纯度蛋白进行验证, 并且当两个理论酶切肽段分子量比较接近时很难做出判断串联质谱是根据肽段碰撞后所得碎片的质量数差值推定肽段序列, 验证结果更加可信, 并可用于翻译后修饰的鉴定图 1 为样品经还原烷基化胰蛋白酶酶切糖苷酶酶切后所得液质肽图, 上下图分别为质谱图和紫外图一个半胱氨酸发生烷基化相对分子质量增加 57.03; 糖苷酶切除 N- 糖后, 糖基化位点处的 N 变为 D, 相对分子质量增加 0.98 考虑以上修饰对肽段分子量的影响, 对液质肽图进行解析, 所有理论酶切肽段均有相匹配的质谱信号, 现将相对特殊的肽段解析结果列于表 1 在一级质谱的基础上, 又对氨基酸序列进行了二级质谱验证图 2 为该蛋白的 N- 末端肽段的二级 Table 1 Verification results of some peptides Peptide Theoretical MS MS/MS mass Measured mass Error Measured mass Error b/y Found 1 2 N-terminal C-terminal KHRR ( ) AAAA

3 898 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (6): Figure 1 Peptide mass mapping of TNK-tPA 质谱解析结果, 内图为相应母离子的一级质谱图及实测分子量, 汇总结果见表 1 Figure 2 The precursor mass (insert) and MS 2 of N-terminal peptide 3 N- 糖基化位点鉴定及糖型分析 N- 糖的分析分两步进行 : 首先, 将切除 N- 糖前后的液质肽图对比 ( 图 3), 确定糖基化位点鉴于 N- 糖基化位点需要序列子 NXS/T, 该蛋白中只有 N103 N184 N448 可能发生 N- 糖修饰若发生修饰, 切除糖基后 N 变为 D, 因此切除糖基前如果糖基化位点处为 N, 表明此处未发生糖基化, 切除糖基后如果糖基化位点处为 D, 表明此处发生糖基化且糖基已被切除解析结果显示, 3 个可能的 N- 糖基化位点均发生糖基化修饰, 但 N184 为部分糖基化修饰, 通过软件计算, 修饰比例约为 15% 第二步对糖基类型进行鉴定糖型的鉴定可先通过糖肽分子量的测定预测, 再通过串联质谱进行确证图 4 为 N103 处糖型分析结果, 内图显示糖肽实测相对分子质量为 , 而肽段部分的理论相对分子质量为 , 所以糖基的相对分子质量约为 , 据此推测糖型为岩藻糖化的复杂型 N- 糖 (G2FS, 相对分子质量 ); 通过对串联质谱图进行解析, 发现了各糖肽碎片离子, 进而确证了该推测 N184 及 N448 存在糖基化修饰时未得到理想的串联质谱结果, 通过糖肽分子量测定推测糖型分别为 G1F 与 G2FS 4 O- 糖基化位点鉴定及糖型分析先对液质肽图进行分析, 筛选信号强度较高并且没有相匹配的理论肽段的质谱信号, 然后将其与 Figure 3 Comparison of peptide mass mapping of TNK-tPA without and with PNGaseF treatment

4 陶磊等 : 液质联用分析 rhtnk-tpa 的一级结构蛋氨酸氧化鉴定蛋氨酸氧化后肽段相对分子质量增加 15.99, 据此质量标记可寻找发生蛋氨酸氧化的肽段通过对液质肽图的解析, 发现肽段 18 中的 M207 存在氧化形式, 用软件计算该处蛋氨酸氧化比例约为 5% Figure 4 (N103) The precursor mass (insert) and MS 2 of glycopeptide 理论肽段分子量比较, 看分子量差值是否与某寡糖链的分子量相符如果相符, 则进行串联质谱验证, 确定是否为 O- 糖基化修饰完整蛋白分子量测定结果则提示部分蛋白可能发生岩藻糖化修饰经分析, 在 44 min 左右发现一个质谱信号 ( 相对分子质量 ), 该信号与 T61 所在肽段 ( 肽段 8, 相对分子质量 ) 保留时间一致 ( 图 3), 二者分子量差值为 , 与岩藻糖的分子量一致, 据此推测该信号为岩藻糖化的肽段 8 通过对串联质谱图中离子碎片的解析, 确定前述信号为岩藻糖化的肽段 8 ( 图 5), 经软件计算, 发生岩藻糖化修饰的比例约为 80% Figure 5 The precursor mass (insert) and MS 2 of O-fucosylated peptide 8 修饰位点的确定 : 肽段 8 中含有 1 个 S 与 1 个 T, 二者均可能是糖基化位点在串联质谱图 ( 图 5) 中发现存在 b11 碎片离子, b11 是包含 T 不含 S 的 N- 端碎片, 分子量结果显示带有岩藻糖修饰, 据此判断 T61 为 O- 糖基化位点讨论在切除糖基前后的液质肽图比较中, 色谱峰不能一一对应, 除糖基化修饰对肽段的保留时间产生影响外, 还可能是因为糖链的空间位阻作用导致胰蛋白酶的酶解不完全所致, 比如 N103 存在糖基时, 其相邻的胰蛋白酶酶切位点未被切开在对翻译后修饰的分析鉴定中, 修饰比例是通过提取离子流图 (extracted ion chromatogram, XIC) 的方式计算得到的, XIC 是从总离子流图中提取的某个离子的色谱图如果某肽段部分发生翻译后修饰, 则能检测到两种存在方式, 每种存在方式对应一种离子, 分别提取各离子的色谱图, 并计算色谱峰的峰面积, 各离子峰面积占总面积的比例即视为修饰比例该方法是通过离子信号的多少来计算相对比例的, 有些修饰的存在可能会影响肽段的离子化效率, 造成计算结果出现偏差本文对蛋氨酸的氧化进行了鉴定和定量, 同时也发现了少量脱氨基现象, 由于其比例非常低 (< 1%), 文中未予阐述另外该蛋白存在 17 对二硫键, 且交叉连接, 对其配对方式进行鉴定难度很大, 曾尝试在非还原状态下进行酶切, 未得到理想结果, 故未对二硫键进行阐述 [7, 8] 关于翻译后修饰对蛋白活性的影响, 有文献报道该蛋白 N184 糖基化程度的增加会降低其血块溶解效力, M207 的氧化会影响其与纤维蛋白的结合以及血块溶解效力 [9] 本文测得 N184 糖基化比例约为 [10] 15%, M207 氧化比例约为 5%, 均比文献报道的原创药的比例 (60%, 11%) 要低, 鉴于所用定量方法不同及方法本身的变异, 需将二者同时测定以得到更加准确的比较结果综上所述, 本文通过液质联用的手段对 TNK- tpa 的一级结构进行了分析, 包括氨基酸序列的验证和翻译后修饰的鉴定, 希望能为该产品的质量控制及同类制品的结构分析提供借鉴和参考 References [1] Wang GX. Review of pharmacological studies on thrombolysis drug [J]. Chin J Thromb Hemost ( 血栓与止血学 ), 2011, 17:

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.