产品信息 Thermo Scientific GeneJET 病毒 DNA 和 RNA 纯化试剂盒 #K

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烽夙绍
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1 产品信息 Thermo Scientific GeneJET 病毒 DNA 和 RNA 纯化试剂盒 #K

2 分析证书本试剂盒的质量通过从 200 μl 加标的人体血浆中纯化 RNA 和 DNA 来检测纯化的核酸的产量通过 RT-qPCR 和 qpcr 进行评测, 并与加标的拷贝数相比较质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 2

3 目录页码试剂盒组成... 4 贮存条件... 4 产品介绍... 4 基本原理... 5 重要提示... 5 样品处理... 6 需准备的试剂和溶液... 6 载体 RNA... 6 载体 RNA 的制备... 7 载体 RNA 需要量的计算... 7 内部对照... 8 所需额外试剂和仪器... 8 实验方案... 8 问题解决参考文献

4 试剂盒组成 GeneJET 病毒 DNA 和 RNA 纯化试剂盒 #K preps 柱预洗液 ( 红色瓶盖 ) 2 x 1.4 ml 裂解液 * 12 ml 漂洗缓冲液 Ⅰ( 浓缩 )* 25 ml 漂洗缓冲液 Ⅱ( 浓缩 ) 11 ml 洗脱液 ( 白色瓶盖 ) 3 x 1.25 ml 蛋白酶 K( 绿色瓶盖 ) 2 x 1.3 ml 载体 RNA, 干粉 ( 蓝色瓶盖 ) 1 小瓶预装有收集管的纯化柱 50 收集管 (2 ml) 4x 50 手册 1 * 含有胍盐酸盐 ( 盐酸胍 ) 贮存条件收到试剂盒后, 将载体 RNA 从包装中取出, 装入新的铝袋中, 贮存于 -20 试剂盒的其它组分应在室温条件下 (15-25 ) 贮存所有组分在所标注的失效日期前都是稳定的漂洗缓冲液 Ⅰ 与漂洗缓冲液 Ⅱ 在加入乙醇后, 直到所标注的失效日期前都是稳定的产品介绍 GeneJET TM 病毒 DNA 和 RNA 纯化试剂盒是一个简单高效的纯化系统, 可从多种人或动物的液体样品, 如血浆血清全血唾液鼻腔与口腔尿液 ( 纯化前应收集细胞 ) 泌尿生殖道拭子和乳汁中提纯高质量的病毒核酸试剂盒中方便离心柱采用了基于硅膜的技术裂解样品中的核酸结合到离心柱的膜上, 同时杂质通过随后的漂洗和离心步骤得到有效去除最后即用型核酸从离心柱中洗脱下来经纯化后的病毒核酸不含蛋白质核酸酶以及其他污染物或下游反应的抑制剂纯化分离的 DNA 和 RNA 能够直接用于 PCR qpcr 或其他基于核酸的实验鉴于纯化柱中硅膜的高载量 ( 最多为 50 μl), 由含有细胞的液体样品中共纯化出的宿主基因组 DNA 或 RNA 一般并不影响病毒核酸的产量为尽可能地减小结果的不一致性, 在样品准备扩增和检测的整个过程中, 该产品须使用适当的内部对照, 如阳性对照和阴性对照 4

5 基本原理 GeneJET 病毒 DNA 和 RNA 纯化试剂盒采用已成熟建立的核酸分离和纯化技术, 由如下步骤组成 : 样品裂解 1 在高温下 (56 ) 的变性条件下, 样品通过与裂解液和蛋白酶 K 孵育而被裂解裂解液和蛋白酶 K 使 RNA 酶和 DNA 酶都失活, 从而保护病毒核酸不被降解病毒核酸结合于纯化柱膜上 2 裂解后的样品被转移至纯化柱中在离液盐盐存在的条件下, 被释放出的病毒核酸立即结合到硅基质滤膜上残余的裂解物通过离心被去除去除残余杂质 3 残余的杂质通过使用漂洗缓冲液 1 和漂洗缓冲液 2 的 3 次漂洗步骤而被去除, 而被纯化的核酸继续结合在膜上洗脱纯化的病毒核酸 4 使用洗脱液可以将纯化后的病毒核酸从纯化柱的滤膜上释放出来纯化得到的核酸即可用于之后的下游反应中重要提示确保试剂盒组分在运输过程中的完整性如遇损坏, 请联系技术支持或当地经销商请勿使用已损坏的试剂盒组分裂解液和漂洗缓冲液 1 含有刺激性物质当处理这些试剂时, 始终佩带手套, 并依据标准安全预防措施更多信息请参阅安全信息 ( 第 13 页 ) 和物料安全数据单所有样品材料和废物均应被视作具有潜在的传染性当处理样品和废物时应佩戴合适的防护器具避免任何皮肤或眼睛的接触! 条件允许的话, 始终在有流通空气的环境下工作, 直至样品被裂解实验流程结束后, 彻底将所有工作表面消毒遵循当地建议的废物处理措施为避免交叉污染, 请采用下列步骤 : 更换转移的液体时同时更换枪头 ( 推荐使用带滤芯枪头 ); 每次只打开一个离心管 ; 使用一次性手套并丢弃被污染的手套始终使用无 RNA 酶器具当开始一个新的提取操作时, 只使用新鲜配制的载体 RNA 和裂解液的混合液! 开始操作之前, 新的纯化柱必须经过预处理, 即向纯化柱膜的中央滴加 50 μl 的柱预洗液加入柱预洗液后请勿离心纯化柱 5

6 样品处理如果可能的话, 只使用新鲜的样品材料血浆血清和全血样品能够在 2-8 时最多贮存至 24 小时, 或在 -20 或 -70 中贮存更久的时间泌尿生殖道拭子能够在 2-8 时最多贮存至 48 小时如需更长时间的贮存, 细胞应通过离心收集后贮存于 -20 或 -70 鼻腔和口腔拭子能够在 2-8 室最多贮存至 48 小时尿液样品能够在 2-8 时最贮存至于 12 小时 ( 加入 0.5 M 的 EDTA 至终浓度为 50 mm), 或在 -20 或 -70 中贮存更久的时间 ( 细胞需通过离心收集 ) 对于病毒 RNA 的纯化, 推荐在收集样品后立即通过离心收集细胞避免超过一次以上冻融样品样品使用前应平衡至室温 (20 ± 5 ) 通过 3000 g 离心 5 分钟将血浆 / 血清样品中可能存在的沉淀清除使用 EDTA 或柠檬酸处理血浆样品试剂和溶液的制备首次使用前, 请加入指定量的乙醇 (96-100%) 到浓缩的漂洗缓冲液 1 和浓缩的漂洗缓冲液 2 中 : 浓缩的漂洗缓冲液乙醇 (96-100%) 总体积 #K0821, 50 preps 漂洗缓冲液 1 漂洗缓冲液 2 25 ml 11 ml 15 ml 44 ml 40 ml 55 ml 确保所有工作液是依据方案中的建议制备准备好各溶液后, 在瓶子上做好标记以提示此步骤已完成每次使用前检查试剂盒中所有溶液是否出现盐沉淀若出现盐沉淀, 将溶液置于 37 重新溶解, 之后平衡至室温 (20 ± 5 ) 对于拭子或收集的细胞, 用 PBS(137 mm NaCl,2.7 mm KCl,10 mm Na 2 HPO 4,2 mm KH 2 PO 4,pH 7.4) 调整细胞到推荐的样品体积整个实验流程中, 使用者有必要设置合适的对照载体 RNA 载体 RNA 的使用对于病毒核酸的高效复苏十分重要, 其原因可能有两个首先, 载体 RNA 可促进病毒核酸结合在硅膜上, 尤其是在样品中的病毒核酸分子数很少的情况下其次在当有少量活跃的 RNase 分子存在的不常见的情况下, 大量的载体 RNA 能够降低在高盐条件下病毒 RNA 被降解的概率如果裂解液中未加入载体 RNA, 病毒核酸的产量可能会减少 6

7 载体 RNA 的制备本试剂盒提供的载体 RNA 是以干粉形式贮存于防水铝袋中初次使用之前, 用 300 μl 的洗脱液溶解载体 RNA 将刚配制好的载体 RNA 溶液在室温下孵育 5 分钟, 之后将载体 RNA 混匀并短暂离心离心立即使用或冻存避免对重悬的载体 RNA 进行 10 次以上的反复冻融如果每次只处理少量样品, 将载体 RNA 溶液分装为 50 μl 的小份 ( 使用无核酸酶管 ) 后贮存于 -20 或 -70 所需载体 RNA 用量的计算每次新实验开始时, 始终使用新鲜配制的载体 RNA 与裂解液的混合液对于不同的样品量, 根据下表计算正确的载体 RNA 和裂解液用量向裂解液中补加相应量的载体 RNA, 并通过涡旋混合仪点触混匀或用移液器吹吸的方法混匀样品编号裂解液体积, ml 载体 RNA 体积, μl 样品编号裂解液体积, ml 载体 RNA 体积, μl 注 : 使用以下公式计算所需载体 RNA 的体积 : N 0.22 ml = Y ml Y ml 25 μl/ml = Z μl 在此 :N 被处理样本的数量 Y 计算得到的裂解液体积 Z 加入到 Y ml 裂解液中的载体 RNA 体积 7

8 内部对照整个提取和纯化过程中内部对照的存在对于特定的实验可能是必须的请参考下游的检测分析实验所附带的用户手册中有关内部对照使用的指导所需额外试剂和仪器吸液枪和无菌无核酸酶且带滤芯的枪头涡旋仪乙醇 (96-100%) 离心机热混合仪一次性手套量筒无核酸酶的离心管, 其容量应适合制备载体 RNA 和裂解液的混合物量用以样品裂解和洗脱的离心管 RNA 洗脱时应选用无 RNA 酶的离心管实验方案开始之前参阅用户手册, 确保所有操作均按照指示进行确保所有工作液和样品依据建议制备 ( 第 6 7 页 ) 确保实验流程开始前, 所有必须的仪器和额外材料是可使用的 ( 第 8 页 ) 实验流程开始前, 对潜在的传染性废物准备适宜的处理方法由于可能接触到潜在的传染性材料, 实验过程应依据建议的安全指导整个过程必须谨慎小心所有离心操作必须全部在室温下进行 A 病毒核酸纯化标准方案此方案针对经 200 μl 的 EDTA 或柠檬酸处理的血浆血清全血或乳汁样品中纯化病毒 DNA 和 RNA 对于其它样品类型请参阅附加的方案( 第 10 页 ) 下述流程针对的是单一样品的处理指导当使用多于 200 μl( 最多 400 μl) 的样品体积时请参阅方案 E( 第 11 页 ) 步骤过程加入 50 μl 柱预洗液于纯化柱膜的中央, 使膜全部浸湿注流程开始之前, 每一个纯化柱必须经过柱预洗液的预处理对纯化柱的处 1 理能够最大化核酸与膜的结合, 从而得到更一致的产量请勿将已经过预处理的纯化柱离心经过预处理的纯化柱在处理样品之前, 须在室温下贮存 8

9 将 200 μl 的样品置于一个 1.5 ml 的空裂解管中加入 200 μl 的裂解液 ( 已补加载体 RNA) 和 50 μl 蛋白酶 K 溶液, 通过涡旋或移液器吹吸彻底混匀将样本置于 56 的热混合仪上孵育 15 分钟保持热混合仪打开以备在后续操作步骤过程中, 预热洗脱液使用注使用裂解液前须加入载体 RNA( 第 6 页 )! 根据下游实验使用手册所需设置合适的内部对照请勿直接将内部对照加入血浆样品中请勿直接将蛋白酶 K 加入裂解液中加入 300 μl 乙醇 (96-100%), 通过涡旋或移液器吹吸混合均匀将样品在室温下孵育 3 分钟以最大速度离心 3-5 秒, 以收集盖子内部的液滴将纯化柱装入收集管中, 然后将裂解溶液转移至已准备好的纯化柱上将纯化柱以 6000 g 的速度离心 1 分钟弃掉包含流穿液的收集管将纯化柱放入一个新的 2 ml 收集管中注确保新的纯化柱是按步骤 1 所描述的情况准备的! 向纯化柱中加入 700 μl 的漂洗缓冲液 Ⅰ( 已加入乙醇 ) 将纯化柱以 6000 g 离心 1 分钟弃掉包含流穿液的收集管将纯化柱放入一个新的 2 ml 收集管中注初次使用之前, 向浓缩的漂洗缓冲液 Ⅰ 中加入乙醇 ( 第 6 页 )! 向纯化柱中加入 500 μl 的漂洗缓冲液 Ⅱ( 已加入乙醇 ) 将纯化柱以 6000 g 离心 1 分钟弃掉包含流穿液的收集管将纯化柱放入一个新的 2 ml 收集管中注初次使用之前, 向浓缩的漂洗缓冲液 Ⅱ 中加入乙醇 ( 第 6 页 )! 向纯化柱中加入 500 μl 的漂洗缓冲液 Ⅱ( 已加入乙醇 ) 将纯化柱以 6000 g 离心 1 分钟弃掉包含流穿液的收集管将纯化柱放入一个新的 2 ml 收集管中将纯化柱以 g 离心 3 分钟弃掉包含剩余流穿液的收集管将纯化柱放入一个新的 1.5 ml 洗脱管中向纯化柱的膜中心加入 50 μl 在 56 预热的洗脱缓冲液在室温下孵育 2 分钟将纯化柱以 g 的速度离心 1 分钟弃掉洗脱管中的纯化柱注 : 使用少量的洗脱液 (30-40 μl) 能够得到高浓度洗脱的核酸也可使用更大体积的洗脱液 ( 最多 100 μl), 但可能得到稀释的病毒核酸样品 9

10 10 妥善保管装有纯化的病毒核酸的洗脱管立即使用纯化后的核酸, 或者贮存于 -20 或 -70 注洗脱过程中若使用少于 50 μl 的洗脱液, 可能会存在抑制 qpcr 和 RT-PCR 反应的情况对于进一步的下游 qpcr 实验, 每 25 μl 的反应体系使用 1-10 μl 的病毒 DNA 对于反转录实验(RT), 每 20 μl 的 cdna 合成反应体系使用 1-10 μl 的病毒 RNA B 鼻腔和口腔拭子的病毒核酸纯化方案步骤过程 1 为收集样品, 用拭子在口腔或鼻子内壁来回刮拭 5-6 次 2 将拭子在 200 μl 的 1 PBS 或 TE 溶液中来回搅拌涡旋 2-3 分钟 3 转到标准病毒核酸纯化方案的步骤 1( 第 8 页 ) C 尿液中病毒核酸的纯化方案步骤过程向 4.5 ml 尿液中加入 0.5 ml 的 0.5M EDTA( 终浓度为 50 mm) 1 注 : 尿液样品可能含有不可溶的盐沉淀, 从而导致核酸产量降低因此限制纯化所用样品的体积 2 以 800 g (~3000 rpm) 的速度离心 10 分钟 3 弃上清 4 用 200 μl 的 1 PBS 重悬细胞团转到标准病毒核酸纯化方案的步骤 1( 第 8 页 ) 5 注. 不推荐 4.5 ml 以上的尿液样品 D 唾液中病毒核酸的纯化方案步骤过程 1 为收集细胞, 以 3000 g 的速度将唾液样品离心 5 分钟 2 用 200 μl 的 1 PBS 或 TE 溶液重悬细胞 3 转到标准病毒核酸纯化方案的步骤 1( 第 8 页 ) 10

11 E 大量样品( 最多 400 μl) 中的病毒核酸纯化方案重要 : 裂解液和乙醇是仅有的需要按比例增加用量的组分步骤过程加入 50 μl 柱预洗液于纯化柱膜的中央, 使膜全部浸湿注流程开始之前, 每一个纯化柱必须经过柱预洗液的预处理对纯化柱的处 1 理能够最大化核酸与膜的结合, 从而得到更一致的产量请勿将已经过预处理的纯化柱离心经过预处理的纯化柱在处理样品之前, 须在室温下贮存将 200 μl 的样品置于一个 2.0 ml 的空裂解管中加入等体积 (1:1) 的裂解液 ( 已补加载体 RNA) 和 50 μl 蛋白酶 K 溶液, 通过涡旋或移液器吹吸彻底混匀将样本置于 56 的热混合仪上孵育 15 分钟保持热混合仪打开以备在后续操作步骤过程中预热洗脱液使用 2 最大速度离心 3-5 秒以收集盖子内部的样品溶液注使用裂解液前须加入载体 RNA( 第 6 页 )! 根据下游实验使用手册所需设置合适的内部对照请勿直接将内部对照加入血浆样品中请勿直接将蛋白酶 K 加入裂解液中加入乙醇 (96-100%), 每 100 初始样品体积加入 150 μl 的乙醇通过涡旋或移液器吹吸混合均匀 3 将样品在室温下孵育 3 分钟最大速度离心 3-5 秒以收集盖子内部的液滴将纯化柱装入收集管中, 然后将裂解溶液转移至已准备好的纯化柱中请勿向纯化柱汇总加入多于 700 μl 的裂解液 ( 对于更大的体积, 将剩余的裂 4 解液加入同样的纯化柱中, 并再次离心 ) 将纯化柱以 6000 g 的速度离心 1 分钟弃掉流穿液将纯化柱放入一个新的 2 ml 收集管中 5 转到标准病毒核酸纯化方案的步骤 1( 第 8 页 ) 11

12 问题解决问题纯化的 DNA 产量低纯化柱堵塞 RNA 降解可能的原因及解决方案离心柱未预处理确保离心柱使用第 8 页描述的通过加入柱预洗液的方法准备裂解液中未加入乙醇在将样品加入纯化柱前, 确保向裂解液中加入乙醇漂洗缓冲液 Ⅰ 和 Ⅱ 中未加入乙醇确保漂洗缓冲液 Ⅰ 和 Ⅱ 在初次使用前已加入乙醇使用了低浓度的乙醇只能使用 % 的乙醇请勿使用已变性或 95% 的乙醇裂解液中未加入载体 RNA 如第 7 页所述, 用洗脱液溶解载体 RNA, 并与裂解液混合载体 RNA 降解请勿将重组的载体 RNA 反复冻融 10 次以上将其储存于 -20 到 -70 温度条件下病毒核酸洗脱液过稀按照推荐, 使用 μl 洗脱液不合适的洗脱条件按照第 9 页的描述, 将预热的洗脱液加入到离心柱膜中心起始材料未彻底裂解减少起始样品材料的量, 并延长裂解时间沉淀未被除尽当使用血浆样品时, 通过 3000 g 离心 5 分钟去除可见的冷沉淀物 RNase 污染为避免 RNase 污染, 整个操作过程须佩戴手套, 并且时常更换新手套使用无菌的无 RNase 的一次性枪头清除非一次性物品和工作环境表面的 RNase 污染样品质量不高始终使用新鲜的样品或按照第 6 页建议所处理的样品裂解步骤中, 快速处理样品以避免降解 12

13 安全信息裂解液 Xn 有害辨别危险的成分标签 : 盐酸胍风险术语 R22 吞食有害 R38 对皮肤有刺激性 R41 可能会对眼睛造成严重损害 R52/53 对水生生物有害, 在水生环境中可能造成长期的不利影响安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S36/37/39 穿戴合适的防护服, 手套以及眼睛 / 面部防护措施 S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 S61 避免释放入环境中可参考特殊指导 / 安全数据页漂洗缓冲液 Ⅰ Xn 有害辨别危险的成分标签 : 盐酸胍风险术语 R22 吞食有害 R36/38 对眼睛和皮肤具有刺激性安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S36/37 穿戴合适的防护服和手套 S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 13

14 蛋白酶 K Xn 有害辨别危险的成分标签 : 蛋白酶, 白色念球菌丝氨酸风险术语 R42 吞食有害安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S36 穿戴合适的防护服 S45 发生事故时或感觉不适时, 立即求医 ( 可能时出示标签 ) S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置参考文献 1. Boom, R., C.J.A. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E.W. Dillen, and J. van der Noordaa Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28: 产品使用限制本产品的开发设计及销售专供研究和体外试验使用本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 Thermo Fisher Scientific 公司, 版权所有所有商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有 14

分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci

分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci 产品信息 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒 #K0502, #K0503 批号有效期 www.thermoscientific.com/fermentas 1 分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测,