,2018,38(3): 犃犮狋犪犅狅狋. 犅狅狉犲犪犾. 犗犮犮犻犱犲狀狋. 犛犻狀. : (2018) 犱狅犻 : /j.issn " 犆犻犆犎犛 #$%&' ()*+,- 1,2,3

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1 ,2018,38(3): 犃犮狋犪犅狅狋. 犅狅狉犲犪犾. 犗犮犮犻犱犲狀狋. 犛犻狀. : (2018) 犱狅犻 : /j.issn " 犆犻犆犎犛 #$%&' ()*+,- 1,2,3, 1, 1, 1,3, 1,3 (1 :;,, <010018;2 :; <010018;3 AB,C,DE, <010018). /: *+ FGHIJKLMNO ( 犆犻犆犎犛 ) P Q, R S T U 狋 4V W X,Y qrt PCR F STUG 犃狋犆犎犛 L,Y Z Z [ \ ] F S T U L ^ _ O ` a b c DPPH,Y HPLC \ F S T U L c :(1) S T U G, 犃狋犆犎犛 L Q,RL,^_Oc Q,R;HPLC G c Q,R; C STUG ` a b Q, R (2) DPPH Q,R (3) 犆犻犆犎犛 S T U 狋 4 V W X, L * +,GHIJK 犆犻犆犎犛, F, L, F 狋 4VWXL 01 :GHIJK;MNO ; ; STU, :Q786;Q789 23:A 犕犲狋犪犫狅犾犻狊犿狅犳犉犾犪狏狅狀狅犻犱狊犪狀犱狋犺犲犃狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犆犪狆犪犮犻狋狔狅犳犜狉犪狀狊犵犲狀犻犮犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪犈狓狆狉犲狊犻狀犵犆犻犆犎犛犌犲狀犲 YANGFeiyun 1,2,3,LIU Kun 1,CUIShuang 1,WANG Ruigang 1,3,LIGuojing 1,3 (1ColegeofLifeSciences,Inner Mongolia AgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;2 ColegeofFoodScienceand Engineering,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;3InnerMongoliaKeyLaboratoryofPlantStress Physiologyand MolecularBiology,Hohhot010018,China) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Chalconesynthase(CHS)isakeyandrate limitingenzymethatcatalyzesthefirststepinthefla vonoidbiosyntheticpathway.duetotheimportanceofthesecompounds,chalconesynthasegeneof 犆犪狉犪 犵犪狀犪犻狀狋犲狉犿犲犱犻犪 hasbeenclonedandtransferredinto 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 andmutant 狋 4anditsfunction wasanalyzed.expressionof 犃狋犆犎犛 geneintransgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 wasdetectedbyqrt PCR.Thetotal flavonoidsandmalondialdehyde(mda)contents,dpphfreeradicalscavengingabilityoftransgenic 犃狉犪 犫犻犱狅狆狊犻狊 wereanalyzedbyspectrophotometricmethod.thecontentofnaringinintransgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 wasdetectedbyhplcmethod.theresultsshowedthat:(1)theexpressionof 犃狋犆犎犛 geneintransgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 wasapproximately1/10ofwildtype.totalflavonoidsexperimentalresultsshowedthatthe totalflavonoidscontentofthetransgeniclineswassignificantlyhigherthanthatofwildtype.thenaringin : ; : : ( ); (2017MS0354);!"#$%&'( )!: (1979-),, ()*+,,-./,01,,*+ E mail:yangfeiyun@imau.edu.cn 2345:67,./,(),89,01,,*+ E mail:liguojing@imau.edu.cn

2 contentintransgenicplantswhichwashigherthanthatofthewildtype.accumulationofmdabeforeand afteruvtreatmentintransgenicplantswassignificantlylessthanthatofwildtype.(2)dpphfreeradi calscavengingabilityoftransgenicplantsextractionwassignificantlyhigherthanthatofwildtype.(3) Thetestaoftransgenicplantswhich 犆犻犆犎犛 genewascomplementaryto 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 mutant 狋 4presented alightbrowncolor.takentogether,theseresultsindicatedthattheantioxidantactivityoftransgenic plantswasenhancedwiththeexpressionof 犆犻犆犎犛 gene. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : 犆犪狉犪犵犪狀犪犻狀狋犲狉犿犲犱犻犪 ;chalconesynthase(chs);naringin;transgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 _O (flavonoids) GL, L, D14Y [1],,, D1L Y [2], 5L [D _O `,, X ` `a A, PAL C4H 4CL CHS CHI L _O [3]!"# _O L, $%&' [4 7] MNO (CHS) _ O L,( *+ L )*L _O L +,D1,- [8] 01 P 1 G D14Y [9] 2,CHS _ O, & 3 4 L * + 5E ,Kreuzaler [10] 2 UV ( 犘犲狋狉狅狊犲犾犻狀狌犿犺狅狉狋犲狀狊犲 ): ; F 犆犎犛 ;Reimold [11] F 8 9 L 犆犎犛 < ]F L G 犆犎犛 $%F A ] ,Li [12] B S T U ( 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 )L 犆犎犛 VWX CDE 20096,Li [13] L*+ F CHS A `a A, MNO L F Jigyasa [14] G HI< JK L RNA M N F ( 犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓 ) GL 犆犎犛 O 8 _ ,Chen [15] P ( 犖犻犮狅狋犻 犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿 L.)G Q R S ( 犈狌狆犪狋狅狉犻狌犿犪犱犲狀狅狆犺狅狉狌犿 ) 犈犪犆犎犛 1 T L _O c U ,Chen [16] F PL5 犆犎犛 $%FA ] GHI J K ( 犆犪狉犪犵犪狀犪犻狀狋犲狉犿犲犱犻犪 ) I JKV, W X L Y Y Y A [17],0 1 A B [18],c,, G_O c F ] 0, Z,[\ L F,]*+^Y _ (` L M N O ( 犆犎犛 )a b = > c&, GHIJKMNO La b, RACE! < [19], F G H I J K 犆犻犆犎犛 X Q,RSTU, STUL $%F,*+ 犆犻犆犎犛 LA, $ ^Y C, 4 UV [\L0 L 1 \ GHIJK Q,RSTU Columbia 0, R(Col 0) AB,C,DE a STUVW X 狋 4(SALK_020583C) 9 * 狆犆犪狀犌 犆犻犆犎犛 4 5 : ; 犆犻犆犎犛 $ % [19],^ Y DNA (, ) L, P X peasy BluntSimpleG ( <, ), = G L = > 2 犛狆犲 I 犡犫犪 I(Thermo ) P CaMV35S L X pcang HA G,$ % PCR G, G LDH : GV3101E,$% PCR PCR =,?, $%& ") <= >? Y \ DH XpCanG 犆犻犆犎犛 PQ,RST U [20], Y25mg/L T 3 ^ RNA,! cdna,2 Z PCR 犆犻犆犎犛 G L $% SYBRPremixEx 犜犪狇

3 3, : 犆犻犆犎犛 STUL_O ] 395 (TaKaRa ) 4,^Y LightCycler480 Z PCR (Roche )$ % X :SYBR PremixEx 犜犪狇 Ⅱ10μL, L cdna 5μL, 0.8μL(10μmol/ L),DEPC = :95 W 5 min,95 W 5s,60 30s,72 15s, 40 Y 犆犻犆犎犛 qf(5 CGCAGAC TATTCTCCCCGATTC 3 ) 犆犻犆犎犛 qr(5 CCTC CACCAAACTCTTCTCAATGT 3 ), / At EF1α F(5 AGAAGGGTGCCAAATGATGAG 3 ) At EF1α R (5 GGAGGGAGAGAGAAAGTCA CAGA 3 ), 2 -ΔCt \&, 3 "# L R " #$%& 犃狋犆犎犛 :;@'AB T 3 ^ RNA,! cdna,2 Z PCR STUL 犃狋犆犎犛 (At5g13930) GL $% \ X 犆犻犆犎犛 L Y 犃狋犆犎犛 qf(5 GGTGCCATAGACGGACATT 3 ) 犃狋犆犎犛 qr (5 TCCATACTCGCTCAACACG 3 ), / AtEF1α F AtEF1α R, 2 -ΔCt \& " #$%&C D@AB Y \$%^_OL [21] C, (22,16hZ /8h)4 LSTU0,Y * ^_OL :70% ; 1 20;![60,A" 160 W,70min; C #24h 0.8 ml,u 5% Na 2NO ml,$ % & ' 6 min;u10% Al(NO 3 ) mL,$% &' 6 min;u 4% NaOH 0.8 ml ddh 2O 0.24 ml,$% &'15min 8000r/min 10min,, Y Z Z [ & 510nm Z,Y70% & " #$%&E D@AB > C ^_O L C \ Y \(HPLC)$% c L ( ( LC 20AT ) : ) Unitary C 18 ( mm,5μm);* :"(A) (B) (60 40,V/V);* 0.8 ml/min; nm;$ X 10μL, >-./ " #$%& D@AB C, 4 L R S T U LuxL 25cm 1h,! G 24h C, C L S T U 0,Y * `ab(mda)c -T,?@*+, \ $% 犇犘犘犎 9AB" #$%& ()F G C, 4 L S T U 0,Y * 1 20UP95% 0.1% (3 2,V/V)L H30min,![60,A"160 W C 24h,5000r/min 10 min, Y DPPH(1,1 a 2 2) 3 Thaiponga [22] L \$%4W 5 :1 > DPPH (0.1 mmol/l);2 > ;3 DPPH (0.1mmol/L) 0.75mL 2mLEppendorf 6G,7% 8Z 90 min G c 9 :, + 517nm 5 > Z[ 犃 i( > DPPH L Z ) 犃 ( > L Z ) j 犃 0( DPPH L Z ) > & STU DPPH L ": "(%)=[1-( 犃 i- 犃 )/ j 犃 0] 100% $%&HI 狋 4 'JKLM Y \ DH X pcang 犆犻犆犎犛 P S T U 狋 4 VWX, L c 25mg/L L1/2 MS T 3 ^ RNA,! cdna,^y< 犆犻犆犎犛 F 犆犻犆犎犛 R $ % PCR L $% 2 ] 2.1 狆犆犪狀犌 犆犻犆犎犛 45:; " #< = 4NO ^Y PCR [ 1173bp L 犆犻犆犎犛 (; 1,A), peasy BluntSimple XG, = Y 犛狆犲 I 犡犫犪 I pcang HA X X L D H X pcang 犆犻犆犎犛 $ % PCR G(;1,B), G L Y 犛狆犲 I 犡犫犪 I, L, X A(;1,C), XL X; ;1,D 2: 8L \ DH X

4 M.DL2000;A. 犆犻犆犎犛 L ORF;B.pCanG 犆犻犆犎犛 L PCR :1~10. L< ;C.pCanG 犆犻犆犎犛 L G: 1.9 X ;2.pCanG 犆犻犆犎犛 = 犛狆犲 Ⅰ 犡犫犪 Ⅰ ;D. X; ;1 pcang 犆犻犆犎犛 XL M.DL2000;A.TheORFof 犆犻犆犎犛 ;B.IdentificationofpCanG 犆犻犆犎犛 bypcr:1-10.randomsinglecolony;c.identification ofpcang 犆犻犆犎犛 digestedbyrestrictionenzyme:1.vectorcontrol;2.digestionproductby 犛狆犲 Ⅰ and 犡犫犪 Ⅰ; D.SchematicrepresentationoftheexpressionvectorpCanG 犆犻犆犎犛 Fig.1 TheconstructionandidentificationofpCanG 犆犻犆犎犛 recombinantvector pcang 犆犻犆犎犛 P Q, R S T U, L X 6, L RNA cdna,^y< 犆犻犆犎犛 F 犆犻犆犎犛 R $ % RT PCR > ; 2,A, Q,RSTUcDNA LA, GHIJKcDNA 4 LA, 6 G B L A, 犆犻犆犎犛 GB ^ Y Z PCR 犆犻犆犎犛 GL "#(;2,B), L3 OE 14 OE 15 OE 20$ R 2.2 " #$%& 犃狋犆犎犛 :;@'I) C*+, 犆犎犛 T 犆犎犛 DE ]* + 犆犻犆犎犛 L3 OE 14 OE 15 OE 20L RNA cdna,^y Z PCR 犃狋犆犎犛 G L " #(;3) ;3,3 G 犃狋犆犎犛 L B D E Q, R L, 犆犻犆犎犛 S T U G L F F S T U 犃狋犆犎犛 L 2.3 " #$%&C D@'I) \L X 3 FFG,H I(;4,A),HIT`,FG J[ 狓 2 Z 狔 L : 狔 = 狓 ,( 犚 = ), FGJ[ 0~0.07mg/mL A. 犆犻犆犎犛 L PCR :M.DL2000;Col 0.? (Q,RSTUcDNA);Ci. (GHIJKcDNA); OE 14 OE 15 OE 20 OE 23 OE 29 OE 31. 犆犻犆犎犛 ;B. 犆犻犆犎犛 LqRT PCR ;2 犆犻犆犎犛 "# A.RT PCRidentificationof 犆犻犆犎犛 transgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines: M.DL2000;Col 0.Negativecontrol(wildtype 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 cdna);ci.positivecontrol( 犆犪狉犪犵犪狀犪犻狀狋犲狉犿犲犱犻犪 cdna); OE 14,OE 15,OE 20,OE 23,OE 29andOE 31.Transgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines;b.quantitativereal timepcranalysisof 犆犻犆犎犛 expressionin 犆犻犆犎犛 transgeniclines Fig.2 Identificationandexpressionanalysisof 犆犻犆犎犛 intransgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊

5 3, : 犆犻犆犎犛 STUL_O ] 397 K,HII WX 2 \$% S TU^_Oc L,^Y L ^_OLc (;4,B) ^_OLc B Q,R, ;3 犃狋犆犎犛 "# Fig.3 Expressionanalysisof 犃狋犆犎犛 in transgenic 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 L "# 2.2 L T, 犆犻犆犎犛 T S T U G ^ _ O c U 2.4 犎犘犔犆 9AB" #$%&E D@ >L C1MF >, 1.2.5L STUL c $%, >L ;5 >L ;T N, 2 L O, 2 FL, H I : 狔 = ,( 犚 2 = ), J [ 0~200μg/mL L K,HII WX ^YO \& STU L c, 1 & T `, STU c B Q,R, 犆犻犆犎犛 UFSTUG Lc A.FG,HI;B.STU ^_Oc ; L ( 犘 <0.01), ;4 Q,R 犆犻犆犎犛 STU^_Oc A.Thestandardcurveofrutin;B.Thecontentoftotalflavonoidsindiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines; indicatessignificantdiferenceamongsamplesat0.01level,thesameasbelow Fig.4 Thecontentoftotalflavonoidsindiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines A.,> ;;B.STU ;:WT. I;OE 14. I;OE 15.P I;OE 20.Q I ;5 STU A.Standardsample;B.Thenaringinchromatogram mapofdiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines:wt.blackline; OE 14.Pinkline;OE 15.Blueline;OE 20.Redline Fig.5 Thenaringinchromatogramresultofdiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines

6 P" #$%& 犕犇犃 ' QR C*+ Z,[\ C+ U G_O, L, DE Z,[\ LRS ]*+ T C C L > $ % MDA c, >;6,T LQ,R STUG MDA c L, C Q,R S T U G MDA c B U, U Lc BE Q,R, :1 " #STUV$%&E D@ Table1 Thenaringincontentofdiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines Line c Content/( μ g/g) WT 12.6 OE OE OE Q,RL L 犆犻犆犎犛 V F [\ C STUX MDA L,, DE Y S 2.6 犇犘犘犎 9AB" #$%& ()FG 1.2.7L 3 F DPPH,HI(;7, A), H I T `, Z 狔 DPPH J [ 狓 L : 狔 = 狓 ,( 犚 2 =0.9999), DPPH J[ 0~0.10mmol/L L K,HI I W X 2 \ $ % S T U DPPH L ",^ Y L DPPH L ", ;7,B 3 DPPH Q,R 犆犻犆犎犛 UFSTU DPPH L, "# 2.7 犆犻犆犎犛 # W, X Y $ % & H I 狋 4 ' :V STU 狋 4 V W X 犃狋犆犎犛 L 8 [23] ]*+ 犆犻犆犎犛 P 狋 4 VW X, T 3 狋 4 WT $% (;8), L, F 狋 4 L R, 犆犻犆犎犛 STUGT / _O,$% L, STU ;6 C STUQ,R MDA c W Fig.6 ThecontentofMDAindiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines ;8 犆犻犆犎犛 狋 4VWXL R Fig.8 Complementaryresultsof 狋 4mutant A.DPPH,HI;B. DPPH " ;7 Q,R STU DPPH L " A.ThestandardcurveofDPPH;B.ThescavengingrateofDPPHradicalofdiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines Fig.7 ThescavengingrateofDPPHradicalofdiferent 犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 lines

7 3, : 犆犻犆犎犛 STUL_O ] MNO 4 _O L, _O L, Z 4Y _O GL,, L [ _O L _O L'F, Z R X _O c UT UV RS [9] L \ F, 犆犎犛 T 犆犎犛 DE, 犆犎犛 +, - > Van L*+, 犇犉犚 犆犎犛 P]^_ ( 犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪 ), ` L +, W, L a +DE, G 犇犉犚 犆犎犛 L DE [24],?@ CBF G 犆犎犛 L\ F ]*+ F S T U G 犃狋犆犎犛 L, G 犃狋犆犎犛 L b Q,R L, S T U G 犆犻犆犎犛 F F 犃狋犆犎犛 L U 犆犻犆犎犛 L, 3 L^_ Oc B Q,R, c Q,R U *+, 犆犎犛 T L [ \ C 7 8, > C RS c,, 8 _O c L U, [9] Kim [25] B Z F G_O L, _ O L78 Jaakola [26] BFZ T $ 犆犎犛 _O, L, 78 _O c L `ab W RS LD1,2 `ablc T WL R@[ [27] ]*+,3 L`ab c C B E Q, R, 犆犻犆犎犛, STUL`ab, _O, 2 L F L RS L, ^ U L[\,>DE L S [28] ] * + 3 DPPH L B Q,R,( STUG 22 (transparenttesta,t) E,, G _O L, L, RL_ STU 犆犎犛 VW= 8 L 狋 4 E 4 STU L01 R G 4 Y, F G 犆犎犛 L F L, STUL, _ [23] Sun [29] * + G Y S ( 犉狉犲犲狊犻犪犺狔犫狉犻犱犪 )L 犉犺犆犎犛 1 FSTUL 狋 4 VWX, ] F L ]*+ 犆犻犆犎犛 PSTU 狋 4VWX, T3 L,, 犆犻犆犎犛 VWXGT, L, U Q,RL,T 犆犻犆犎犛 F 犃狋犆犎犛 L A, 5, F _ L_O 8, DE,a $ *+G : [1] MA D Y,SUN D X,WANG C Y, 犲狋犪犾.Expressionoffla vonoidbiosynthesisgenesand accumulation offlavonoidin wheatleavesinresponsetodroughtstress[j]. 犘犾犪狀狋犘犺狔狊犻狅犾 狅犵狔牔犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔,2014,(80): [2] SCHIJLENEG W M,RICCH,TUNENAJV, 犲狋犪犾.Modi ficationofflavonoidbiosynthesisincropplants[j]. 犘犺狔狋狅 犮犺犲犿犻狊狋狉狔,2004,65(19): [3] SHISG,YANG M,ZhANG M, 犲狋犪犾.Genome widetran scriptomeanalysisofgenesinvolvedinflavonoidbiosynthesis betweenredandwhitestrainsofmagnoliasprengeripamp[j]. 犅犕犆犌犲狀狅犿犻犮狊,2014,15(1):1 11. [4] SUZUKIK,TSUDAS,FUKUIY, 犲狋犪犾.Molecularcharac terizationofroseflavonoidbiosynthesisgenesandtheirappli cationin 犘犲狋狌狀犻犪 [J]. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔牔犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵犻犮犪犾犈狇狌犻狆犿犲狀狋,2000,14(2): [5] WAN H,ZHANGJ,SONG T T, 犲狋犪犾.Promotionoffla vonoidbiosynthesisinleavesandcaliofornamentalcrabapple ( 犕犪犾狌狊 sp.)byhighcarbontonitrogenratios[j]. 犉狉狅狀狋犻犲狉狊犻狀犘犾犪狀狋犛犮犻犲狀犮犲,2015,(6):673. [6] TAID Q,TIAN J,ZHANG J, 犲狋犪犾.A 犕犪犾狌狊 crabapple chalconesynthasegene, 犕犮犆犎犛,regulatesredpetalcolorand flavonoidbiosynthesis[j]. 犘犔狅犛犗狀犲,2014,9(10):e doi: /journal.pone

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