2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 物公司 NF?κB?seap 质粒 AP?1?seap 质粒由美国约翰霍普金斯大学免疫实验室赠与 pcdna?myd88, pcdna?myd88δ155?171?pcdna3.1/v5 质粒由本实验室构建 M

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(9):1~6 檪檪 研究报告 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 MyD88aa155?171 功能区缺失对免疫相关细胞共 刺激分子和细胞因子表达的影响 焦国慧代红胜张灼寒曾彬刘昱张园杨荣存 ( 南开大学医学院天津 ) 摘要利用重组 PCR 的方法, 克隆并构建 MyD88 和 MyD88aa155?171 功能区缺失 (MyD88Δ155? 171) 载体, 转染免疫相关细胞并筛选获得稳定细胞系 报告基因实验结果显示 MyD88MyD88Δ155?171 功能区缺失能够抑制转录因子 NF?κB 和 AP?1 的活性, 在不同 Tol 样受体 (TLR) 配体刺激后, 转染 MyD88Δ155?171 的细胞表面分子的表达低于 MyD88 正常表达的细胞, 并且抑制表面分子 CD86 和 B7H1 在 TLR 配体刺激后的上调 同时, 多细胞因子分析系统的检测结果表明, 给予 TLR 配体刺激之后,MyD88 -/- 树突细胞表达低水平的细胞因子, 转染 MyD88 可以使细胞因子表达明显增加, 而仅表达 MyD88Δ155?171 可以明显影响 IL?12,IFN?γ 的表达 以上结果表明 MyD88 功能区缺失影响免疫相关细胞表面分子和细胞因子的表达及 Tol 样受体信号的传递, 其在细胞内信号系统的具体作用机制还需进一步证实 关键词免疫调节 MyD88 缺失突变树突细胞中图分类号 R 目前研究发现, 固有免疫可以为适应性免疫的激活提供重要的信号, 而触发固有免疫系统的各种病原可以通过模式识别受体 Tol 样受体 (TLR), 激活细胞内的一系列信号转导通路 TLR 识别病原相关分子 (PAMPs), 接头分子 MyD88 结合到 TLR 的 TIR 结构域上, 触发了细胞内 IL?1 受体家族的级联反应, 包括 NF?κB 和 MAPK 的激活, 导致促炎因子如 IFN?α,IL?6 和 TNF?α 的产生 [1] MyD88 包括 N 端结构域 (DD) 和 C 端结构域 (TIR), 其通过结合到 IL?1R 相关激酶 (IRAK?1) 触发磷酸化激活一系列的信号通路以及转录因子 NF?κB 缺失 DD 和 TIR 结构域的中间区域将会抑制 IL?1/LPS 诱导的 NF?κB 激活 [2] 研究表明,MyD88 的不同剪接模式可以改变其对 TLR/IL?1R 的影响, 进而影响 NF?κB 及依赖其激活而产 收稿日期 : 修回日期 : 国家 863 计划 (2006AA020502) 国家自然科学基金 ( ) 国家科技部基金 (06C ) 天津市科委基金 (07JCZDJC03300,06ZHCXSH04800) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :ryang@nankai.edu.cn 生的细胞因子的表达 [3] MyD88 蛋白包括 N 端的死亡结构域 (DD) 和 C 端的 TIR 结构域, 后者包含三个高度保守的基序 (motif), Box1,2 和 3 [2], 在信号传递和诱导树突细胞分化方面有重要功能 因此认为 MyD88 的高保留区对免疫功能的调节有重要作用 为进一步阐述相关功能区在免疫相关细胞中的调节作用, 我们用重组方法获得 MyD88 TIR 结构域 aa155?171 功能区突变的 MyD88Δ155?171 分子, 在此基础上进行构建载体并转染细胞, 探讨了 TIR 内 aa151?171 功能区对 TLR 配体刺激转染细胞的免疫活性及相关分子表达的影响 1 材料与方法 1.1 材料小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 细胞购自美国 ATCC 公司,Trypsin 胰酶 (Lot:AMG16843),PRMI?1640 为 HyClone 公司产品 类标准胎牛血清购自兰州民海生

2 2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 物公司 NF?κB?seap 质粒 AP?1?seap 质粒由美国约翰霍普金斯大学免疫实验室赠与 pcdna?myd88, pcdna?myd88δ155?171?pcdna3.1/v5 质粒由本实验室构建 MyD88 稳定转染 RAW264.7 细胞系为本实验室构建 pcdna3.1/v5?his TOPO TAExpresion 试剂盒 LipofectaminTM2000 SuperScriptOne?StepRT? PCRwithPlatinum Taq OPTI?MEM I 无血清培养基购自 Invitrogen 公司 ;PCR 缓冲液 dntps Taq AgaroseGelDNA 纯化试剂盒购自 TaKaRa 公司 RNA Trizol 试剂购自北京鼎国公司 GreatEscAPeTM SEAP 购自 Clontech 公司 1.2 方法 引物通过计算机程序预测 MyD88 功能区位置 (htp://motif.genome. jp), 并根据 GenBank 中 MyD88cDNA 序列设计一对扩增去除 aa155?171 功能区 ( 包含 IPB000157D) 的突变 MyD88DNA 片段的引物 IF:5?atgtctgcgggagacccccgcgtg?3,IR:5?gggcagggacaaa gcctggcaaggcgg?3 设计突变功能区互补的引物序列: 5?caccaccctgatgaccccctaatcgagtgtgcagga?3,5?gtggtggga actactgggggatagctcaaacacgtcct? MyD88Δ155?171 质粒载体构建和稳定转染细胞系建立采用上述引物利用重组 PCR 扩增突变 MyD88DNA 片段, 回收纯化, 连接到表达质粒 pcdna3.1/v5?histopota 表达载体中,DNA 测序鉴定功能区突变 培养 RAW264.7 细胞, 利用 Invitrogen Lipofectamin TM 2000 转染质粒载体,24h 后用 400mg/L 浓度的 G418 和 100ml/L 血清培养基筛选培养 15d 并利用 FITC 标记的 anti?v5 抗体穿透染色, 荧光显微镜观察转染效果 MyD88 和 MyD88Δ155?171 慢病毒载体构建根据 Invitrogen 公司提供的方法, 采用 PLenti6/V5/D? Topo 试剂盒将 MyD88,MyD88Δ155?171 片段克隆到载体当中, 重组慢病毒质粒可与包装质粒 (CMVΔ8.9 和 VSVg) 共转染到人 293T 细胞, 以产生病毒, 收集病毒液 MyD88 和 MyD88Δ155?171 对转录因子活性影响的化学发光强度检验 NF?κB?seap 质粒 AP?1?seap 质粒与基因共转染 RAW264.7 细胞 按每孔 细胞铺入 24 孔板, 按照 InvitrogenLipofectamin TM 2000 试剂盒推荐方法共转染质粒 转染 24h 后, 每孔加入 100 ng/ml 脂多糖 (LPS) 刺激, 利用化学发光分析仪检验发光强度 FACS 检测转染 MyD88 或 MyD88Δ155?171 对细胞表面分子表达的影响培养 MyD88,MyD88Δ155? 171 稳定转染与对照的 RAW264.7 细胞, 用不同的 Tol 样受体配体脂多糖 (LPS) 聚肌苷酸胞苷酸 (polyinosinic polycytidylic acid,polyi:c) 肽聚糖 (peptioglycan,pgn) 刺激 48h 后, 细胞计数后取细胞于 15ml 离心管中, 离心加入 700μlPBS 缓冲液, 平均分入预先标记好的流式管中, 加入相应抗体后, 避光放置 15min 每管加入 2mlPBS,1600r/min 离心 5min, 洗去未结合抗体,1g/L 多聚甲醛固定 FACSCalibur 流式细胞仪测定荧光强度, 并用 FACSort 流式细胞仪 CelQuest 软件分析数据 多细胞因子分析系统检测细胞因子水平根据 R&D 公司提供的小鼠多细胞因子分析系统 (Bio? Plex TM proteinaraysystem), 检测经过 TLR7/8 配体 R848(0.01nmol/L) 刺激的转染 MyD88,MyD88Δ155? 171 慢病毒载体的树突细胞培养上清液中细胞因子的表达水平 2 结果 2.1 MyD88Δ155?171 载体的构建和稳定转染细胞系的建立通过计算机程序对 MyD88 功能区的预测, 我们发现在 MyD88 中存在一系列发挥不同作用的功能区, 其中的 TIR 区域在诱导抗原呈递细胞分化和功能上有重要作用, 并且 MyD88aa155?171 片段在不同物种序列间的一致性较高 ( 图 1(A)), 因此我们针对 aa155?171 功能区进行研究, 通过重组 PCR 技术, 去除 aa155?171 功能区, 构建了 MyD88Δ155?171 载体, 并同时克隆出 MyD88 基因 图 1(B) 显示了 aa155?171 功能区的缺失,DNA 测序结果中,Query 为 MyD88Δ155?171 序列, Sbjct 为 MyD88cDNA 序列 序列比对证实已成功构建缺失突变体, 缺失区域为 Sbjct 中的 543~594 位 转染 MyD88Δ155?171?pcDNA TM 3.1/V5 质粒的 RAW264.7 细胞在 400mg/LG 培养基选择下培养 15d 后, 取 细胞, 用抗 V5 抗体染色后, 稳定转染细胞在紫外光下表现为绿色荧光 ( 图 1(C)) 2.2 MyD88 功能区缺失对转染细胞转录因子活性的影响 MyD88 是 NF?κB 依赖性信号通路中的一个重要接头分子 为研究 MyD88Δ155?171 功能区缺失对 Tol 信号通路传递功能的影响, 我们用构建的载体与 NF?

3 2008,28(9) 焦国慧等 :MyD88aa155?171 功能区缺失对免疫相关细胞共刺激分子和细胞因子表达的影响 3 图 1 MyD88Δ155?171 转染稳定细胞系的建立 Fig.1 EstablismentofRAW264.7cellinestable transfectedwithmyd88δ155?171 A:Theamino?acid sequencesofmyd88 arecompared bythe ClustalW program;b:sequenceofmyd88δ155?171;c:ffluorescent micrographofstablecellinetransfectedwithmyd88δ155?171 κb?seap(a) 和 AP?1?SEAP(B) 报告基因共同转染 RAW264.7 细胞,24h 后取上清, 利用试剂盒通过荧光素酶活性检测化学发光强度, 判断相关转录因子活性的变化 ( 图 2) 加入 0.1μg/mlTLR4 配体 LPS 刺激之后, 转染 MyD88 组转录因子的活性明显增强, 但转染 MyD88Δ155?171 组, 各转录因子的活性并未见明显升高, 表明 aa155?171 功能区在 TLR 信号转导中有重要作用 2.3 MyD88 功能缺失对 RAW264.7 细胞表面分子表达水平的影响稳定转染 MyD88 和 MyD88Δ155?171 的 RAW 细胞与对照细胞分别经过抗体染色之后, 经过流式细胞仪分析表面分子表达水平,MyD88 稳定转染细胞表面的 B7H1,CD11b 表达降低, 其余分子没有发现明显变化, 见图 3(A,B:Nostimulus); 而 MyD88Δ155? 171 稳定转染细胞 B7H1,CD11b,CD11c 和 PD?L1 表达均降低, 其余没有明显变化, 见图 4(A,B:Nostimulus) 然后, 利用 0.1μg/mlTLR4 配体 LPS 刺激, 发现经过 LPS 刺激,MyD88 稳定转染细胞表面 CD40,CD80, CD86,Gr1,B7H1,CD11c,PD?L1 的表达有明显升高, 见图 3(A,B:LPS); 同时, 稳定转染 MyD88Δ155?171 的 RAW264.7 细胞经过 LPS 刺激之后,CD40,CD80,Gr1, CD11c,PD?L1 的表达有所升高, 见图 4(A,B:LPS), aa155?171 功能区的缺失可能抑制了免疫细胞对 LPS 刺激时 CD86,B7H1 表达的升高 我们又利用 50μg/ml 的 TLR2 配体 PGN 刺激转染 MyD88 的细胞, 发现经过 PGN 刺激后,CD40,CD80, Gr1,CD11cPD?L1 的表达也有明显升高, 见图 3(A,B: PGN); 而转染 MyD88Δ155?171 的细胞仅见 CD80,Gr1, CD11b 的表达升高, 其余均无明显变化, 见图 4(A,B: PGN) 上述结果表明 MyD88 基因在细胞内表达的上调, 可能会使细胞对 TLR 配体的激活以及向下游传递信号更为敏感 MyD88 功能区的缺失可能会影响细胞表面分子的表达水平, 从而影响其抗原识别的能力和正常的免疫应答 2.4 多细胞因子分析系统检测细胞因子水平 为研究 MyD88Δ155?171 对树突细胞表达细胞因子的调节作用, 我们构建了慢病毒载体转染树突细胞 首先, 我们采用 PLenti6/V5/D?Topo 试剂盒将 MyD88, MyD88Δ155?171 片段克隆到载体当中, 重组慢病毒质粒可以与包装质粒 (CMVΔ8.9 和 VSVg) 共转染到人 293T 细胞, 以产生病毒, 收集病毒液 按照文献推荐方法 [3], 分离培养 MyD88 -/- 小鼠骨髓细胞 (MyD88 -/- 小鼠骨髓细胞由日本 Akira 实验室提供 ), 并诱导分化成为树突细胞, 将构建的 MyD88,MyD88Δ155?171 的慢病毒载体转染到细胞中, 荧光显微镜观察表达情况 ( 图 5) 为证实 MyD88 功能区的缺失会影响细胞的免疫应答, 我们利用多细胞因子分析系统 (Bio?Plex18cytokine asay), 该系统能同时测定 18 种不同的细胞因子, 检测转染不同基因载体的树突细胞培养上清中细胞因子的含量, 表现为与检测信号成正比的关系 我们采用 TLR8 配体 R848(0.01nmol/L) 刺激 MyD88 -/- 小鼠树突细胞以及转染 MyD88,MyD88Δ155?171 的树突细胞 收集刺激 24h 后的上清液, 检测 IL?1α,IL?β,IL?2,IL? 3,IL?4,IL?5,IL?6,IL?10,IL?12(p40),IL?12(p70), IL?17,TNFα,IFNγ,GM?CSF,G?CSF,RANTES,KC/ CXCL1 和 MIP?1α 的表达 检测结果 ( 表 1) 表明, 缺失 MyD88 的 DC, 产生各种细胞因子的能力均受到抑制, 重新转染 MyD88 之后, 各种细胞因子产生增加明显, 其中,IL?12,TNF?α,G?CSF 的表达升高最为明显 同时, aa155?171 功能区的缺失对细胞因子产生也有一定影响, 特别是 IL?12,IFN?γ 和 G?CSF 的表达量, 虽然与对

4 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 图 2 MyD88 和 MyD88Δ155?171 对转录因子 NF?κB(A) 和 AP?1(B) 的影响 Fig.2 EfectsofMyD88andMyD88Δ155?171ontheactivityoftranscriptionfactorsinRAW264.7cels Control:RAW264.7cels;MyD88:RAW264.7celstransfectedwithMyD88;MyD88Δ155?171:RAW264.7celstransfectedwithMyD88Δ155?171 图 3 FACS 检测 MyD88 转染的 RAW264.7 细胞表面分子表达 Fig.3 FACSanalysisofexpresionofsurfacemolecules bymyd88transfectedraw264.7cels Theblack,greenandredlinesrepresentisotype?stainedcels, MyD88transfectedcelsanduntransfectedcelsrespectively 照相比增加, 但和 MyD88 组相比, 有较大的降低, 表明细胞因子的表达虽然受到多种因素控制, 但作为重要 图 4 MyD88Δ155?171 转染的 RAW264.7 细胞表面分子表达 Fig.4 ExpresionofsurfacemoleculesbyMyD88Δ155?171 transfectedraw264.7cels Theblack,greenandredlinesrepresentisotype?stainedcels, MyD88Δ155?171 transfected cels and untransfected cels respectively 的接头分子,MyD88 的功能区部分在诱导某些细胞因子表达信号的传递上起到了重要的作用

5 2008,28(9) 焦国慧等 :MyD88aa155?171 功能区缺失对免疫相关细胞共刺激分子和细胞因子表达的影响 5 图 5 MyD88,MyD88Δ155?171 载体转染树突细胞 并在荧光显微镜下观察表达 Fig.5 FluorescentmicrographofDCstransfected withmyd88andmyd88δ155?171 MyD88:MyD88 -/- DCstransfectedwithMyD88;MyD88Δ155?171: MyD88 -/- DCstransfectedwithMyD88Δ155?171 表 1 MyD88,MyD88Δ155?171 转染的树突细胞 上清表达细胞因子含量 (pg/ml) 的分析 Table1 CytokineasayofthesupernatantsofMyD88 andmyd88δ155?171transfecteddendriticcels(pg/ml) Control MyD88 MyD88Δ155?171 IL?1α IL?1β IL? IL? IL? IL? IL?12p IFN?γ INF?α IL?12p GM?CSF G?CSF rantes kc 讨论 抗原提呈细胞特别是树突细胞 (DC) 通过模式识别 Tol 家族成员 (TLR), 接受外界刺激, 引导免疫反应 多种内外源性配体 ( 如脂多糖 热休克蛋白等 ) 与 TLR 结合导致 TLR 的聚合而活化, 活化的 TLR 胞内段与衔接分子 MyD88 结合, 激活 IL?1R 相关激酶 (IRAK) 肿瘤坏死因子受体相关因子?6(TRAF?6) 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)p38 及 NF?κB,AP?1, 诱导炎症介质产生和共刺激分子表达上调, 促进 DC 成熟, 在炎 症 肿瘤 自身免疫性疾病及移植排斥反应等多种病理生理过程发挥重要作用 结构分析表明,MyD88 结构主要由 N 端的死亡结构域和 C 端的 TIR 结构域组成 [4] MyD88 的 TIR 结构域包含三个高度保守的基序 (motif),box1 2 和 3 [2], 在信号传递上有重要功能 aa155?171 功能区位于 Box1 的部分氨基酸序列, 在免疫相关的信号转导通路上具有重要调控功能 在 TLR 的级联反应当中, 首先 TLR 胞浆区段与接头蛋白 MyD88 相互作用, 可以使 I?κB 磷酸化而降解, 激活的 NF?κB 移位入核内, 启动免疫反应基因转录激活, 从而促进 DC 活化 因此,MyD88 在启动核转录因子 NF?κB 依赖的信号级联反应中起重要作用 而作为转录调节因子的 NF?κB 和 AP?1 在机体天然免疫应答和获得性免疫应答反应中均起着关键作用, 它能调节多种炎症因子和免疫效应蛋白的表达 [5] 已知,DC 的不同表型对 T 细胞接受抗原刺激的反应状态有决定性作用, 其成熟状态对上述疾病的发生 发展及预后起重要作用 成熟 DC 表达高水平 MHC 分子 共刺激分子和粘附分子, 抗原递呈功能很强 ; 而未成熟 DC 尽管摄取抗原能力强, 但不递呈抗原, 且因缺乏共刺激分子表达, 不提供 T 细胞活化必需的第二信号, 可诱导 T 细胞无能或凋亡, 导致免疫耐受 [6] 研究表明, 在 DC 成熟的过程中, 其表面的 MHC?I,CD40, CD80,CD86 等共刺激分子表达会上调 [7] 本实验发现, 过表达 MyD88 并在 TLR 配体刺激下,DC 可以表现更强的激活特性, 多数表面分子表达增加, 提示 LPS,PGN 可通过激活 TLRs 信号促进 DC 成熟, 激活特异性免疫反应, 与以往报道一致 [8] 当转染 MyD88Δ155?171 基因之后,TLR 配体刺激后仅少数 DC 共刺激分子上调, 提示可能有其他相关的信号通路存在, 代偿了功能区突变的抑制效果, 也反映了 MyD88 155?171 功能区确实在调节细胞表面分子的表达中, 和细胞内的其他信号系统协调发挥作用 TLR 信号通路的激活不仅导致转录因素活性的增加, 也可诱导一系列促炎细胞因子的出现 研究表明, 缺少 MyD88 的小鼠产生 IL?12 的能力有明显下降 [9] MyD88 参与初始 T 细胞向 Th1 和 Th2 细胞分化, 由于 IL?12 是诱导 Th1 类免疫反应的重要细胞因子,MyD88 缺陷的小鼠不能对抗原产生 Th1 类反应 [10] 在本实验中,IL?12 的表达在功能域缺失之后有明显变化, 说明相关的功能域可能在调节 IL?12 的产生上有所影响 同时,MyD88 可以介导激活 RAW264.7 细胞中 NF?κB,

6 6 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No AP?1 转录因子的活性, 也可以促进骨髓来源的 DC 产生 IFN?α,IFN?γ 以及 IL?12 [3] 也有研究证实,IL?1β 可以诱导 DC 中 IL?12p70 的表达, 并需要 CD40 和 IFN? γ 参与共刺激反应 [11] 本实验表明,MyD88 的功能区缺失使 CD40 和 IFN?γ 的表达均受影响, 也可能抑制了 IL?12 的表达, 进而调节细胞因子网络的平衡 参考文献 [1]TohnoM,ShimazuT,AsoH,etal.Molecularcloningand functionalcharacterizationofporcinemyd88esentialfortlr signaling.celmolimmunol,2007,4(5):369~376 [2]LiC,ZienkiewiczJ,HawigerJ.InteractivesitesintheMyD88 Tol/interleukin (IL) 1 receptor domain responsible for couplingtotheil?1betasignalingpathway.jbiolchem, 2005,280(28):26152~26159 [3]YangR,MuriloFM,CuiH,etal.Papilomavirus?like particlesstimulatemurinebonemarow?deriveddendriticcelsto produce alpha interferon and Th1 immune responses via MyD88.JVirol,2004,78(20):11152~11560 [4]McGetrickAF,O NeilLA.TheexpandingfamilyofMyD88?likeadaptorsinTol?likereceptorsignaltransduction.Mol Immunol,2004,41(6~7):577~582 [5]MigginSM,P lson?mcdermote,dunnea,etal.nf? kappabactivationbythetol?il?1receptordomainprotein MyD88adapter?likeisregulatedbycaspase?1.ProcNatlAcad SciUSA,2007,104(9):3372~3377 [6]FairchidPJ,WaldmannH.Dendriticcelsandprospectsfor trans?plantationtolerance.curopinimmunol,2000,12(5): 528~535 [7]DeTrezC,BraitM,LeoO,etal.Myd88?dependentinvivo maturationofsplenicdendriticcelsinduced byleishmania donovaniandotherleishmaniaspecies.infectimmun,2004, 72(2):824~832 [8]KathrinSM,AlexandraA,MarieteM,etal.Theroleoftol? likereceptors(tlrs)inbacteria?inducedmaturationofmurine dendriticcels(dcs).jbiolchem,2001,276(28):25680~ [9]SekiEH,TsutsuiH,NakanoNM,etal.Lipopolysaccharide? inducedil?18secretionfrommurinekupfercelsindependently ofmyeloiddiferentiationfactor88thatiscriticalyinvolvedin inductionofproductionofil?12andil?1β.jimmunol,2001, 166(4):2651~2657 [10]JankovicD,KulbergMC,HienyS.IntheabsenceofIL?12, CD4 + Tcelresponsestointracelularpathogensfailtodefault toath2paternandarehostprotectiveinanil?10 -/- seting. Immunity,2002,16(3):429~439 [11]WesaAK,GalyA.IL?1βinducesdendriticcelstoproduceIL?12.IntImmunol,2001,13(8):1053~1061 aa155?171motifdeletionofmyd88atenuatesexpresionofco?stimulatory MoleculesandCytokinesinImmuneAsociated?cels JIAOGuo?hui DAIHong?sheng ZHANGZhuo?han ZENGBin LIUYu ZHANGYuan YANGRong?cun (DepartmentofImmunology,SchoolofMedicine,NankaiUniversity,Tianjin ,China) Abstract MyeloiddiferentiationfactorMyD88isacriticaladaptormoleculethatintegratesandtransduces intracelularsignalsininducingthediferentiationofdendriticcels(dcs).thedomainregionswithinmyd88 wassearched,itcouldpotentialyafectthefunctionofdendriticcelsandfoundthatmyd88aa155?171motifnot onlyregulatetheactivityoftranscriptionfactornf?κb,butalsocontroltheproductionofcytokinesandexpresion ofcostimulatorymolecules.indeed,aa155?171motifdeletedtypemyd88(myd88δ155?171) transfected RAW264.7celsexhibitedthereducedNF?κBandAP?1activityandinteruptedtheexpresionofCD86and B7H1.Meanwhile,lowerlevelexpresionofcytokinessuchasIL?12,IFN?γwerealsoobservedbymeansof cytokinearayinmyd88 -/- DCtrasfectedwithMyD88Δ155?171ascomparedtotheMyD88transfectedcels. Thus,aa155?171motifinsideMyD88couldafecttheexpresionofcostimulatorymolecules,productionof cytokinesandtransductionoftollikereceptorsignalpathway,suggestingthatthismotifmayplayanimportant roleinregulatingresponsesofinnateimmunesystem. Keywords Immuneregulation DomaindeletedMyD88 Dendriticcel

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