第 39 卷 117 SAMDC) 就是其中一种, 研究其基因的克隆定位和表达, 可一定程度上从分子水平解释多胺对高等植物生长发育和抗逆的调控规律 [1] 到目前为止,SAMDC 已经在一些植物中进行了提纯分析, 甚至遗传转化, 发现这些转基因植物的多胺代谢能力有明显增强, 抗旱等性能明显提升

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瓶迹田
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1 第 39 卷第 1 期 2019 年 1 月 Vol. 39 No. 1 Jan Journal of Central South University of Forestry & Technology Doi: /j.cnki x http: //qks.csuft.edu.cn 外源多胺对红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达的调节作用杨硕知 1 刘球 1 2 吴际友 1 李志辉 2 程勇 1 1. 湖南省林业科学院湖南长沙中南林业科技大学湖南长沙摘要以 2 年生红椿家系盆栽幼苗为实验材料开展了外源多胺对红椿干旱胁迫下 TcSAMDC 基因表达的修复效应研究实验设置了轻度中度和重度 3 种干旱胁迫梯度干旱结束后喷施了 1 mmol/l 的外源腐胺 Put 亚精胺 Spd 及精胺 Spm 溶液作为修复处理旨在探索湖南本土珍贵树种红椿 Toona ciliata 在遭受季节性干旱胁迫后的生理变化以及有效修复措施结果表明 1 成功克隆了红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶 TcSAMDC 基因片段测序得到一条 532 碱基对的 DNA 2 外源 Put Spd 和 Spm 溶液对不同程度干旱胁迫下红椿 TcSAMDC 基因表达的修复效果都非常显著 α= 种外源多胺在不同程度干旱胁迫下对红椿叶片的 TcSAMDC 基因表达表现出不同的修复调节作用其中以外源 Spd 效果最佳因此人为施加外源多胺能在很大程度上影响红椿 TcSAMDC 基因的表达进而影响植株的干旱修复能力采用人工喷施外源多胺诱导 TcSAMDC 基因表达于对抗干旱胁迫具有极强的实际操作意义关键词红椿盆栽幼苗腺苷甲硫氨酸脱羧酶外源多胺基因表达干旱胁迫干旱修复效应中图分类号 S 文献标志码 A 文章编号 X(2019) Gene cloning and expression analysis of TcSAMDC of Toona ciliata YANG Shuozhi1, LIU Qiu1,2, WU Jiyou1, LI Zhihui2, CHENG Yong1 (1. Hunan Academy of Forestry, Changsha , Hunan, China; 2. Central South University of Forestry & Technology, Changsha , Hunan, China) Abstract: Using two-year-old potted seedlings of Toona ciliata families as experimental materials, a study on the repair effect of exogenous polyamines on TcSAMDC gene expression under drought stress was carried out. The drought stress gradients was set out with 3 levels: mild, moderate and severe drought stress. After the drought stress, the three exogenous polyamines solutions such as 1 mmol/l of Put, 1 mmol/l Spd and 1 mmol/l Spm were sprayed as the three remediation treatments. The purpose of the experiments is to explore the physiological changes and the effective restoration measures of Hunan native precious tree species T. ciliata after suffering from seasonal drought stress. The results as follows: 1) A gene fragment of S-adenosylmethionine decarboxylase (TcSAMDC) from T. ciliate was successfully cloned, and sequenced, thus obtaining the gene fragment s DNA with 532 base-pairs. 2) The remediation effects of exogenous Put, Spd and Spm solution on TcSAMDC gene expression of T. ciliata under different drought stress were all very significant (a=0.01). 3) Three exogenous polyamines showed different repair and regulation effects on TcSAMDC gene expression in Toona sinensis leaves under different degrees of drought stress, among them exogenous Spd performed the best. Therefore, the artificial application of exogenous polyamines can greatly affect the expression of TcSAMDC gene in T. ciliata, and then improve the ability of plant repairing drought stress, and artificial spraying of exogenous polyamines can induce TcSAMDC gene expression, which is of great practical significance in against drought stress. Keywords: Toona ciliata; potted seedlings; adenosylmethionine decarboxylase(samdc); exogenous polyamines; gene expression; drought stress; drought remediation effect 多胺是普遍存在于高等动物和植物体内的一类化合物植物在进行多胺合成和分解代谢的过程中有许多的关键酶 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶 S-adenosylmethionine decarboxylase, 即收稿日期基金项目国家重点研发计划项目 2016YFD 作者简介杨硕知助理研究员硕士通信作者刘球助理研究员博士生 gedx2008@126.com 引文格式杨硕知刘球吴际友等. 外源多胺对红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达的调节作用 [J]. 2019, 39(1):

2 第 39 卷 117 SAMDC) 就是其中一种, 研究其基因的克隆定位和表达, 可一定程度上从分子水平解释多胺对高等植物生长发育和抗逆的调控规律 [1] 到目前为止,SAMDC 已经在一些植物中进行了提纯分析, 甚至遗传转化, 发现这些转基因植物的多胺代谢能力有明显增强, 抗旱等性能明显提升 [2] 早在 1962 年,Tabor [3] 就发现了 SAMDC 基因, 并开始对其开展深入研究到目前为止, 科学家们已从动植物中克隆了约 180 个 SAMDC 基因, 其中从植物中克隆出 40 多个 [4] 科学家们还发现, 几乎每个植物品种都包含不止一个 SAMDC 基因, 比 [5] [6] 如, 水稻和拟南芥中有 4 个, 番茄中有 3 个, [7] 羊草中有 2 个, 且各个基因在植物不同器官中的表达特性各不相同通过对比还发现, 已知植物 SAMDC 基因的核苷酸序列同源性比较高, 因此可推导出氨基酸序列的相似度也比较高 [4] SAMDC 基因表达具有组织器官特异性, 调节着不同器官组织的代谢过程有研究人员发现, 在百脉草中 SAMDC 基因在根茎叶中表达的 RNA 水平不同, 在茎中较低, 在幼叶和根中较高, 而成熟叶中不表达 [8] [9] 刘志勇等发现, 番茄 SISAMDC1 基因组序列全长为 bp, 有 3 个内含子, 均位于 5 -UTR, 与其他植物 SAMDC 基因的同源性较高, 但与动物细菌等来源的 [10] SAMDC 基因同源性较低张梅等发现, 杜梨 PbSAMDC 基因全长 bp, 有 358 个氨基酸, 该基因与 MdSAMDC1 的同源性高达 96%, 跟甜橙葡萄中 SAMDC 基因的同源性也较高从辣椒中克隆出 SAMDC 基因, 然后将其转入拟南芥体内发现, 在干旱胁迫下转基因拟南芥中的亚精胺 (Spermidine, 即 Spd) 和外源精胺 (Spermine, 即 Spm) 含量比野生拟南芥要高, 说明转入的 SAMDC 基因提高了辣椒体内多胺的合成, 有助于提高拟南芥抗旱能力 [11] [12] 李昌澎以小麦品种晋麦 47 为试验材料, 扩增了 SAMDC 基因, 采用 BSMV-VIGS 技术进行沉默, 然后进行干旱胁迫和复水处理, 结果发现,SAMDC 基因的沉默降低了小麦晋麦 47 抵御干旱胁迫的能力红椿 Toona ciliata 是楝科香椿属落叶大乔木, 国家 Ⅱ 级保护濒危种, 是湖南林业优先重点发展的珍贵用材树种之一湖南地区的 6 9 月最容易出现季节性持续干旱, 然而红椿生长旺盛期也是 6 9 月, 如遇季节干旱, 红椿的生长将遭受很大的影响 [13] 本研究以红椿总 RNA 为模板, 采用 PT-PCR 法克隆红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因 TcSAMDC, 并研究其在干旱胁迫及外源多胺修复处理下的表达情况, 旨在了解多胺抗旱分子机制, 探索红椿幼苗遭受季节性干旱胁迫后的有效修复措施, 以防发生大面积苗木损毁, 进而保证造林成活率 1 材料与方法 1.1 试验材料本研究以 2 年生红椿家系幼苗为试验对象 1.2 试验方法红椿 TcSAMDC 基因克隆选取多种植物 SAMDC 基因表达的氨基酸序列进行分析比对, 以期发现其保守区域, 然后根据保守区域碱基序列设计引物利用取得的引物, 通过总 RNA 提取, 反转录 cdna 并使用 PCR 扩充获得目的基因片段使用 T 载体克隆目的基因, PCR 扩充后进行阳性菌落培养将所获得的 DNA 序列测序, 结果在 NCBI 数据库进行比对红椿 TcSAMDC 基因在外源多胺抗干旱胁迫条件下表达根据已经测序出的红椿 SAMDC 基因序列, 运用 primer5 设计荧光定量 PCR 引物, 从而监测外源多胺在修复不同程度干旱胁迫时该基因的表达情况试验地概况试验地位于湖南省林产品质量检验检测中心苗圃内, 其地理坐标为东经北纬 28 05, 年平均气温 16.8, 平均日照时数 ~ h, 年降水量 ~ mm, 无霜期 264 d, 属中亚热带季风湿润气候区, 光照充足, 雨量丰沛 ; 海拔为 110 m, 土壤为砂岩发育的红壤, 土层厚达 60 cm 以上 ; 土壤肥力中等,pH 值为 6.2 [14] 试验材料本研究以 2 年生红椿家系幼苗为试验对象展开试验布置 2012 年 3 月, 在桃源县白家育苗圃进行田间播种育苗, 并进行日常管护 2014 年 3 月, 选择长势均匀健康无病虫害的红椿幼苗完成入盆, 每盆一株, 盆钵口径 25 cm, 深 20 cm, 每盆装土 5 kg( 黄心土泥炭土 = 2 1), 配统一盆垫, 正常浇水管护 2014 年 6 7 月, 针对管护好的红椿盆栽幼苗布置干旱胁迫和外源多胺修复调节试验 [14] 试验设计与处理本试验为双因素 ( 干旱胁迫处理多胺修复处理 ) 试验, 采用完全随机设计, 植株干旱胁

杨硕知等外源多胺对红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达的调节作用 118 迫梯度有 3 种轻度干旱中度干旱和重度干旱喷施多胺修复处理有 3 种外源腐胺即 Putrescine 简称 Put 外源亚精胺 Spd 和外源精胺 Spm 先对参试植株进行持续干旱胁迫然后再第1期红椿 TcSAMDC 基因克隆结果 2.

3 杨硕知等外源多胺对红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达的调节作用 118 迫梯度有 3 种轻度干旱中度干旱和重度干旱喷施多胺修复处理有 3 种外源腐胺即 Putrescine 简称 Put 外源亚精胺 Spd 和外源精胺 Spm 先对参试植株进行持续干旱胁迫然后再第1期红椿 TcSAMDC 基因克隆结果 RNA 提取图 1 为红椿叶片 RNA 样品图电泳槽用 3% 对其进行多胺修复处理并采样分析 5 株每重复的双蒸水灭菌 DEPC 处理水配制处理 0.5 h 重复 3 次总共 150 株配制 1% 变性琼脂糖凝胶 0.2 g 琼脂糖 20 ml 干旱胁迫处理 1 对照处理 CK 即无菌 1 TAE 处理水加热至琼脂糖溶解冷至每天浇水至饱和状态土壤相对含水率 45% 60 加入 0.5 μl EB 10 mg/ml 混匀后 50% 2 轻度干旱胁迫即持续干旱 7 d 土壤倒胶取 2 μl 提取的 RNA 按 1 5 的比例与相对含水率 30% 38% 3 中度干旱胁迫即 loading buffer premix 混匀 120 V 恒压电泳溴酚持续干旱 14 d 土壤相对含水率 25% 30% 蓝前沿迁移至凝胶总长 2/3 处停止电泳凝胶成像 4 重度干旱胁迫即持续干旱 21 d 土壤相对含系统下观察图 1 为红椿叶片 RNA 样品图为保水率 20% 25% 于每天傍晚 18:00 采用美国便携式土壤含水率测定仪 FIELD SCOUT TDR 200 的 200 mm 探针进行盆栽土壤含水率测定并采取证 RNA 的纯度以及浓度后续克隆实验选择对照 2 号样品作为模板叶片样品回实验室进行指标测定 [14] 外源多胺修复调节处理分别在轻度中度和重度干旱结束日起每天傍晚 18:00 对轻度干旱胁迫对象喷施浓度为 1 mmol L-1 的外源 Put 外源 Spd 和外源 Spm 水溶液贴近植株叶片正反面进行雾状喷施喷施量以叶片正反面水珠凝结滴落为限连续喷施 3 d 2014 年 6 月 10 日正式开始试验于 2014 年 7 月上旬试验结束试验在人工遮雨棚中进行保证正常的光照和空气条件防止雨水入侵保持棚内外温度一致选择第三轮成熟叶片进行采样 Fig 将摘取的叶片放进避光的冰盒迅速将其带回实验室进行下一步操作图 1 TcSAMDC RNA 提取结果 RNA extraction results of TcSAMDC gene cdna 扩增图 2 为 PCR 扩增样品电泳条件同凝胶成像系统下观察数据分析基因表达数据采用 SPSS19.0 软件进行统计分析用 EXCEL2003 进行制图结果与分析引物设计结果选取 10 种植物 SAMDC 氨基酸序列进行分析发现存在两个高度保守区域据此设计引物见表 1 表 1 引物设计结果 Table 1 Results of prime design 引物名序列克隆引物 SAMDC1-F D2 000 plus maker 条带从上至下条带为 bp 阴性对照为以水为模板扩增样品 Fig 图 2 TcSAMDC 基因 PCR 扩增图 PCR amplification results of TcSAMDC gene 基因克隆 CCTACAAGATCATCATCAARACNTGYGG 配制 1% 的琼脂糖凝胶上样检测将 PCR 克隆引物 SAMDC1-R CGAAGGAGGCGTAGGAGAANCCRTCYTC 产物中含有目的大小片段回收产物与 T 载体连克隆引物 SAMDC2-F ATHAARACNTGYGGNACNAC 克隆引物 SAMDC2-R TTCATNSWRTANCCRCANGG 接后热激法转化 DH5α 感受态用无菌牙签挑取单克隆菌落装入 0.2 ml

第 39 卷 119 已灭菌的 EP 管中, 用 10 μl 无菌水稀释菌落, 取 2 μl 菌液进行 PCR, 按克隆目的片段的反应程序进行菌落 PCR 扩增程序为:94 预变性 3 min,94 变性 15 s,56 退火 30 s,72 延伸 50 s 共 31 个循环,72 延伸 7 min 电泳条件同 2.2.1 红椿 TcSAMDC 基因克隆结果见图 3 2.

000,3 000, 1 000,750,500,250,100 bp, 红椿 PCR 扩增样为步骤 2.2.2 所扩出的样品以作为阳性对照, 阴性对照为以水位模板进行 PCR 扩増图 3 TcSAMDC 基因克隆 Fig. 3 Clone of TcSAMDC gene 图 4 TcSAMDC 序列 BLAST 比对结果 Fig.

synthesis of fluorogenic quantitative PCR 引物名序列产物长度 /bp Q-PCR 引物 SAMDC-R 5-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3 68 Q-PCR 引物 SAMDC-R 5-TGTGCCAGTTACGAT TAGGAAAG-3 2.4.

4 第 39 卷 119 已灭菌的 EP 管中, 用 10 μl 无菌水稀释菌落, 取 2 μl 菌液进行 PCR, 按克隆目的片段的反应程序进行菌落 PCR 扩增程序为:94 预变性 3 min,94 变性 15 s,56 退火 30 s,72 延伸 50 s 共 31 个循环,72 延伸 7 min 电泳条件同红椿 TcSAMDC 基因克隆结果见图红椿 TcSAMDC 基因测序及序列比对测序得到一条 532 碱基对 DNA 将测序得到的结果在 NCBI 数据库上比对, 未找到相同的序列, 结果如图 4 所示从比对结果可知, 所得产物碱基片与芸香科甜橙以及克莱门柚的 SAMDC 基因相似度达 79%, 因此所得产物确实为红椿 SAMDC 基因, 命名为 D2 000 plus marker 条带从上至下条带为 :5 000,4 000,3 000, 1 000,750,500,250,100 bp, 红椿 PCR 扩增样为步骤所扩出的样品以作为阳性对照, 阴性对照为以水位模板进行 PCR 扩増图 3 TcSAMDC 基因克隆 Fig. 3 Clone of TcSAMDC gene 图 4 TcSAMDC 序列 BLAST 比对结果 Fig. 4 Comparison results of TcSAMDC sequence by BLAST TcSADMC 2.4 外源多胺对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的影响引物设计结果根据已经测序出的红椿 TcSAMDC 基因序列, 运用 primer5 软件设计荧光定量 PCR 引物合成 ( 见表 2) 表 2 荧光定量 PCR 引物合成 Table 2 Prime synthesis of fluorogenic quantitative PCR 引物名序列产物长度 /bp Q-PCR 引物 SAMDC-R 5-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3 68 Q-PCR 引物 SAMDC-R 5-TGTGCCAGTTACGAT TAGGAAAG 荧光定量 PCR 实验结果由图 5 可以看出, 各样品基因均有不同程度的表达量此图为部分 RNA 样品图, 条带从上至下为 : bp 图 5 红椿 RNA 电泳图 Fig.5 RNA electrophoresis figure of T. ciliata 不同外源多胺对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的影响外源 Put 对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的影响在对照轻度干旱胁迫 ( 或中度干旱胁迫, 或重度干旱胁迫 ) 和外源 Put 修复调节处理之间, 红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量均呈现极显著差异 (F= ,P < 0.01;F= ,P < 0.01;F= ,P < 0.01) 如图 6 表 3 所

5 杨硕知等外源多胺对红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达的调节作用 120 示轻度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著降低降低幅度为 13.90% 喷施外源 Put 处理后相对表达量继续下降幅度为胁迫状态下的 15.25% 中度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著升高升高幅第1期或重度干旱胁迫和外源 Spd 修复调节处理之间红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量均呈现极显著差异 F= P 0.01 F= P 0.01 F= P 度为对照的 3.67 倍在喷施外源 Put 处理后相对 0.01 如图 7 表 3 所示轻度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著表达量继续以更迅猛的速度升高升高幅度为胁迫升高升高幅度为对照的 1.5 倍喷施外源 Spd 状态下的 1.55 倍为对照状态的倍重度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDCC 基因相对表达量比处理后相对表达量继续以更迅猛的速度升高对照显著升高升高幅度为对照的 7.88 倍在喷施升高幅度为胁迫状态下的 3.51 倍为对照状态的倍中度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDC 外源 Put 处理后相对表达量有所下降下降幅度基因相对表达量比对照显著下降降低幅度为对为胁迫状态的 51.15% 但仍是对照状态的 3.34 倍照的 73.55% 喷施外源 Spd 处理后相对表达量飞速升高升高幅度为胁迫状态的倍为对照状态的倍重度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著升高升高幅度为对照的 5.91 倍然而喷施外源 Spd 处理后相对表达量却迅速下降下降幅度为胁迫状态的 61.68% 仍是对照状态的 1.65 倍外源 Put 对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的修复调节 Fig. 6 Repair and regulation of exogenous Put on leaf relative expression of TcSAMDC gene of T. ciliata seedlings under drought stress 图6 表3 干旱胁迫及外源多胺调节处理下的红椿TcSAMDC基因相对表达量活性 Table 3 Relative expression of TcSAMDC gene of T. ciliata seedlings under drought stress and exogenous polyamines adjustment and treatment 处理轻度干旱胁迫中度干旱胁迫重度干旱胁迫对照 0.95 a 干旱胁迫 0.82 b 4.44 b 8.44 a 外源 Put 调节 0.69 c a 4.12 b 对照 0.95 b 干旱胁迫 2.37 b 0.25 c 6.57 a 外源 Spd 调节 a a 2.52 b 对照干旱胁迫 1.80 b 7.22 b 6.55 a 外源 Spm 调节 3.72 a a 2.49 b 小写字母表示α=0.05水平下的差异显著性大写字母表示α=0.01水平下的差异显著性外源 Spd 对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的影响在对照轻度干旱胁迫或中度干旱胁迫外源 Spd 对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的修复调节 Fig.7 Repair and regulation of exogenous Spd on leaf relative expression of TcSAMDC gene of T. ciliata seedlings under drought stress 图外源 Spm 对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的影响在对照轻度干旱胁迫或中度干旱胁迫或重度干旱胁迫和外源 Spm 修复调节处理之间红椿幼苗 SAMDC 基因相对表达量均呈现极显著差异 F= P 0.01 F= P 0.01 F= P 0.01 如图 8 表 3 所示轻度干旱胁迫下红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著升高升高幅度为对照的 89.11% 喷施外源 Spm 处理后相对表达量继续升高升高幅度为胁迫状态下的 1.07 倍为对照状态的 2.91 倍中度干旱胁迫下红椿幼

6 第 39 卷 121 苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著升高, 升高幅度为对照的 6.6 倍, 喷施外源 Spm 处理后, 相对表达量继续升高, 升高幅度为胁迫状态下的 87.23%, 升高幅度为对照的倍 ; 重度干旱胁迫下, 红椿幼苗 TcSAMDC 基因相对表达量比对照显著升高, 升高幅度为对照的 5.89 倍, 喷施外源 Spm 处理后, 相对表达量极速下降, 下降幅度为胁迫状态的 61.93%, 但仍为对照状态的 1.62 倍图 8 外源 Spm 对干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达的修复调节 Fig.8 Repair and regulation of exogenous Spm on leaf relative expression of TcSAMDC gene of T. ciliata seedlings under drought stress 2.5 外源多胺对干旱胁迫下红椿叶片 SAMDC 基因表达的修复调节效果比较 SAMDC 是亚精胺 (spd) 和精胺 (spm) 的合成关键酶之一, 它在多胺的合成过程中起催化脱羧反应, 经过一系列的反应后, 腐胺 (Put) 与脱羧的 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 提供的氨丙基合成亚精胺 (spd) 和精胺 (spm) SAMDC 基因表达量高, 则说明促进植物启动多胺合成关键酶基因 SAMDC 以抵抗胁迫的力度越大, 因此,SAMDC 基因相对表达量变化值越大, 外源多胺所起到的修复调节作用越明显 3 种外源多胺在不同的干旱胁迫程度下对红椿叶片的 TcSAMDC 基因相对表达量修复调节效果不同 ( 见表 4), 轻度干旱胁迫下, 其修复调节效果呈现极显著差异 (F= ,P < 0.01); 中度干旱胁迫下, 其修复调节效果呈现极显著差异 (F= ,P < 0.01); 重度干旱胁迫下, 其修复调节效果差异不显著从图 9 中可看出, 轻度胁迫下,3 种外源多胺试剂的修复调节效果大不相同, 其中外源 Put 起到的是负向调节作用, 而外源 Spm 和外源 Spd 则起到了显著的正向调节作用, 其调节效果大小顺序为 Spd > Spm; 中度干旱胁迫下,3 种外源多胺试剂均起到了显著的正向修复调节作用, 其调节效果大小顺序为 Spd > Put > Spm, 以 Spd 效果最好, Put Spm 二者效果差别不显著 ; 重度干旱胁迫下,3 种外源多胺试剂均起到负向的调节作用, 三者的负向作用差异不显著综上分析可知, 外源 Spd 和外源 Spm 对轻度干旱胁迫下红椿叶片 SAMDC 基因表达有很好的促进作用, 进而促进内源 Spd 和内源 Spm 的有效合成, 以修复干旱损伤, 而外源 Put 则相反 ; 外源 Put 外源 Spd 和外源 Spm 三者均能非常有效地修复调节中度干旱胁迫下红椿叶片 TcSAMDC 基因表达, 均能大力地促进内源 Spd 和内源 Spm 的有效合成, 以修复干旱损伤, 且以外源 Spd 效果最佳 ; 然而, 到重度干旱胁迫程度, 可能因为植株体内细胞膜受损程度较大, 以至于外源 Put 外源 Spd 和外源 Spm 三者均不仅不能有效地促进红椿叶片 TcSAMDC 基因表达, 反而对 TcSAMDC 基因的表达起到了明显的相近程度的抑制作用表 4 外源多胺在不同程度干旱胁迫下的调节作用 Table 4 Regulating effect of exogenous polyamines on T. ciliata seedlings under drought stress in different degrees 外源多胺轻度干旱胁迫中度干旱胁迫重度干旱胁迫 Spm Spd Put 表示正向调节, - 表示负向调节, 符号数量表示该干旱胁迫程度下调节强度 TcSAMDC 基因相对表达量变化值 = 试剂调节后 TcSAMDC 基因相对表达量 - 干旱胁迫处理下 TcSAMDC 基因相对表达量图 9 外源多胺修复对干旱胁迫下红椿幼苗叶片 TcSAMDC 基因相对表达量变化值的影响 Fig. 9 Repair and regulation effect of exogenous polyamines on variation value of leaf relative expression of TcSAMDC gene of T. ciliata under drought stress

7 杨硕知, 等 : 外源多胺对红椿 S- 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达的调节作用 122 第 1 期 3 讨论和结论 3.1 讨论植物多胺及其合成与代谢途径在很长一段时间以来一直是研究的热点对该途径中关键酶基因的克隆定位和表达, 可从分子水平上解释多胺对高等植物生长发育和抗逆的调控规律 [1] 常见植物多胺亚精胺和精胺是由腐胺与脱羧的 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 提供的氨丙基合成 [15] SAMDC 是上述步骤中的限速酶, 因此其受到了许多研究者的关注 [16] 蔡秋华等成功克隆了斑茅 SAMDC 基因 [17] 并进行了原核表达实验张高阳等成功克隆 [18] 了红麻 SAMDC 基因曾庆飞等克隆了高羊茅 SAMDC 基因并成功构建了原核表达载体王 [19] 凡龙等对棉花的 SAMDC 基因家族的 3 个基因进行克隆和测序, 并对其在不同胁迫条件下的表 [20] 达方式进行了研究王广龙等克隆了胡萝卜 DcSAMDC 基因, 并报道其能够在 38 高温 4 低温干旱胁迫以及高盐胁迫等条件下迅速响 [21] 应刘金仙等对甘蔗 ScSAMDC 基因进行了克隆, 且聚二乙醇或氯化钠等胁迫可以促进其表达, 水杨酸或过氧化氢等胁迫对其表达具有抑制作用 [22] 文乐等研究了甘蔗 Sc-SAMDC3 基因的克隆与表达, 并进行了生物学信息及其表达特性分析, 发现甘蔗 Sc-SAMDC3 基因表达量随着胁迫状态的持续呈现上调趋势, 与本实验研究结论相似本研究中, 外源 Spm 和外源 Spd 对轻度干旱胁迫下红椿 TcSAMDC 基因表达有很好的促进作用, 进而促进内源 Spm 和内源 Spd 的有效合成, 以修复干旱损伤, 而外源 Put 则相反 ; 外源 Put 外源 Spm 和外源 Spd 三者均能非常有效地修复调节红椿中度干旱胁迫下红椿 TcSAMDC 基因表达, 均能大力地促进中度胁迫下植株内源 Spm 和内源 Spd 的有效合成, 以修复干旱损伤 ; 然而, 到重度干旱胁迫程度, 可能因为植株体内细胞膜受损程度较大, 以致于外源 Put 外源 Spm 和外源 Spd 三者均不仅不能有效地促进红椿 TcSAMDC 基因表达, 反而对 TcSAMDC 基因的表达起到了明显的相近程度的抑制作用 ; 说明用外源多胺刺激红椿 TcSAMDC 基因的表达对植株的抗旱是有一定程度效果的刘 [23] 玉等研究发现, 转入 SmSAMDC 基因可使烟草生理指标抗旱特征更加显著, 通过表达 SmSAMDC [20] 基因, 可提高转基因烟草抗旱能力王广龙等对 SAMDC 基因进行了克隆和表达响应分析, 发现模拟干旱 200 g L -1 PEG 1 h 后,DcSAMDC 基因相对表达量相比对照提高了 1.46 倍本研究仅对 2 年生红椿盆栽苗进行了干旱胁迫修复试验, 结论具有一定的局限性在下一步研究中, 可以考虑在本文研究基础上, 对不同年龄段的实生苗进行抗干旱试验, 同时增加喷施外源多胺的种类与浓度梯度, 以期能够更好地解决生产栽培中的实际问题 3.2 结论 [24-26] 1) 本实验得到了红椿 TcSAMDC 基因的部分序列将测序得到的结果在 NCBI 数据库上使用 BLAST 比对, 未找到相同的序列从比对结果可知, 与所得产物碱基片段最相似的基因是芸香科植物的 SAMDC 基因, 因此所得产物确实为红椿 TcSAMDC 基因片段 2) 本实验结果表明, 在红椿叶片人为施加外源多胺能够在很大程度上影响植株的抗旱能力, 并且不同种类的外源多胺在不同程度的干旱胁迫下对红椿叶片的抗旱性表现出不同的调节作用荧光定量 PCR 结果显示其本质原因是外源多胺的存在影响了 TcSAMDC 基因表达与内源多胺的合成, 并且其促进或抑制程度与红椿叶片表现出来的抗旱能力具有一致性其中, 外源 Spd 和 Spm 在轻度中度干旱胁迫下均表现出促进作用, 且前者作用程度均高于后者 ; 而外源 Put 则在轻度中度干旱胁迫时表现出先抑制后促进的情况 ; 重度干旱胁迫程度时, 上述 3 种外源多胺对红椿叶片抗旱能力均起到了明显的抑制作用, 且抑制程度相近, 可能原因是植株体内细胞膜受损程度较大, 导致基因正常表达过程受到阻碍或者被破坏整体而言, 外源多胺对红椿中度干旱胁迫修复效果较为显著 ;3 种外源多胺中, 以外源 Spd 对各胁迫程度的修复效果更为理想参考文献 : [1] 刘颖, 王莹, 龙萃, 等. 植物多胺代谢途径研究进展 [J]. 生物工程学报,2011,27(2): [2] 应叶青. 多胺对毛竹幼苗抗旱调控机理的研究 [D]. 北京 : 北京林业大学,2013. [3] TALOR C W. Adenosylmethionine decarboxylase[j].elsevier, 1962, 5: [4] 张佳景, 丁淑丽, 邹宜静, 等. 植物腺苷甲硫氨酸脱羧酶研究进展 [J]. 细胞生物学杂志,2008,30(5): [5] CHEN M, CHEN J J, FANG J Y, et al. Down-regulation of S-adenosylmethionine decarboxylase genes results in reduced

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福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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