50 中南大学学报 ( 医学版 ), 2018, 43(1) Methods: The number of hypertrophic nonunion tissue samples and atrophic nonunion tissue samples

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中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2018, 43(1) http://www.csumed.org 49 DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2018.01.008 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/20180149.

1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2018, 43(1) 49 DOI: /j.issn 转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 在人骨不连组织中的表达及其临床意义刘春风 1, 刘文琦 2, 刘傥 2, 刘小平 1, 王振 1, 刘进炼 1 1, 刘超群 ( 1. 上海交通大学医学院苏州九龙医院骨科, 江苏苏州 ;2. 中南大学湘雅二医院骨科, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 检测肥大性骨不连组织与萎缩性骨不连组织中转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 表达的差异, 评价两种骨不连组织在成骨潜能上的区别方法 : 收集 2010 年至 2014 年中南大学湘雅二医院和上海交通大学医学院苏州九龙医院骨科住院的肥大性和萎缩性骨不连患者各 20 例利用免疫组织化学 SP 二步法及病理图像分析软件 IPP6.0 对骨不连断端间组织转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 的表达进行半定量分析根据骨不连类型患者年龄和骨不连时间对其进行统计学分析结果 : 肥大性骨不连患者中转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 的吸光度值分别为 ± 和 ±0.0400, 萎缩性骨不连患者中转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 的吸光度值分别为 ± 和 ±0.0423, 两者标本中的吸光度值差异均无明显统计学意义 ( 均 P>0.05) 转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 在不同年龄不同骨不连时间中的吸光度值差异也均无明显统计学意义 ( 均 P>0.05) 结论: 肥大性骨不连组织和萎缩性骨不连组织在成骨潜能上无明显差异 [ 关键词 ] 骨不连 ; 转化生长因子 β1; 骨形态发生蛋白 -9; 免疫组织化学 Expression of transforming growth factor 1 and bone morphogenetic protein 9 in human nonunion tissues and its clinical significance LIU Chunfeng 1, LIU Wenqi 2, LIU Tang 2, LIU Xiaoping 1, WANG Zhen 1, LIU Jinlian 1, LIU Chaoqun 1 ( 1. Deparment of Orthopedics, Suzhou Kowloon Hospital Affiliated to School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Suzhou Jiangsu ; 2. Deparment of Orthopedics, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha , China ) ABSTRACT Objective: To examine the expression of transforming growth factor 1(TGF-β1) and bone morphogenetic protein-9 (BMP-9) in human nonunion tissues, and to evaluate the clinical significance. 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 刘春风, spriing_wind@163.com 通信作者 (Corresponding author): 刘傥, liutang1204@csu.edu.cn 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( , ); 苏州市科技发展项目 (SYSD ) This work was supported by the National Natural Science Foundation ( , ), and the Suzhou Science and Technology Development Project (SYSD ), China.

2 50 中南大学学报 ( 医学版 ), 2018, 43(1) Methods: The number of hypertrophic nonunion tissue samples and atrophic nonunion tissue samples were collected from Department of Orthopedics, the Second Xiangya Hospital of Central South University and Suzhou Kowloon Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiao Tong University between 2010 and Semi-quantification of SP immunohistochemical method and pathological image analysis software IPP6.0 were used to analyze the expression of TGF-β1 and BMP-9. Nonunion type, patients age and nonunion time were statistical analyzed. Results: The absorbance values of TGF-β1 and BMP-9 in the hypertrophic nonunion tissues were ± and ±0.0400, respectively; while the absorbance values of TGF-β1 and BMP- 9 in the atrophic nonunion tissues were ± and ±0.0423, respectively, with no significant difference between the two types of tissues (both P>0.05). There was also no significant difference in patients age and bone nonunion time between them (all P>0.05). Conclusion: There is no significant difference in osteogenic potential between the hypertrophic nonunion tissues and the atrophic nonunion tissues. KEY WORDS nonunion; transforming growth factor 1; bone morphogenetic protein-9; immunohistochemistry 尽管大多数骨折都能够治愈, 但骨不连仍为目前骨折治疗的难题之一, 其发病率为 5%~10% [1-2] 目前针对骨不连的治疗, 自体骨移植被认为是治疗的金标准 [3] [4] 但随着医疗水平的进步, 有研究发现 : 仅通过加压固定甚至简单牢靠固定, 大部分肥大性骨不连可达到骨性治愈 ; 在采用骨搬移术治疗萎缩性骨不连时, 即使不暴露骨折端, 加压治疗也能使部分萎缩性骨不连愈合 [5-6] 为什么在不直接处理骨折断端的情况下骨不连也能完全愈合, 其作用机制仍不明确转化生长因子 -β1(transforming growth factory,tgf-β1) 属于 TGF 超家族的一员, 是一种能调节细胞增殖分化的蛋白多肽, 在骨折愈合骨再生和骨重建中发挥重要的作用 [7] [8] 研究表明 : TGF-βl 在骨折愈合过程中的表达时间最长, 可调节软骨细胞和成骨细胞的增殖和分化, 并能诱导骨骼的生长和修复骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein,bmp) 也属于 TGF-β 超家族的一员, 是一种分泌性多功能蛋白, 能够诱导间充质干细胞分化为骨软骨等组织 BMP-9 很早被发现与异位骨化有关, 近年来发现 BMP-9 不仅能够诱导成骨活性, 而且其促成骨能力在 BMP 家族中最强, 这些发现为骨折骨折后骨不连的治疗开拓了新思路 [9] 但在肥大性骨不连和萎缩性骨不连组织中,BMP-9 的表达尚不明确本研究通过对 TGF-β1 和 BMP-9 在人肥大性骨不连和萎缩性骨不连组织中的表达进行测定, 并比较两者在肥大性骨不连和萎缩性骨不连中的表达和成骨潜能, 以丰富不暴露骨折端加压治疗骨不连的理论基础 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂机械性微波炉购自上海三腾仪器有限公司 ; Olympus 高分辨率相机和 Olympus 光学显微镜购自北京 Olympus 中国有限公司 ; 兔抗人 TGF-β1 单克隆抗体兔抗人 BMP-9 单克隆抗体和 SP 二步法免疫组织化学检测试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司 ; 乙二胺四乙酸二钠 (ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA) 和二氨基联苯胺 (diaminobezidin,dab) 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 1.2 临床样本纳入标准 : 具有肥大性或萎缩性骨不连的临床表现, 骨不连时间超过 9 个月, 并且无进一步愈合倾向超过 3 个月选择标准 : 中南大学湘雅二医院和上海交通大学医学院苏州九龙医院骨科序贯入院患者, 其中经临床 X 线检查证实为萎缩性或肥大性骨不连, 术中进一步根据骨痂形成情况确诊排除标准 : 因肿瘤感染代谢性疾病等引起的骨不连, 合并严重的心脑血管及肝肾疾病患者标本收集及处理 : 在患者填写知情同意书的基础上, 收集 2010 年 10 月至 2014 年 3 月在中南大学湘雅二医院和上海交通大学医学院苏州九龙医院骨科治疗患者术中切除的骨不连断端间疤痕组织, 将明显的硬质骨块修整去除, 捻之无沙粒感后, 立即放入 4% 甲醛溶液中固定 24 h, 固定后在低温下保存备用纳入病例基本情况 :2010 年 10 月至 2014 年 3 月, 按照纳入标准共纳入 40 例病例, 其中肥大性骨不连病例 20 例 ( 肥大性骨不连组 ) 萎缩性骨不连

转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 在人骨不连组织中的表达及其临床意义刘春风, 等 51 病例 20 例 ( 萎缩性骨不连组 ) 肥大性骨不连组患者年龄 21.0~55.0(37.5±13.7) 岁, 男 15 例女 5 例 ; 其中胫骨骨不连股骨骨不连肱骨骨不连股骨颈骨不连分别为 9 例 8 例 2 例和 1 例 ; 骨不连时间为 9.0~26.2(19.9±7.

3 转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 在人骨不连组织中的表达及其临床意义刘春风, 等 51 病例 20 例 ( 萎缩性骨不连组 ) 肥大性骨不连组患者年龄 21.0~55.0(37.5±13.7) 岁, 男 15 例女 5 例 ; 其中胫骨骨不连股骨骨不连肱骨骨不连股骨颈骨不连分别为 9 例 8 例 2 例和 1 例 ; 骨不连时间为 9.0~26.2(19.9±7.3) 个月萎缩性骨不连组患者年龄 20.0~51.0(35.3±12.3) 岁, 男 14 例, 女 6 例 ; 其中胫骨骨不连股骨骨不连桡骨骨不连和肱骨骨不连分别为 7 例 5 例 7 例和 1 例 ; 骨不连时间为 9.0~24.7(14.2±9.1) 个月 1.3 方法脱钙和染色按时间顺序编号符合标准的骨不连组织, 放置于新鲜配制的 EDTA 脱钙液 ( 浓度为 15%) 中脱钙, 充分搅拌, 每 4 天更换 1 次 EDTA 液体, 持续 2 周后, 将骨不连组织用清水冲洗干净将经过充分脱钙的骨不连组织浸泡于 95% 乙醇中 2 h, 再浸泡于二甲苯中 40 min 按顺序将脱钙脱水处理后的骨不连组织进行石蜡包埋包埋满意后进行石蜡切片和 HE 染色, 光镜下观察石蜡切片, 确保切片中无骨组织如含有骨组织则重新进行脱钙脱水和包埋, 直至达到实验标准免疫组织化学染色免疫组织化学染色法参照试剂盒产品说明书的操作程序依次进行, 前期处理完成后, 依次进行 3~10 min DAB 显色苏木素轻度复染甘油明胶封片并用显微镜观察, 随机选取 5 个高倍视野进行拍照实验结果判定显微镜下观察并比较两组切片中 TGF-β1 和 BMP-9 表达情况, 其中细胞核或细胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞将拍照获得的图像输入计算机进行储存并行半定量分析 ( 病理图像分析软件 IPP6.0), 根据平均吸光度值 = 单个视野的吸光度值 / 累积阳性面积值, 计算出每个视野的平均吸光度值, 将每组 5 个视野的吸光度值的平均值进行统计学分析 1.4 统计学处理所有数据应用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析, 数据以均数 ± 标准差 (x±s) 表示 TGF-β1 和 BMP-9 在不同年龄段及不同骨不连时间表达的比较采用多个独立样本 Kruskal-Wallis H 检验 ;TGF-β1 和 BMP-9 在萎缩性骨不连组和肥大性骨不连组的组间比较采用 t 检验检验水准为双侧 α=0.05,p<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 光学显微镜下肥大性和萎缩性骨不连组织的形态差异免疫组织化学染色显示 : 肥大性骨不连组和萎缩性骨不连组在光学显微镜下的组织形态没有明显差异, 均含有间充质细胞纤维软骨细胞和透明软骨细胞, 部分切片还有少量骨岛显微镜下观察骨不连组织细胞核和细胞浆中的黄褐色颗粒为 TGF-β1 和 BMP-9 阳性染色部位 ( 图 1) A B C D 图 1 骨不连组织的 TGF-β1 和 BMP-9 免疫组织化学染色 (SP, 100) Figure 1 Positive cells in the nonunion tissues by immunohistochemical staining (SP, 100) A: Expression of TGF-β1 in the hypertrophic nonunion group; B: Expression of TGF-β1 in the atrophic nonunion group; C: Expression of BMP-9 in the hypertrophic nonunion group; D: Expression of BMP-9 in the atrophic nonunion group 2.2 两组 TGF-β1 和 BMP-9 表达的差异肥大性骨不连组和萎缩性骨不连组 TGF-β1 吸光度值分别为 ± 和 ±0.0369, 两组标本 BMP-9 的吸光度值分别为 ± 和 ± 两组 TGF-β1 和 BMP-9 吸光度值差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05)

4 52 中南大学学报 ( 医学版 ), 2018, 43(1) TGF-β1 和 BMP-9 在不同年龄段表达的差异 TGF-β1 在 20~35 岁 36~50 岁和 >50 岁年龄段的吸光度值分别为 ±0.0389,0.3204± 和 ± BMP-9 在 20~35 岁 36~50 岁和 >50 岁年龄段的吸光度值分别为 ±0.0400,0.1323± 和 ± Kruskal-Wallis H 检验表明 :TGF-β1 和 BMP-9 在 3 个年龄段的吸光度值差异均无明显统计学意义 (H=1.781,P>0.05;H=0.823,P>0.05) 2.4 TGF-β1 和 BMP-9 在不同骨不连时间中表达的差异 TGF-β1 在 9~12 月组 13~24 月组和 >24 月组的吸光度值分别为 ±0.0379,0.3245± 和 ± BMP-9 在 9~12 月组 13~24 月组和 >24 月组的吸光度值分别为 ±0.0405,0.1342± 和 ± Kruskal-Wallis H 检验表明 :TGF-β1 和 BMP-9 在 3 个骨不连时间段的吸光度值差异均无明显统计学意义 (H=0.016,P>0.05;H=2.017, P>0.05) 3 讨论目前参与骨折正常愈合的细胞因子的作用机制逐渐被揭示和阐明, 并成为骨折愈合生物调控的研究热点, 如 TGF-β 家族和 BMP 家族但对骨不连组织中细胞因子表达的相关研究却并不多见, 本研究在收集肥大性骨不连和萎缩性骨不连断端间组织标本的基础上, 选取 TGF-β1 和 BMP-9 作为研究指标, 通过比较 TGF-β1 和 BMP-9 在两种骨不连组织中的表达差异, 从而比较两种骨不连断端间组织的成骨潜能的差异 TGF-β 是一种多功能的细胞因子, 包括 5 种不同结构, 广泛分布在各种正常组织及转化细胞中, 在骨组织和血小板中含量最高骨折后,TGF-β 甚至是外源的 TGF-β, 可以刺激成骨细胞而促进骨折修复特别是 TGF-β1 在骨折愈合中的表达时间最长表达量最大, 且贯穿整个愈合过程, 而 TGF-β2 和 TGF-β3 的表达仅在软骨形成期才开始增加因此, 选择 TGF-β1 是反映 TGF-β 家族成骨潜能的最好指标 TGF-β1 主要是由成骨细胞合成分泌, 成骨细胞膜上有其特异性受体,TGF-β1 通过与其特异性受体结合, 激活相关的信号通路, 调节成骨细胞的增殖 [10] 和分化, 进而促进骨形成 Eriksen 等比较了 TGF-β1 mrna 在不同年龄阶段的成骨细胞中表达量的差异, 发现 TGF-β1 mrna 的表达量在年轻人的成骨细胞中要高于老年人, 一定程度上说明了 TGF-β1 分泌量减少会增加老年骨折的风险肥大性和萎缩性骨不连组织的形成不仅与骨的固定和血液供应有关, 也与各种成骨的刺激因素和相关的细胞因子有关 [1-2] 因此, 大部分研究者认为骨不连患者仅需要牢靠的固定和充足的血供就可达到骨性愈合但随着医 [11] 学的不断发展, 越来越多的证据揭示 : 与正常骨折愈合相比, 萎缩性和肥大性骨不连组织中血管数目并无显著差异随着细胞因子研究的不断开展, [12] Zimmermann 等发现 : 血清中 TGF-β1 浓度于骨折后 2 周上升 ; 而发生骨不连患者的血清中 TGF-β1 的浓度在骨折后 4 周左右会显著下降, 充分说明了在骨折愈合过程中 TGF-β1 扮演了很重要的角色, 且相关细胞因子的活性可能是导致骨不连的重要原因之一 BMP 是一种分泌型多功能蛋白, 可调节骨组织中骨的发育和代谢 BMP 已发现约 20 种, 除 BMP-1 外, 其余均为 TGF-β 超家族成员 BMP 能诱导骨形成, 特别是能不可逆地诱导软骨肌肉和血管周围未分化的有活性的间充质细胞分化为软骨细胞和骨细胞 [13] [14] Cheng 等研究发现 BMP 家族在前体间充质细胞和成骨细胞中, BMP-2,4,6,7 和 9 的成骨作用最强, 且在骨折愈合早期的未成熟细胞中均有上调 [15] 现象, 并持续表达于整个骨折愈合过程有学者研究 BMPs 在无胸腺小鼠股四头肌中的成骨能力, 发现 BMP-6 和 BMP-9 能有效地诱导骨形成, 且 BMP-9 的成骨诱导能力最强本研究中, 通过对肥大性和萎缩性骨不连组织进行 TGF-β1 和 BMP-9 免疫组织化学染色, 发现 TGF-β1 和 BMP-9 在两组骨不连组织标本上均有阳性表达, 但差异无统计学意义, 即肥大性和萎缩性骨不连组织中 TGF-β1 和 BMP-9 的表达量基本相当, 这说明肥大性和萎缩性骨不连组织可能具有相同的生物学活性, 与以前认为的两者具有不同的生物学活性的观点相悖, 也进一步证实了肥大性骨不连和萎缩性骨不连的出现与细胞因子 TGF-β1 和 BMP-9 无明显相关在本研究中, 还发现在不同的年龄组和不同的骨不连时间组中,TGF-β1 和 BMP-9 的表达量也没有明显的联系, 说明对于不同年龄段及不同骨不连时间, 其 TGF-β1 和 BMP-9 诱导成骨能力同样无明显差异本研究证实了 TGF-β1 和 BMP-9 在萎缩性骨不连与肥大性骨不连中表达无明显差异, 为临床不暴露骨折端, 加压治疗骨不连提供了一定的理论基础骨不连的治疗, 特别是萎缩性骨不连的治疗, 在牢靠固定的基础上, 可以通过适当刺激骨折端, 诱导激活骨不连组织本身具有的成骨能力, 甚至可以考虑给予骨不连病人外源性细胞因子等办法来提高骨不连的治愈率

5 转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 在人骨不连组织中的表达及其临床意义刘春风, 等 53 参考文献 [1] Deng AD, Innocenti M, Arora R, et al. Vascularized small-bone transfers for fracture nonunion and bony defects[ J]. Clin Plast Surg, 2017, 44(2): [2] Kadhim M, Holmes L Jr, Gesheff MG, et al. Treatment options for nonunion with segmental bone defects: systematic review and quantitative evidence synthesis[ J]. J Orthop Trauma, 2017, 31(2): [3] Maceroli MA, Gage MJ, Wise BT, et al. Risk factors for failure of bone grafting of tibia nonunions and segmental bone defects: anew preoperative risk assessment score[ J]. J Orthop Trauma, 2017, 31 (Suppl 5): S55-S59. [4] Xu J, Jia YC, Kang QL, et al. Management of hypertrophic nonunion with failure of internal fixation by distraction osteogenesis[ J]. Injury, 2015, 46(10): [5] Zhang X, Liu T, Li Z, et al. Reconstruction with callus distraction for nonunion with bone loss and leg shortening caused by suppurative osteomyelitis of the femur[ J]. J Bone Joint Surg Br, 2007, 89(11): [6] Liu T, Zhang X, Li Z, et al. Callus distraction for humeral nonunion with bone loss and limb shortening caused by chronic osteomyelitis[ J]. J Bone Joint Surg Br, 2008, 90(6): [7] Poniatowski ŁA, Wojdasiewicz P, Gasik R, et al. Transforming growth factor beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications[ J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015: [8] Hara Y, Ghazizadeh M, Shimizu H, et al. Delayed expression of circulating TGF-β1 and BMP-2 levels in human nonunion longbone fracture healing[ J]. J Nippon Med Sch, 2017, 84(1): [9] Wang X, Huang J, Huang F, et al. Bone morphogenetic protein 9 stimulates callus formation in osteoporotic rats during fracture healing[ J]. Mol Med Rep, 2017, 15(5): [10] Eriksen CG, Olsen H, Husted LB, et al. The expression of IL-6 by osteoblasts is increased in healthy elderly individual s: stimulated proliferation and differentiation are unaffected by age[ J]. Calcif Tissue Int, 2010, 87(5): [11] Reed AA, Joyner CJ, Brownlow HC, et al. Human atrophic fracture non-unions are not avascular[ J]. J Orthop Res, 2002, 20(3): [12] Zimmermann G, Moghaddam A, Reumann M, et al. TGF-beta-l as a pathophysiological factor in fracture healing[ J]. Unfallchirurg, 2007, 110(2): [13] Barcak EA, Beebe MJ. Bone morphogenetic protein: is there still a role in orthopedic trauma in 2017?[ J]. Orthop Clin North Am, 2017, 48(3): [14] Cheng H, Jiang W, Phillips FM, et al. Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs)[ J]. J Bone Joint Surg Am, 2003, 85(8): [15] Kang Q, Sun MH, Cheng H, et al. Characterization of the distinct orthotopic bone-forming activity of 14 BMPs using recombinant adenovirus-mediated gene delivery[ J]. Gene Ther, 2004, 11(17): ( 本文编辑傅希文 ) 本文引用 : 刘春风, 刘文琦, 刘傥, 刘小平, 王振, 刘进炼, 刘超群. 转化生长因子 β1 和骨形态发生蛋白 -9 在人骨不连组织中的表达及其临床意义 [ J]. 中南大学学报 ( 医学版 ), 2018, 43(1): DOI: /j.issn Cite this article as: LIU Chunfeng, LIU Wenqi, LIU Tang, LIU Xiaoping, WANG Zhen, LIU Jinlian, LIU Chaoqun. Expression of transforming growth factor 1 and bone morphogenetic protein 9 in human nonunion tissues and its clinical significance[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2018, 43(1): DOI: / j.issn

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联