引言本应用简报介绍了利用 Agilent 1200 RRLC 系统和 Agilent 6520 QTOF 质谱仪进行代谢实验的数据采集, 利用 MetID 软件进行计算机辅助的数据分析以药物奈法唑酮非预期代谢物为例, 详细讨论了数据的分析结果同位素分布 ( 图 1 插图中蓝线 ) 清楚地表明该化

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康缆蓝
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1 计算机辅助药物代谢物鉴定第 2 部分 : 奈法唑酮非预期代谢物的鉴定采用 MassHunter 代谢物鉴定软件根据 RRLC QTOF MS 数据鉴定代谢物应用简报药物发现和药物研发过程中的代谢物鉴定作者 Edgar Nägele 安捷伦科技公司瓦尔德布龙, 德国摘要本应用简报介绍了 : 利用 Agilent 1200 快速分离液相色谱 (RRLC) 系统高分离度分离体外代谢实验中得到的代谢物利用 Agilent 6520 QTOF 质谱仪采集用于计算机辅助代谢物鉴定的数据利用 Agilent MassHunter 代谢物鉴定软件高效鉴定非预期代谢物奈法唑酮药物非预期代谢物的代谢物鉴定数据分析结果

2 引言本应用简报介绍了利用 Agilent 1200 RRLC 系统和 Agilent 6520 QTOF 质谱仪进行代谢实验的数据采集, 利用 MetID 软件进行计算机辅助的数据分析以药物奈法唑酮非预期代谢物为例, 详细讨论了数据的分析结果同位素分布 ( 图 1 插图中蓝线 ) 清楚地表明该化合物是一个典型的含氯化合物, 该同位素分布与 m/z 的主离子 (M+H)+(C 25 H 33 Cl) 的计算同位素分布 (CIP, 图 1 插图中的绿框 ) 一致 MS/MS 谱显示 m/z 的主要碎片 (M+H) +, 分子式为 C 15 H 20 ( 图 1) 奈法唑酮(C 25 H 32 Cl) 的 (M+H) + 离子的计算质量与测得值具有较小的相对偏差 -0.35ppm( 图 2), 并且采用 MetID 软件进行预期代谢物的鉴定在我们第一部分的工作中进行了讨论 1 实验部分及方法有关所采用的实验条件和方法的详细信息, 请参阅计算机辅助的奈法唑酮预期代谢物鉴定, 出版物编号 CHCN 结果与讨论为了进行可能代谢物的鉴定, 可从对照样品得到相关的同位素分布 MS/MS 碎裂质量数分布和母体药物奈法唑酮的计算分子式等基本信息 ( 图 1 和图 2) 测得的图 1. 奈法唑酮药物的质谱同位素分析以及碎片离子的 MS/MS 谱归属图 2 奈法唑酮的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 3 奈法唑酮碎裂的 MS/MS 碎片计算分子式和中性丢失计算分子式 2

3 质量数为 (C 15 H 19 ) 的 MS/MS 碎片离子的相对偏差为 -1.26ppm ( 图 3) 该碎片的分子式, 加上计算出的 MS/MS 碎片丢失分子式 C 10 H 13 N 2 Cl, 就与母体药物分子式 C 25 H 32 Cl( 图 3) 相符其他 MS/MS 碎片也可归属到奈法唑酮结构式 ( 图 1) 除了由已知的生物转化反应产生的药物代谢物, 还存在未知代谢反应产生的代谢物, 即非预期代谢物这些非预期代谢物往往来源于原型药物分子, 通过分裂去除原型药物分子结构中的某些部分, 然后由剩余部分经代谢反应产生对奈法唑酮药物来说, 存在多种由这种反应途径产生的代谢物第一个例子是代谢物 7, 该代谢物在约 7.8 分钟洗脱,m/z 测定同位素分布清楚地显示该代谢物为典型的含氯化合物 ( 图 4 插图中的蓝线 ), 且与分子式为 C 23 H 29 Cl 的计算同位素分布一致 (CIP, 图 4 插图中的绿框 ), 相对质量偏差为 1.03ppm( 图 5) 碎片分布匹配 (FMP) 清楚地显示了原型药物的 MS/MS 谱 ( 图 4, 蓝色 ) 和代谢物的 MS/MS 谱 ( 红色 ) 之间的相似性由于非预期的生物转化, 分子离子质量由原型药物质量 m/z 变化为 m/z 该生物转化同时包括失去乙基和氧化成酮 ( 图 4 和图 6) 质量数变化还可从某些 MS/MS 碎片离子观察到例如, 分子式 x MS/MS ( ) MS/MS ( ) 为 C 13 H 15 的 m/z 碎片离子的相对偏差为 -0.82ppm 该碎片离子是由奈法唑酮 MS/MS 碎片 m/z 经总体生物转化 (-C 2 -H 4 +O) 代谢生成的 ( 图 6) 所有 MS/MS 碎片的中性丢失计算分子式与母体药物分子式匹配其它的一些 MS/MS 碎片的分子式信息在图 4 和图 6 中给出 CIP (C23H29N5O3Cl) Compound (7.817 Spectrum ) ( ) 4 - x (M+H) 图 4 奈法唑酮代谢物 7 的质谱同位素分析和 MS/MS 谱碎片离子归属 Cl N N C7H10N3O C5H6N3O2 O O N N N H C11H12N3O C13H16N3O O 图 5 奈法唑酮代谢物 7 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 6 奈法唑酮代谢物 7 碎裂的 MS/MS 碎片计算分子式和中性丢失计算分子式 3

4 代谢物 8 是另一个非预期的含氯代谢物, 测得的同位素分布与含氯母体药物的计算同位素分布 (CIP) 高度一致 ( 图 7) 代谢物 8 的测定质量数为 m/z , 计算分子式为 C 19 H 28 Cl, 相对质量偏差为 ppm( 图 8) 该分子式可能是母体药物羟基化后失去苯基形成的碎片 MS/MS 谱分析也支持该结论 ( 图 7) m/z 的碎片计算分子式为 C 9 H 16, 相对质量偏差为 1.82ppm ( 图 9) 该碎片离子分子式是由 m/z 的奈法唑酮 MS/MS 碎片加两个氢原子和两个氧原子形成的 ( 与第 1 页中的图 1 相比 ) 响应强度排第二的代谢物 8 的 MS/MS 碎片离子的质量数为 m/z , 分子式为 C 7 H 12 (-0.17ppm) 是该碎片失去乙基形成的, 这从另一方面提供了相应支持图 7 裂解奈法唑酮代谢物 8 的质谱同位素分析和 MS/MS 碎片离子归属图 8 裂解奈法唑酮代谢物 8 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 9 裂解奈法唑酮代谢物 8 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 4

5 代谢物 8 进一步氧化形成了代谢物 9 该代谢物的质量数 m/z , 显示了典型的含氯分子的同位素分布 ( 图 10) 代谢物 9 的分子式为 C 19 H 26 Cl, 相对质量偏差为 -2.43ppm( 图 11) MS/MS 谱分析显示响应最强的离子为 m/z , 分子式为 C 9 H 14 (-0.51ppm)( 图 10 和图 12) 与代谢物 8 的 MS/MS 谱中 m/z 处的碎片 (C 9 H 16 ) 相比, 该分子式可解释为羟基氧化为酮的结果响应排第二的离子 m/z , 分子式为 C 7 H 10, 也可这样解释图 10 裂解奈法唑酮代谢物 9 的质谱同位素分析和 MS/MS 碎片离子归属图 11 裂解奈法唑酮代谢物 9 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 12 裂解奈法唑酮代谢物 9 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 5

6 最后, 含氯的低丰度代谢物 10, 在 1.88 分钟洗脱, 具有较低分子量 m/z , 分子式为 C 10 H 13 N 2 OCl(1.02ppm) 也得到了鉴定 ( 图 13 和图 14) 该代谢物来自于母体药物奈法唑酮代谢裂解, 其中右侧部分可得到代谢物 14, 左侧是氯化芳香基侧链 ( 与第 1 页的图 1 和第 10 页的图 25 比较 ) MS/MS 谱图中有两个特征碎片 m/z 和 m/z , 这两个碎片足以鉴定该化合物 ( 图 15) 图 13 裂解奈法唑酮代谢物 10 的质谱同位素分析和 MS/MS 谱碎片离子归属图 14 裂解奈法唑酮代谢物 10 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 15 裂解奈法唑酮代谢物 10 的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 6

7 如果初始裂解反应是复杂的, 且明显改变了同位素分布或 MS/MS 碎片分布, 情况将变得更加复杂对于代谢物 11 而言, 同位素分布表明分子没有氯 ( 图 16) 分子式为 C 19 H 29 的代谢物的相对质量偏差为 -1.35ppm( 图 17) 相对于母体药物分子式 C 25 H 32 Cl, 说明含氯苯基 (C 6 H 4 Cl) 在最初的代谢反应中被裂解去除代谢物 11 的 MS/MS 碎片离子与母体药物的相同 ( 图 16), 但中性丢失碎片却不同 ( 图 18) 例如,m/z 处的碎片离子, 分子式为 C 15 H 19, 与代谢物分子匹配的中性丢失分子式为 C 4 H 10 N 2, 这是失去的哌嗪基团的分子式 ( 图 18) 代谢消除是第一步, 后续还有进一步氧化反应代谢物 12 是代谢物 11 的羟基化反应产物图 16 裂解奈法唑酮代谢物 11 的质谱同位素分析和 MS/MS 谱碎片离子归属图 17 裂解奈法唑酮代谢物 11 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 18 裂解奈法唑酮代谢物 11 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 7

8 代谢产物 12 约 3.4 分钟洗脱,m/z 为 , 计算分子式为 C 19 H 29, 相对质量偏差为 -1.19ppm( 图 19 和图 20) 同位素分布可以清楚地看出这是一个不含氯的化合物 ( 图 19) MS/MS 碎裂质量数分布表明,m/z 处的主峰分子式为 C 15 H 19, 相对质量偏差为 -0.19ppm 该代谢物由于羟基化, m/z 处的 MS/MS 峰更高 ( 图 12, 与代谢产物 2 相比 ) 在 m/z 处, 分子式为 C 6 H 10 ( 相对质量偏差为 -0.69ppm, 图 21) 的代谢物 12 的 MS/MS 碎片是从 m/z 处, 分子式为 C 6 H 10 O ( 相对质量偏差为 -3.91ppm, 图 21) 的代谢物 11 的 MS/MS 碎片离子氧化来的图 19 裂解奈法唑酮代谢物 12 的质谱同位素分析和 MS/MS 谱碎片离子归属图 20 裂解奈法唑酮代谢物 12 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 21 裂解奈法唑酮代谢物 12 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 8

9 代谢物 13 是代谢物 12 的羟基进一步氧化为酮 ( 图 22 和图 23) 的代谢产物代谢物 13 的离子在 m/z ( 图 22) 处的丰度最高, 同位素分布显示不含氯代谢物 13 的分子式为 C 19 H 27 O 8, 相对质量偏差为 -2.31ppm( 图 23) MS/MS 碎裂质量数分布显示 m/z 处的碎片离子分子式为 C 15 H 18, 相对质量偏差为 -3.43ppm 该碎片离子是由哌嗪部分被清除产生的, 由于氧化, 与母体药物的 MS/MS 碎片离子 m/z 相比, 该碎片离子迁移到了更高的质量数 ( 图 24, 与代谢产物 2 相比 ) 代谢产物 13 的主要 MS/MS 碎片离子位于 m/z 处, 相应的离子分子式为 C 7 H 10, 相对质量偏差为 1.78ppm 该碎片是由于进一步失去乙基和苯基产生的进一步的碎裂会形成 m/z 和 m/z 处的碎片离子, 相应的分子式为 C 6 H 8 (0.10ppm) 和 C 5 H 6 (-1.97ppm)( 图 24 和图 22) 图 22 裂解奈法唑酮代谢物 13 的质谱同位素分析和 MS/MS 碎片离子归属图 23 裂解奈法唑酮代谢物 13 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 24 裂解奈法唑酮代谢物 13 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 9

10 不含氯的代谢产物 14, 约 7.2 分钟洗脱, m/z , 分子式为 C 15 H 21, 相对质量偏差为 -3.65ppm( 图 25 和图 26) 该分子式与分子式为 C 19 H 29 的代谢产物 11( 第 7 页的图 16 和图 17) 相比, 区别在于 -C 4 H 8 N 2 +O, 为失去哌嗪部分的羟基化反应提供了证明 MS/MS 碎片离子分布匹配 (FPM) 显示了代谢产物 14 与奈法唑酮 ( 图 25) 的相似性代谢产物 14 可理解为奈法唑酮的 MS/MS 碎片离子 m/z (C 15 H 20 ) 增加一个氧原子和两个氢原子得到的羟基化反应发生的位置可由 m/z 处的新 MS/MS 碎片离子 (C 9 H 16, 相对质量偏差 -0.67ppm)( 图 27) 解释与 m/z 处的奈法唑酮 MS/MS 碎片离子 (C 9 H 14 O)( 第 2 页的图 3) 相比, 该碎片离子增加了 H 2 O 这一推测得到了 m/z (C 7 H 12 O) 和 m/z (C 6 H 10 O) 的两个碎片离子的支持, 这两个碎片离子与奈法唑酮的 MS/MS 碎片离子相同 ( 图 27 和第 2 页的图 3 相比 ) 图 25 裂解奈法唑酮代谢物 14 的质谱同位素分析和 MS/MS 谱碎片离子归属图 26 裂解奈法唑酮代谢物 14 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 27 裂解奈法唑酮代谢物 14 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 10

11 代谢物 14 后续的氧化反应产生了代谢物 15 和 16 两个同分异构体代谢物 15 和 16 的计算分子量均为 , 并且具有典型不含氯化合物的同位素分布 ( 图 28 和第 12 页的图 31) 代谢物 15 在约 7.1 分钟洗脱,m/z 为 , 分子式为 C 15 H 19 O 4, 相对质量偏差为 -3.53ppm ( 图 28 和图 29) 碎片分布匹配(FPM) 表明这种代谢产物分子是由母体药物在 m/z 处的碎片增加两个氧原子形成 ( 图 30) MS/MS 谱在 m/z 处显示的碎片分子式为 C 12 H 16, 相对质量偏差为 -0.68ppm 该碎片与母体药物右侧部分的原子组成相同中性丢失的分子式为 C 3 H 4, 这说明与代谢物 14 ( 第 10 页图 25) 相比, 代谢物 15 在左侧发生了进一步的氧化形成了羧酸 ( 图 28 和图 30) 代谢物 15 的推测结构由另一个碎片离子给出了证据, 该离子的 m/z 为 , 分子式为 C 6 H 10 O( 相对质量偏差为 -3.38ppm), 这与原型药物奈法唑酮 ( 第 1 页图 1) 的碎片离子相同图 28 裂解奈法唑酮代谢物 15 的质谱同位素分析和二级质谱碎片离子归属图 29 裂解奈法唑酮代谢物 15 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 30 裂解奈法唑酮代谢物 15 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 11

12 同分异构代谢物 16 约 7.3 分钟洗脱, 分子式相对质量偏差为 1.77ppm( 图 31 和图 32) 代谢物 16 的碎片分布匹配 (FPM) 表明此代谢产物分子也是由 m/z 处的母体药物碎片增加两个氧原子得到的 ( 图 33), 但其 MS/MS 谱与代谢物 15 不同, 说明它与代谢物 15 的结构不同 m/z 处, 分子式为 C 9 H 14 的碎片离子表明分子左侧加入了两个氧原子, 在苯基 (C 6 H 6 O) 裂解后仍保留在左侧 m/z 处, 分子式为 C 9 H 12 的碎片离子说明失去了一个水分子这说明其中的一个氧原子存在于羟基中 ( 图 31 和图 33) 与代谢产物 15 和奈法唑酮分别在 m/z 和 m/z 处分子式为 C 6 H 10 O 的碎片离子 ( 图 33 和第 2 页的图 3) 相比, m/z 处分子式为 C 5 H 6 ( 相对偏差 4.51ppm) 的碎片离子说明代谢产物 16 中发生了氧化成酮的氧化反应图 31 裂解奈法唑酮代谢物 16 的质谱同位素分析和 MS/MS 谱碎片离子归属图 32 裂解奈法唑酮代谢物 16 的计算分子式质量准确度以及同位素分析图 33 裂解奈法唑酮代谢物 16 碎裂的 MS/MS 碎片离子计算分子式和中性丢失计算分子式 12

13 奈法唑酮的非预期代谢途径药物奈法唑酮在人体中经历了广泛代谢, 不仅产生了典型的预期代谢物, 也产生了通过清除原始药物分子带来的非预期代谢物本文前面所讨论的鉴定到的代谢物列于图 34 中, 简化了非预期代谢产物的可能代谢途径在生成非预期代谢物的代谢反应中, 有可能奈法唑酮分子的骨架首先发生了裂解, 然后在进一步的代谢反应中发生修饰, 也可能第一步生成的预期代谢物发生了裂解反应氧化裂解代谢反应可使奈法唑酮分子的噻唑 -3- 酮部分失去一个乙基, 直接生成非预期代谢物 7 单羟基代谢产物 2 失去苯环可形成代谢物 8 分子中乙基上的羟基进一步氧化代谢形成氧代代谢物 9 另一种代谢途径可能从羟基代谢物 2 开始, 通过消除氯苯基形成代谢物 12 进一步的氧化产生氧代代谢物 13 从单羟基代谢物 2 到代谢物 12 的裂解反应同样适合未改变的奈法唑酮, 可直接产生裂解的代谢物 11 从单羟基代谢物 1 开始, 哌嗪环的裂解形成了羟基氯代谢物 10 该裂解反应也可能产生羟基代谢物 14 非预期代谢产物 14 的进一步氧化代谢反应产生了氧化产物 15, 该代谢物是由伯羟基氧化为羧酸得到的, 这一步氧化代谢反应也可以生成代谢物 16, 该化合物是由于三唑 -3- 酮的乙基侧链氧化为甲基酮得到的图 34 非预期奈法唑酮代谢产物的可能代谢途径 13

14 结论本应用简报解释了 MassHunter 代谢产物鉴定 (MetID) 软件鉴定由非预期生物转化产生的代谢物的结果通过对 QTOF 质谱数据经各种算法 ( 如同位素分布匹配 MS/MS 碎片分布匹配以及基于精确质量 MS 和 MS/MS 测定的分子式计算 ) 所获得的信息进行分析, 确定了代谢物结构本应用简报是通过采用 MetID 软件解释代谢物鉴定实验中得到的 QTOF 数据来提高分析效率的一个实例参考文献 1. Edgar Naegele, 应用简报计算机辅助药物代谢物鉴定第 1 部分 : 奈法唑酮预期代谢物的鉴定, 出版号 CHCN,

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16 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 3 月 1 日, 中国印刷 CHCN

引言 : 新候选药物代谢物的分析是药物发现和开发过程的重要步骤要评价提高该重要领域分析效率的新技术, 通常需要使用众所周知的化合物作为参照药物奈法唑酮 1 就是这样一种能产生大量已知代谢物的化合物, 可用于这一评价研究为了证明 MassHunter MetID 用于可能代谢产物鉴定的有效性,

引言 : 新候选药物代谢物的分析是药物发现和开发过程的重要步骤要评价提高该重要领域分析效率的新技术, 通常需要使用众所周知的化合物作为参照药物奈法唑酮 1 就是这样一种能产生大量已知代谢物的化合物, 可用于这一评价研究为了证明 MassHunter MetID 用于可能代谢产物鉴定的有效性, 计算机辅助药物代谢物鉴定第 1 部分 : 奈法唑酮预期代谢物的鉴定采用 MassHunter 代谢物鉴定软件根据 RRLC QTF MS 数据鉴定代谢产物应用简报药物发现和药物研发过程中的代谢物鉴定作者 Edgar ägele 安捷伦科技公司瓦尔德布龙, 德国摘要本应用简报介绍了 : 利用 Agilent 1200 快速分离液相色谱 (RRLC) 系统高分离度分离体外代谢实验中得到的代谢物