罗丹丹等 : mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 511 nih.gov/blast.cgi) 程序, 分别用人 黑猩猩 牛 小鼠 斑马鱼 原鸡和黑腹果蝇等 7 个模式物种的 mirna 前体序列对其基因组数据库进行搜索 (BLAST Assembled RefSeq Genomes),

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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(5): mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 罗丹丹罗玉萍彭娟李思光 * ( 南昌大学生命科学与食品工程学院, 南昌 ) 摘要 micrornas(mirna) 是真核生物中一类长度约为 21~25 个核苷酸的非编码小分子 RNA, 在转录后水平调控基因的表达 该文在 mirbase 中搜索后生动物的 mir-9 基因序列 47 个物种中共搜索到 120 条 mir-9 基因序列, 说明 mir-9 基因家族广泛存在于不同物种中 基因定位显示 86% 的 mir-9 基因存在于基因间隔区 (IGR), 多序列比对发现 mir-9 基因家族成熟序列的第 2 位到第 8 位碱基以及第 14 位到第 18 位碱基为保守碱基 进化分析表明 mir-9b 和 mir-9c 可能是此基因家族最早出现的基因形式, 即祖先基因 这些祖先基因经过串联重复 大片段重复 个别碱基的缺失及突变等方式形成了脊椎动物中 mir-9-1 至 mir-9-7 数个基因 分别采用四个 mirna 靶基因预测软件对 mmu-mir-9 的靶基因进行预测, 发现 mir-9 与神经系统发育 心肌系统疾病和跨膜运输系统等密切相关 该研究为今后进一步研究 mirna 调控的神经系统发生和神经细胞生长与分化的机制奠定了基础 关键词 mirna-9; 进化 ; 靶基因 mirnas 是一类长度为 20~28 nt 的非编码小分 子 RNA, 通过与靶 mrna 的互补配对而在转录后水 平上负调控基因的表达 [1] mirna 基因以单拷贝 多拷贝和基因簇等多种形式存在于基因组中 成簇 基因之间有的具有同源性, 有的无同源性, 其中串联 基因簇 (tandem cluster) 中的 mirna 一般呈现为协同 表达 [2,3], 暗示着 mirna 基因存在复杂的调控机制 早期的研究认为 mirna 基因主要存在于基因间隔 区, 但近期的研究发现大部分哺乳动物的 mirna 基 因主要定位在转录单位 (transcript units, TUs) [2,4], 且 大多数位于内含子区 不同物种间的同源 mirna 存在高度进化保守 性 如 mir-1 mir-34 mir-87 在无脊椎动物和脊 椎动物中高度保守, 序列比对分析发现这些保守序 [3] 列的碱基差异仅为 1-2 nt Lau 等在美丽新小杆线 虫 (Caenorhabditis elegans) 中发现的 mirna, 85% 在 C. briggsaze 基因组序列中具有同源序列 mirna 在物种间的保守性使其成为探索非编码 RNA 进化规 律的理想分子 已有研究报道, 小鼠和人等哺乳动物中 mir-9 主要在神经组织中表达 [5], 并通过调控 BAF53a [6] stathmin [7] 等基因的表达参与神经细胞的增殖 迁移 等活动 近期研究显示 mir-9 还控制着乳腺肿瘤的 扩散和发展 [8,9], 所以, 对 mir-9 的深入研究不仅利于 揭示其所介导的调控网络, 还将为人类疾病的诊断 和治疗提供全新的视野 本文根据 mirna 的进化 保守性, 通过多序列比对及构建系统进化树的方式 分析 mir-9 基因家族的进化历史 采用 TargetScan PicTar microrna.org 和 MicroCosm Targrts 等四个 mirna 靶基因在线分析软件分析 mir-9 的靶基因 通过 The Gene Ontology Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 和 David 软件分析了靶基因的生物学功 能, 进一步了解 mir-9 在生物体内的角色及其可能的 作用机制 1 材料与方法 1.1 mir-9 序列的获得 从 mirbase( browse.pl) 中下载部分后生动物的 mir-9 基因前体序 列及成熟序列 1.2 几种模式生物的 mir-9 基因定位 采用 NCBI 数据库 BLAST( 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 (No , No ) 资助项目 * 通讯作者 Tel: , siguangli@163.com

2 罗丹丹等 : mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 511 nih.gov/blast.cgi) 程序, 分别用人 黑猩猩 牛 小鼠 斑马鱼 原鸡和黑腹果蝇等 7 个模式物种的 mirna 前体序列对其基因组数据库进行搜索 (BLAST Assembled RefSeq Genomes), 以确定 mir-9 在基因组中 的位置 1.3 系统发生分析 用 Clustal X 1.83 软件对所有已搜索物种的 mir-9 基因的前体序列进行多序列比对分析 (multiple sequence aligment, MSA) 利用 MEGA 4.0 软件采用基 于距离参数的邻接法 (Neighbor-joining, NJ), 并自展 分析 (Bootstrap)1 000 次, 构建各个纲目中模式生物 的系统进化树 1.4 靶基因的预测 以 mmu-mir-9( 小鼠 mir-9) 为研究对象, 通过 TargetScan( PicTar( mouse.cgi?species=mouse) microrna.org( ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/ search.pl) 及 MicroCosm Targrts( enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl) 四个 microrna 靶位点分析软件在线分析 mmu-mir-9 的靶基因, 选取四个软件均能预测到的靶基因作为候选靶基因 通过分析靶基因的功能进一步认识 mmu-mir-9 的生物学功能 1.5 靶基因的功能分析利用 The Gene Ontology( org/) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes( 和 David( gov/) 数据库分析靶基因的生物学功能 2 结果 2.1 mir-9 基因家族及其在基因组中的定位 在 mirbase 中搜索后生动物的 mir-9 基因序列, 在 47 个物种中共搜索到 120 条 mir-9 基因同源序列 其中, 斑马鱼 (Danio rerio) 的序列数量最多, 共 7 条, 原鸡 (Gallus gallus) 大猩猩 (Gorilla gorilla) 飞蝗 (Locusta migratoria) 等只有一条或者两条序列 值得注意的是, 人类 mir-9 在 mirbase 中存在 hasmir-9-1 has-mir-9-2 和 has-mir-9-3 三条序列, 而同为人类近亲的大猩猩 (Gorilla gorilla) 和黑猩猩 (Pan troglodytes) 在 mirbase 数据库中分别只有一条和两条 mir-9 序列 利用 has-mir-9 的前体序列作为查询序 列, 采用 BLAST 程序分别对黑猩猩和大猩猩基因组数据库进行搜索, 发现在黑猩猩 (Pan troglodytes) 中还存在一条 mirbase 中没有收录的 has-mir-9-3 的同源序列, 在大猩猩 (Gorilla gorilla) 中还存在一条 mir- Base 没有收录的 hsa-mir-9-2 的同源序列, mfold 折叠证实这些序列都存在 mirna 前体典型的二级结构, 说明这些物种中还存在目前尚未发现的新的 mir-9 基因 以人 黑猩猩 牛 小鼠 斑马鱼 原鸡和黑腹果蝇等 7 个模式生物 mir-9 前体序列作为查询序列 (Query Sequence), 分别对这些生物的基因组 DNA 进行 BLAST 搜索, 确定各序列在基因组中的位置 ( 表 1) 基因定位显示, 与其它哺乳动物的 mirna 主要定位在内含子区域的情况不同, 86% 的 mir-9 基因家族成员位于基因间隔区 (intergenic region, IGR), 少数位于蛋白编码基因的内含子区域 ; mir-9b mir-9c 两个基因位于同一染色体上, 并与 mir-306 mir-79 紧密相连聚集成簇 ; mir-9a mir-9b 和 mir-9c 主要出现在较低等的模式生物黑腹果蝇中, 而 mir-9-1 至 mir- 9-7 则主要存在于哺乳类 鸟类 鱼类等脊椎动物中 mir-9a mir-9b 和 mir-9c 主要出现在物种进化的早期或低等生物中的现象表明其可能为 mir-9 家族中较原始的基因 2.2 mir-9 基因家族序列分析将 mir-9 基因家族的成熟序列进行多序列比对分析 ( 表 2), 发现为第 2 位到第 8 位碱基以及第 14 位到第 18 位碱基为保守碱基, 说明 mir-9 基因在不同物种间的高度保守性 比对结果显示 mir-9 在其进化过程中可能发生了缺失 : 有的物种在第 9 位缺失了碱基 A/U/G, 有的物种在第 23 位缺失了碱基 A; 大多数物种在第 12 位缺失了碱基 U, 第 24 位缺失了碱基 U 第 9~11 位碱基的相对不保守性可能是因为三个碱基的 [10] 错配结构更有利于其与靶序列的配对 序列比对发现 mir-9 与 mir-9a 的成熟序列相同或只在 3 末端相差一个碱基 A, 但在所有物种的前体序列的相应位置都具有碱基 A, 所以 mir-9 与 mir-9a 可能是相同的 mirna, 只是由于 3 端的 A 容易脱落, 不同研究者在实验中得到了 3 端相差 1 个 A 的两种分子 作为转录后水平调控元件, mirna 成熟序列 5 端的第 2-8 位碱基对于其功能的正常发挥至关重要, 被称为 种子序列 (seed sequence) [10] 种子序列主要通过与目标 mrna 3 UTR 区域的互补配对识别

3 512 研究论文 表 1 mir-9 基因家族在七个物种中的基因位置示意图 Table1 Genomic location of mirna-9 gene family in seven species 物种 mirna 基因名称 染色体 基因位置 Species Name of mirna Chromosome Gene position Homo sapiens has-mir-9-1 Chr I Intron of Clorf61 gene has-mir-9-2 chr5 IGR between MEF2C and TMEM 161B gene has-mir-9-3 chr15 IGR between Loc and Loc gene Pan troglodytes ptr-mir-9-1 chr1 Intron of Clorf61 gene ptr-mir-9-2 chr5 IGR between MEF2C and TMEM 161B gene Ptr-mir-9-3 chr15 IGR between PLOG and LOC gene Mouse mmu-mir-9-1 chr3 Intron of Loc mmu-mir-9-2 chr13 IGR between MEF2C and Loc62324 gene mmu-mir-9-3 chr7 IGR between Plog and Rhcg gene Gallus gallus gga-mir-9-1 chr21 IGR between LOC and LOC gene gga-mir-9-2 chrz IGR between LOC and LOC gene Bos taurus bta-mir-9-1 chr21 IGR between Loc and RHCG gene bta-mir-9-2 chr7 IGR between TMEM1618 and MEF2c gene Danio rerio dre-mir-9-1 chr16 IGR between Rhb9 and Mef 2d gene dre-mir-9-2 chr10 IGR between LOC and Mef2ca gene dre-mir-9-3 chr25 IGR between LOC and Rhc9 gene dre-mir-9-4 chr22 IGR between tmem161a and gata2a gene dre-mir-9-5 chr5 IGR between mef2cb and tmem161b gene dre-mir-9-6 chr7 IGR between Zgc and Kif7 gene dre-mir-9-7 NOT Found Drosophila melanogaster dre-mir-9a chr3l IGR between CG93CO and Sha1gene dre-mir-9b/9c chr21 Intron of Grp gene,and dre-mir-9b/9c clustering together with mir-306 mir-306s mir-79 靶基因, 负调控靶基因的表达 在同源性 mirna 中, 这段序列通常是保守的, 我们的比对结果也证实了这点 mir-9 家族前体序列的同源性分析表明, 人与黑猩猩的同源性为 100%, 人与恒河猴之间的同源性为 85%, 而人与较低等的两栖类 ( 非洲爪蟾 ) 的同源性约为 58%, 与果蝇的同源性只有 39% 可见亲缘关系近的物种之间核苷酸序列差异小, 亲缘关系远的物种之间核苷酸序列差异大 仔细分析 mir-9 的前体序列发现, 序列差异主要发生在 mir-9 前体中成熟序列以外的区域, mirna 成熟序列的区域由于受到选择压力而高度保守 2.3 mir-9 基因家族系统进化树的构建来源于 mirbase 中的 mir-9 基因主要分布在哺乳类 鸟类 鱼类 两栖纲和节肢动物门 线虫纲中 采用 MEGA 4.0 软件, 以这些纲目中的模式物种的 mir-9 序列构建基于距离参数的邻接法 (Neighborjoining, NJ) [11] 构建系统发育进化树 ( 图 1) 图 1 可见, 进化树可分为三支 : mir-9 mir-9b mir-9c 主要分布在紫色球海胆 Capitella sp. I( 线虫纲 ) 果蝇( 节肢动物门 ) 等无脊椎低等生物中, 聚为 第一支 从进化树的分支和距离来看, mir-9 mir- 9b mir-9c 出现在进化早期并持续到现在, 由此可以推测 mir-9 mir-9b mir-9c 可能是 mir-9 基因家族最早出现的基因形式, 即为祖先基因 而且 mir-9b 和 mir-9c 位于同一分支中, 说明它们亲缘关系近 基因定位分析显示 mir-9b 和 mir-9c 聚集成簇, 暗示它们在进化过程中紧密相连 第二支主要是分布在节肢动物门的 mir-9a 及部分环节动物门和线虫门的 mir-9 和 mir-9b 第三分支主要为人 黑猩猩 鱼类 鸟类等脊椎动物的 mir-9 基因家族成员 在这一支中, 除同源性较低 亲缘关系较远的文昌鱼 ( 全索亚门 ) 的 mir-9 单列一小支, 其他物种中的 mir-9-2 mir-9-5 mir-9-6 属同一亚支, 而 mir-9-1 mir-9-3 mir-9-4 mir-9-7 属与之平行进化的另一亚支 分析发现, mir-9b 和 mir-9c 两个拷贝主要出现在无脊椎动物中, mir-9-1 mir-9-2 mir-9-3 mir-9-4 mir-9-5 mir-9-6 和 mir-9-7 主要出现在脊椎动物中, mir-9 和 mir-9a 在脊椎和无脊椎动物中都有分布 根据上述的分析和比对结果, 可以推测 mir- 9c 作为该基因家族最原始的基因存在于线虫纲, 经

4 罗丹丹等 : mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 513 表 2 mir-9 基因家族各成熟序列比对 Table 2 Multiple sequence aligment of mature sequence of mir-9 gene family mirna 名称 成熟序列 碱基数量 mirna 名称 成熟序列 碱基数量 Name of mirna Mature sequence Base Name of Mature sequence Base numeber mirna numeber xtr-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 22 mml-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 ame-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 mml-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 bfl-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 22 mml-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 bfl-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 22 lla-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 bmo-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 age-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 lgi-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 mdo-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 cap-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 mdo-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tca-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 eca-mir-9a-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 lmi-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 eca-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dpu-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 cfa-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tni-mir-9-4 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 cfa-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tni-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 cfa-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tni-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 gga-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tni-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 gga-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 fru-mir-9-4 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tgu-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 fru-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tgu-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 fru-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 xtr-mir-9a-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 fru-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dya-mir-9a-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-7 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA-- 23 dya-mir-9a-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-6 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 aga-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-5 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dan-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-4 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dwi-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 aae-mir-9a-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 aae-mir-9a-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dre-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 der-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 ssc-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dvi-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 ssc-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dsi-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 rno-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dse-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 rno-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dme-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 rno-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dgr-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 spu-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UG-- 22 dpe-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 bta-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UG-- 22 dps-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 bta-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UG-- 22 dmo-mir-9a UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 oan-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UG-- 22 xtr-mir-9a-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 oan-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UG-- 22 xtr-mir-9b UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 mmu-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 sme-mir-9a UCU UUG GUU UU-CUA GCU GUA UGAU 24 sko-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA U sme-mir-9b UCU UUG GUU GU-UUA GCU AUA UGA- 25 mmu-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 ame-mir-9b GCU UUG GUA AU-CUA GCU UUA UGA- 23 mmu-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 bmo-mir-9b GCU UUG GUA AU-CUA GCU UUA UGA- 23 ppy-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 tca-mir-9b GCU UUG GUA AU-CUA GCU UUA UGA- 23 ppy-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 aae-mir-9 UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 ppy-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 aga-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 ptr-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 cqu-mir-9 UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 ptr-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dan-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 hsa-mir-9-3 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 der-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 hsa-mir-9-2 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dgr-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 hsa-mir-9-1 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dme-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 ( 待续 )

5 514 研究论文 ( 续表 2) mirna 名称 成熟序列 碱基数量 mirna 名称 成熟序列 碱基数量 Name of mirna Mature sequence Base Name of Mature sequence Base numeber mirna numeber ggo-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dmo-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 mne-mir-9 UCU UUG GUU AU-CUA GCU GUA UGA- 23 dme-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dpe-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dmo-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dps-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dpe-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dse-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dps-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dvi-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dse-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dwi-mir-9c-1 UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dvi-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dwi-mir-9c-2 UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dwi-mir-9b-1 UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dya-mir-9c UCU UUG GU- AUUCUA GCU GUA GA-- 22 dwi-mir-9b-2 UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 bmo-mir-9c UCU UUG GU- AUCCUA GCU G dya-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 aae-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UGC- 23 aga-mir-9b ACU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dan-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 dgr-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU CUA UG-- 23 der-mir-9b UCU UUG GUG AUUUUA GCU GUA UG-- 23 Clustal consensus * * * * * * * * * * * * 阴影区域表示保守碱基, - 表示碱基缺失 The shadow region represent highly conserved bases, hyphen (-) indicate base delection. 串联重复后形成了紧密相连的 mir-9b mir-9c 基因 簇, 随后经历片段缺失和碱基突变以 mir-9a/9 mir- 9b 的形式存在于节肢动物门和线虫纲等无脊椎动物 中 在由无脊椎动物向脊椎动物进化的过程中 mir- 9/9a 基因可能发生片段重复形成了低等脊椎动物 ( 鱼 纲 ) 中的 mir-9-1 至 mir-9-7 基因 2.4 靶基因的预测 大量的研究表明, 一些 mirna 在转录后水平调 控脑部基因的表达, 而且在神经发育各个阶段都起 着重要的调控作用 mirna 在中枢神经系统的表 达具短暂性和区域性 [12] 如 mir-138 和 mir-124 主 要在中枢神经系统中表达, mir-126 和 mir-29 主要 在星形胶质细胞中表达 据报道 mir-9 是一个组织 特异性的 mirna, 它主要在中后脑交界处 (midbrainhindbrain boundary, MHB) 的邻近区域表达 [13], 可通 过作用于成纤维生长因子 (fibroblast growth factor, Fgf) 信号通路调控 MHB 的组织活性, 而且 mir-9 与 [14] [15,16] 神经发生 心脏肥大 脑部正常发育等具有 密切关系 为进一步了解 mir-9 参与的调控机制及 mirna 作用的新标靶, 本文以小鼠的 mmu-mir-9 基 因为研究对象, 采用 TargetScan PicTar microrna.org 和 MicroCosm Targrts 等四个 microrna 靶位点分析软 件搜索 mmu-mir-9 的靶基因 利用 The Gene Ontology Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 和 David 软件分析四个靶基因软件均能预测到的靶基因 ( 表 3) 的功能, 从而了解 mir-9 在生物体中可能的作用路 径 由 The Gene Ontology 和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 数据库分析可知, mir-9 的靶基 因多数参与新陈代谢 信号转导 跨膜运输和物质 转运等生命活动过程, 与神经细胞 心肌细胞等细 胞的生长和分化密切相关 例如 : nidogen 2 所编码 的巢蛋白是神经干细胞的标志蛋白, Erbb2ip 基因所 编码的 Erbb2 相互作用蛋白是神经干细胞正常生长 所必须的表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR), Slc31a2 所编码的铜离子转运蛋白 对于维持神经系统的正常生理功能非常重要 可见, mir-9 在基因表达调控中具有广泛的作用 Chunnian 等 [17] 曾报道 mir-9 对于神经干细胞的增殖和分 [18] 化具有调控作用, Krichevsky 等在研究胚胎神经干 细胞形成时发现以 mir-9 和 mir-124 为代表在脑部含 量丰富的 mirna, 主要是在神经细胞向神经元的分 化过程中诱导产生的, 而且在神经分化过程中阻断 它们的功能会提升神经干细胞向星形胶质细胞分化 的可能性 这些研究工作也支持本文获得的结果 David 数据库的 Function annotation chart 的数据统计 显示 mmu-mir-9 的候选靶基因中, 与磷酸化和乙酰 化作用相关的基因数量最多, 暗示着 mir-9 与表观调 控路径相关, 为我们研究 mir-9 的功能提供一个新的 切入点

6 罗丹丹等 : mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 515 图 1 MEGA 4.1 软件 NJ 法构建 mir-9 基因家族系统进化树缩写含义 : bfl: 文昌鱼 ; xtr: 爪蟾属 ; gga: 原鸡 ; cfa: 家犬 ; mdo: 短尾猊 ; lla: 绒毛猴属 ; mml: 恒河猴 ; ggo: 大猩猩 ; has: 智人 ; ptr: 黑猩猩属 ; oan: 鸭嘴兽 ; mmu: 小家鼠 ; bta: 欧洲牛 ; ssc: 野猪 ; dre: 斑马鱼 ; spu: 紫色球海胆 ; sko: Saccoglossus kowalevski; dpu: 水蚤属 ; aga: 冈比亚按蚊 ; dpe: 果蝇 ; dvi: 果蝇 ; lmi: 飞蝗 ; tca: 拟谷盗属 ; cap: Capitella sp. I; lgi: Lottia gigantean; sme: Schmidtea mediterranea Fig.1 phylogenetic tree of the mir-9 gene family constructed by MEGA 4.1 software based on Neighbor-joining method Meanings of abbreviations: bfl, Branchiostoma floridae; xtr, Xenopus tropicalis; gga,gallus gallus; cfa,canis familiaris; mdo, Monodelphis domestica; lla, Lagothrix lagotricha; mml, Macaca mulatta; ggo, Gorilla gorilla; has, Homo sapiens; ptr, Pan troglodyte; oan, Ornithorhynchus anatinus; mmu,mus musculus; bta, Bos Taurus; ssc, Sus scrofa; dre, Danio rerio; spu, Strongylocentrotus purpuratus; sko, Saccoglossus kowalevski; dpu, Daphnia pulex; aga, Anopheles gambiae; dpe, Drosophila pseudoobscura; dvi, Drosophila virilis; lmi, Locusta migratoria; tca, Tribolium castaneum; cap, Capitella sp. I; lgi, Lottia gigantean; sme, Schmidtea mediterranea.

7 516 研究论文 表 3 四个靶基因分析软件均能预测到的 mmu-mir-9 靶基因 Table 3 Targets of mmu-mir-9 predicted by four softwares NCBI 序列号 基因名称 编码蛋白所处代谢路径及其功能简介 Acc. No. Name of genes Introduction of gene function NM_ Slc31a2, solute carrier family 31, member 2 Solute transport family of 31, also known as copper ion transport protein, central nervous system existence a high concentration of copper ion (Cu 2+ ), and Cu 2+ play a role in the nerve terminal which can depolarized from the sudden released into the synaptic vesicles contact gap Lamin A, the main component of nuclear lamina, to maintain levels in the nucleus plays a supporting role, as the nuclear membrane and chromatin structure provides support. NM_ Lmna, lamin A Mainly in hypertrophic cardiomyopathy, arrhythmogenic right ventricular NM_ Parg, poly (ADP-ribose) glycohydrolase cardiomyopathy, cardiomyopathy amplification pathway catalytic activity,hydrolyzes poly(adp-ribose) at glycosidic (1''-2') link age of ribose-ribose bond to produce free ADP-ribose., function,poly(adp-ribose) synthesized after DNA damage is only present transiently and is rapidly degraded by poly(adp-ribosegly cohy drolase. Poly(ADP-ribose) metabolism may be required for maintenance of the normal function of neuronal cells., sequence caution, Translated as Met., similarity,belongs to the poly(adp-ribose) glycohy drolase family NM_ Tesk2, testis-specific kinase 2 Testis-specific protein kinase 2, mainly containing N-terminal kinase do main of serine / threonine protein kinase, mainly expressed in testis and prostate NM_ Trim2, tripartite motif protein 2 Tripartite motif protein 2, expression of ihigh levels in the nervous system to maintain its structural plasticity of neurons NM_ Arpc1a, actin related protein 2/3 complex, Actin related protein 2/3 complex and promote microfilament formation of living cells surrounding Mainly involve in FC gamma R-related Shijun effect, adjust the actin cy toskeleton, bacterial metabolic pathways such as epithelial cells infected NM_ Zfp395, zinc finger protein 395 Zinc Finger protein 395, and is closely related to embryonic devlopment and cell differentiation is an important function of a class of transcription factor NM_ Bicc1, bicaudal C homolog 1 (Drosophila) Two-tail-C gene homolog 1, play a role in the head and tail structure, the organ development NM_ Mbc2, membrane bound C2 domain containing Membrane bound C2 domain containing protein protein NM_ Nid2, nidogen 2 Nidogen 2, one of embryonic intermediate filament protein, which is con sidered a marker of neural stem cells NM_ Erbb2ip,Erbb2 interacting protein Erbb2 interacting proteins for epidermal growth factor receptor (epidermal growth factor receptor, EGFR) Mainly involve in NOD-like receptors primarily signal pathway NM_ Cntfr, ciliary neurotrophic factor receptor Ciliary neurotrophic factor receptors, on nerve cell growth, differentiation has obvious nutritional role Mainly involve in cytokines and cytokine receptor interaction pathway, Jak-STAT signaling pathway NM_ Palmd, palmdelphin Palmdelphin, mainly in the brain, the hippocampus, amygdala NM_ A630042L21Rik, RIKEN cdna A630042L21 gene High mobility group box domain containing family of complex 3 NM_ Fbxw2, F-box and WD-40 domain protein 2 F-box and WD-40 domain protein 2 NM_ Ap2m1, adaptor protein complex AP-2, mu1 Adaptor Protein Complex AP-2, μ1 subunit, mainly catalytic, transport protein, protein binding, lipid binding Mainly involve in endocytosis, Huntington disease and other metabolic pathway ( 待续 )

8 罗丹丹等 : mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 517 ( 续表 3) NCBI 序列号 基因名称 编码蛋白所处代谢路径及其功能简介 Acc. No. Name of genes Introduction of gene function NM_ Slc35b3, solute carrier family 35, member B3 Family 35 solute transport, membrane transport protein family member, plays an important role in neural stem cell renewal and neurogenesis NM_ Armcx2,armadillo repeat containing, X-linked 2 Armadillo repeat containing, X-linked 2, a strong signal in embryonic development stage NM_ Map3k1, mitogen activated protein kinase Mitogen-activated protein kinase kinase 1,through the kinase kinase 1 MAPK cascade controlled response system involved in cell proliferation and differentiation, when the vitality out of control will lead to tumor Mainly involve in MAPK signal pathway, ubiquitin-mediated protein degradation, RIG-I-like receptor signaling pathway, neurotrophic factor signaling pathway, GnRH signaling path way and other related NM_ Galnt3,UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine N-acetyl galactose aminotransferase polypeptide, often with the fibro blast growth factor 23 with effect Mainly involve in O-polysaccharide biosynthesis, metabolic pathway NM_ Ap3b1, adaptor-related protein complex 3, Adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit, is mainly catalytic, beta 1 subunit transport protein, protein binding, lipid binding Major metabolic pathways associated with the lysosomal NM_ Lrch4, leucine-rich repeats and calponin homology Leucine-rich repeats and calponin homology (CH) domain containing 4, (CH) domain containing 4 embryonic growth and differentiation of specific receptor NM_ Csnk1a1, casein kinase 1, alpha 1 Casein kinase 1, in the Wnt pathway plays an important role in Mainly involve in Wnt signaling pathway,hedgehog signaling pathway NM_ Igf2bp3, insulin-like growth factor 2, binding Insulin-like growth factor 2, binding protein 3 protein 3 NM_ P14Rik, UPF0279 protein RIKEN cdnna P14 gene C14orf129 homolog. NM_ Brunol4, bruno-like 4, RNA binding protein Bruno-like - Gene 4, RNA binding protein, play a role in alternative splic ing and the target mrna translation and stability 3 讨论 microrna 作为重要的内源性调控基因, 分布 范围广, 参与的生物学过程复杂, 调控靶基因数众 多, 对于生物的正常生长发育至关重要, 在动植物的 进化过程中扮演着重要的角色 mir-9 基因家族在 原口动物和后口动物中分布广泛, 且高度保守, 说 明 mir-9 基因在生物起源和迁移过程中的重要作用 mir-9 基因家族成熟序列的 2-8 位碱基即 种子区域 的保守性为 100%, 暗示其功能的保守性 从低等向 高等进化过程中普遍存在 mir-9 基因家族的调控机 制, 说明 mirna 的调控机制对物种生存的重要性 [19] Maller 等 [20] 在通过分析拟南芥基因组, 发现许 多 mirnas 家族是通过基因组水平上的复制 串联 重复或者大片段复制产生的, 接着再发生时空表达 [21] 的分化 Tanzer 等发现 mir-17 基因簇进化历史伴 随着串联重复 整个基因簇复制以及个别 mirna 的随机缺失, 而且 mir-17 基因家族可能与脊椎动 物的早期进化有关 对于 mir-9 基因的进化分析 显示, mir-9 mir-9b mir-9c mir-9a 基因主要出现 在进化早期, 为祖先基因, 且 mir-9b 和 mir-9c 聚集成 [22] 簇 Hertel 等在后生动物基因组中的 mirna 基因 家族之间的系统发育分析揭示了串联重复和片段 重复是 mirna 基因簇进化的主要机制, 也因此产生 了 mirna 基因簇和 mirna 基因家族的多样性分布 由此推测 mir-9b 和 mir-9c 两个基因在同一染色体上 所形成的基因簇可能是由串联重复所产生的 mir- 9-1 至 mir-9-7 则主要分布在两栖类及哺乳类等较高 等的脊椎动物中, mir-9 基因家族从无脊椎动物向脊 椎动物进化的过程中数量有所增多, 可能发生了串 联重复 大片段重复和个别 mirna 的缺失 所以对 mir-9 的系统进化分析不仅有利于揭示非编码小分 子 RNA 的起源及其作用机制, 还可以增进对物种进

9 518 研究论文 化的了解 Kosik 等 [23] 和 Landgraf 等 [24] 对于 microrna 的研 究显示, mirna 在神经系统中含量丰富, 表达具有组 织特异性和非对称性, 说明 mirnas 在神经系统的特 [5] 定功能中所扮演的重要角色 Monika 等利用原位 杂交技术发现 mir-124 及 mir-9 在神经系统中表达丰 富, mir-9 主要在神经前体细胞和神经元中表达, 它 是神经发育和成脑中所出现的特异性 mirna [25,26] 本文利用生物信息学方法, 在四个 mirna 在线分析 软件中搜索 mir-9 的共同靶基因, 通过 GO 和 KEGG 分析显示 mir-9 基因家族可通过其靶基因作用于多 条代谢路径, 且与神经系统正常发育与生长途径具 有密切关系 所以对于 mir-9 基因家族的靶基因的 预测不仅有利于了解其可能参与的生物学途径, 还 可为以后的实验研究提供理论依据 参考文献 (References) 1 Dennis C. The brave new world of RNA. Nature 2002; 418(6894): Ruvkun G. Molecular biology, glimpses of a tiny RNA world. Science 2001; 294(5543): Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 2001; 294(5543): Rodriguez A, Griffiths-Jones S, Ashurst JL, Bradley A. Identification of mammalian microrna host genes and transcription units. Genome Res 2004; 14(10A): Deo M, Yu JY, Chung KH, Tippens M, Turner DL. Detection of mammalian microrna expression by in situ hybridization with RNA oligonucleotides. Dev Dyn 2006; 235(9): Yoo AS, Staahl BT, Chen L, Crabtree GR. MicroRNA-mediated switching of chromatin-remodelling complexes in neural development. Nature 2009; 460(7255): Delaloy C, Liu L, Lee JA, Su H, Shen F, Yang GY, et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell 2010; 6(4): Ma L, Young J, Prabhala H, Pan E, Mestdagh P, Muth D, et al. mir-9, a MYC/MYCN-activated microrna, regulates E-cadherin and cancer metastasis. Nat Cell Biol 2010; 12(3): Tavazoie SF, Alarcón C, Oskarsson T, Padua D, Wang Q, Bos PD, et al. Endogenous human micrornas that suppress breast cancer metastasis. Nature 2008; 451(7175): Doench JG, Sharp PA. Specificity of microrna target selection in translationalrepression. Genes Dev 2004; 18(5): Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 1987; 4: Wang JF, Zhou H, Chen YQ, Luo QJ, Qu LH. Identification of 20 micrornas from Oryza sativa. Nucleic Acids Res 2004; 32(5): Delaloy C, Gao FB. microrna-9 multitasking near organizing centers. Nat Neurosci 2008; 11: Wang K, Long B, Zhou J, Li PF. mir-9 and NFATc3 regulate myocardin in cardiac hypertrophy. J Biol Chem 2010; 285(16): Zhang Z, Chang H, Li Y, Zhang T, Zou J, Zheng X, et al. MicroRNAs: potential regulators involved in human anencephaly. Int J Biochem Cell Biol 2010; 42(2): Coolen M, Bally-Cuif L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr Opin Neurobiol 2009; 19(5): Zhao C, Sun G, Li S, Shi Y. A feedback regulatory loop involving microrna-9 and nuclear receptor TLX in neural stem cell fate determination. Nat Struct MolBiol 2009; 16(4): Krichevsky AM, Sonntag KC, Isacson O, Kosik KS. Specific micrornas modulate embryonic stem cell-derived neurogenesis. Stem Cells 2006; 24: Massirer KB, Pasquinelli AE. The evolving role of micrornas in animal gene expression. Bioessays 2006; 28: Maher C, Stein L, Ware D. Evolution of Arabidopsis microrna families through duplication events. Genome Res 2006; 16: Tanzer A, Stadler PF. Molecular evolution of a microrna cluster. J Mol Biol 2004; 339: Hertel J, Lindemeyer M, Missal K, Fried C, Tanzer A, Flamm C, et al. The expansionof the metazoan microrna repertoire. BMC Genomics 2006; 7: Kosik KS. The neuronal microrna system. Nat Rev Neurosci 2006; 7(12): Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, Aravin A, et al. A mammalian microrna expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell 2007; 129: Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W, Tuschl T. Identification of tissue-specific micrornas from mouse. Curr Biol 2002; 12: Krichevsky AM, King KS, Donahue CP, Khrapko K, Kosik KS. A microrna array reveals extensive regulation of micrornas during brain development. RNA 2003; 9(10):

10 罗丹丹等 : mirna-9 基因家族进化分析及其靶基因预测 519 Molecular Evolution of mirna-9 Gene Family and Prediction of Their Target Genes Dan-Dan Luo, Yu-Ping Luo, Juan Peng, Si-Guang Li* (College of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang , China) Abstract micrornas are a class of non-coding small RNAs of 21~25 nts in eucaryota, which regulate gene expression at the post-transcriptional level. In this study, we searched mir-9 genes of metazoa in mirbase, and got a total of 120 sequences in 47 species which indicating the extensive existence of mir-9 gene in different species. The analysis of gene localization shown 86% of mir-9 genes locate in the intergenic region(igr). Multiple sequence alignment of mature sequences of mir-9 gene family showed that the second to eighth bases and the fourteenth to eighteenth bases are conservative bases. Phylogenetic analysis revealed mir-9b and mir-9c may be the earliest gene forms of this family, viz. ancestral genes of mir-9 family. These ancestral genes created mir-9-1 to mir-9-7 genes in vertebrate by tandem duplication, larger segment duplication, deletion and mutation of individual bases. Target genes of mmu-mir-9 are predicted by four mirna target gene prediction softwares. The result showed that mir-9 was involved in nervous system development, cardiac diseases and transmembrane transport system. These results contribute to further study on the role of microrna in nervous system development and the mechanism of neural cell growth and differentiation. Key words mirna-9; evolution; target gene Received: October 11, 2011 Accepted: February 25, 2011 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No , No ) *Corresponding author. Tel: , siguangli@163.com