2 综述 1 肠道干细胞 1.1 肠道干细胞来源及其标记分子 干细胞具有维持自身数量并分化为其他类型 细胞的能力 早期由于缺乏有效的干细胞标记方 法, 通常是以直接观察 染料或同位素示踪等方法 探索干细胞的生物学特性 [9], 关于 ISCs 形成了两种 理论模型 : 由 Cheng 等 [10]

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1 :24:33 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2015, 37(11): DOI: /cjcb 肠道干细胞及其干细胞巢 文敏 1,2 贾刚 1* 王康宁 1 赵华 1 ( 1 四川农业大学动物营养研究所, 雅安 ; 2 西藏职业技术学院畜牧兽医系, 拉萨 ) 摘要肠上皮是动物体内更新速度最快的组织之一, 其功能的正常发挥有赖于定植在隐窝底部的肠道干细胞 肠道干细胞周围的细胞构成干细胞巢, 为其提供了支持性微环境 随着肠道干细胞标记分子 谱系示踪技术 类器官培养等技术的进步和完善, 使得人们对于肠道干细胞来源 增殖 分化相关信号通路的认识不断加深 该文就近年来肠道干细胞及其干细胞巢的研究进展进行了简要综述 关键词肠道干细胞 ; 干细胞巢 ; 亮氨酸重复序列 G 蛋白偶联受体 5; Wnt; 类器官 Intestinal Stem Cell and Its Niche Wen Min 1,2, Jia Gang 1 *, Wang Kangning 1, Zhao Hua 1 ( 1 Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Yaan , China; 2 Tibet Vocational Technical College, Lasa , China) Abstract The epithelium of the intestine is one of the most rapidly self-renewing tissue in the body, the function of epithelium depends on the intestinal stem cells (ISCs) who reside at the base of the crypt. The cells surrounding the ISCs constitute a stem cell niche which prove a supporting microenvironment for the ISCs. With the identification of the ISC markers, the advancement of the lineage tracing and the organoid culture, our understanding of the origin and the mechanism regulating the prolifertion and differentiation of the ISCs has been improved. We briefly summarize the recent progresses about the ISCs and its niches in this paper. Keywords intestinal stem cells; niche; Lgr5; Wnt; organoid 肠道担负着消化 吸收 内分泌 防御等功能 肠腔表面覆盖着一层由上皮细胞组成的单细胞层组织 肠上皮, 肠上皮细胞通过折叠形成大量自我 [1] 更新的隐窝 绒毛结构 肠上皮细胞更新速率很快, [2] 小鼠约 5 d 更新一次 维持肠上皮细胞自我更新的细胞增殖发生在隐窝 (crypt of lieberkuhn) 底部, 每个隐窝内含有约 4~6 个活跃肠道干细胞 (intestinal stem cells, ISCs) [3-4] [5], 约 24 h 分裂一次 ; ISCs 产生的子代细胞 过渡扩增细胞 (transit amplifying cells, TA 细胞 ), 约 12 h 分裂一次 ; TA 细胞能在约 6 次的有限分裂过程 中向绒毛顶端不断移行并分化为成熟肠上皮细胞, [6] 以补充肠绒毛顶端的细胞凋亡脱落 干细胞的特性有赖于干细胞内在基因编程以 [7] 及外界信号调控 1978 年, 由 Schofield 最早提出干细胞巢的概念, 他推测是造血干细胞 (haematopoietic stem cells, HSCs) 周围的微环境给予了 HSCs 干细胞特性 肠道干细胞巢 (intestinal stem cell niche) 是隐窝的特化区域, 这个区域能够提供维持 ISCs 的所有因子, 支持 ISCs 的自我更新及分化, 包括了调控 ISCs [8] 命运的所有细胞和非细胞成分 收稿日期 : 接受日期 : 教育部博士点基金和四川省科技支撑计划 ( 批准号 : 2013NZ0054) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , jiagang700510@163.com Received: July 22, 2015 Accepted: August 19, 2015 This work was supported by the Doctoral Foundation of Ministry of Education of China and the Science and Technology Support Program of Sichuan Province (Grant No.2013NZ0054) *Corresponding author. Tel: , jiagang700510@163.com

2 2 综述 1 肠道干细胞 1.1 肠道干细胞来源及其标记分子 干细胞具有维持自身数量并分化为其他类型 细胞的能力 早期由于缺乏有效的干细胞标记方 法, 通常是以直接观察 染料或同位素示踪等方法 探索干细胞的生物学特性 [9], 关于 ISCs 形成了两种 理论模型 : 由 Cheng 等 [10] 提出的 CBC 细胞模型和由 Potten 等 [11] 提出的 +4 位干细胞模型 随着技术的进 步, 转基因小鼠模型 基因芯片 谱系示踪 (lineage tracing) 等技术的应用, 加快了我们对 ISCs 认识的步 伐 Lgr5 标记 CBCs Cheng 等 [12] 发现, 隐窝底 部潘氏细胞 (paneth cells, PCs) 之间嵌布着一类不断 分裂的细胞 隐窝基部柱状细胞 (the crypt base columnar stem cell, CBCs), 同位素标记显示分化上 皮细胞来源于 CBCs [10] Bjerknes 等 [3] 诱导隐窝细胞 进行随机突变, 突变标记的细胞持续分裂能够形成 由隐窝底部延伸向绒毛顶端的克隆条带 (ribbons); 被 标记细胞的克隆寿命或长或短, 与隐窝上存在持续 终身的干细胞和寿命较短的 TA 细胞相吻合 ; 长寿克 隆中包括了各类肠上皮细胞以及至少一个被标记的 CBC 细胞, 这支持 CBCs 可能就是自我更新的 多潜 能干细胞 亮氨酸重复序列 G 蛋白偶联受体 5(leucinerich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Lgr5) 是隐窝增殖信号 Wnt 的靶基因之一, 它被证明 是 CBCs 的标记分子 [5] Baker 等 [5] 利用 Lgr5-EGFPires-CreERT2/R26R-lacZ 转基因小鼠建立了可诱导 的谱系示踪模型 增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein, EGFP) 显示 Lgr5 专一地在 CBCs 中表达, Lgr5 + CBCs 分散嵌布于 PCs 之间 他 莫昔芬 (tamoxifen, TAM) 能诱导 Lgr5 + CBCs 合成的 CreERT2(Cre 重组酶 ) 剪去自身 LacZ(β- 半乳糖苷酶 ) 基因阻遏序列, 使该 Lgr5 + CBCs 及其子代细胞组成 性表达 LacZ; 最开始, LacZ + 细胞只在隐窝底部被观 察到 ; 随着时间延长, LacZ + 细胞形成了由隐窝底部 延伸至绒毛顶端的示踪条带 ; 条带中包括了所有成 熟上皮细胞, 条带中各类上皮细胞所占比例与该类 细胞占肠上皮的比例一致 ; 且这些条带持续终身, 这说明 Lgr5 + CBCs 就是具有自我更新和分化功能的 ISCs [5] Bmi1 标记 +4 位干细胞 Potten 等 [11] 在隐窝底 部 +4 位发现了一类对放射敏感的 DNA 标记滞留细胞 (label-retaining cells, LRCs)( 前三位被 PCs 占据 ), 放射敏感意味着能够防止基因突变的积累, DNA 标记滞留反映有丝分裂停滞, 而上述特性在早期通常被看作干细胞的替代标志, Potten 等由此推测, +4 LRCs 就是 ISCs +4 LRCs 每天分裂, 其标记滞留特性并不反应分裂停滞, 可能是 +4 LRCs 通过非对称分裂将永生 ( 标记的 ) 和新生 ( 非标记 )DNA 链分别分配到干细 [6,13] 胞和 TA 细胞中 但是一直缺乏实验直接证明 +4 LRCs 与其子代细胞之间的关系 Bmi1(bmi1 polycomb ring finger oncogene) 能 [14] 够标记一类位于隐窝底部 +4 位的细胞 不同于 Potten +4 LRCs 的是, Bmi1 + ISCs 数量较少 分裂速 [15] 度缓慢 对于放射损伤不敏感 ; 且 Bmi1 着重标记小鼠小肠近端, 并随着肠道的延伸和标记时间推移逐渐减弱, 暗示肠道中还存在其他非 Bmi1 标记的 ISCs [14] 其他的 CBCs 和 +4 位干细胞标记分子也陆续被 [16-22] 鉴定出来, 但值得注意的是, 不同类型的 ISCs 可能表达同一种标记分子, 这使得关于 ISCs 的研究变 [22-23] 得更为错综复杂 1.2 肠道干细胞可塑性肠道能够在活跃 Lgr5 + ISCs 失去的条件下存活, 这可能与肠道中存在静止的 储备 干细胞或者 TA 细 [24] 胞也具有干细胞潜能有关 给 Lgr5- 白喉毒素受体 (Lgr5-diphtheria toxin re-ceptor, Lgr5-DTR) 转基因小鼠注射白喉毒素 (diphtheria toxin, DT) 剔除 Lgr5 + ISCs 后, 肠道结构 隐窝形态能够维持正常 ; 停止注射 DT 后, Lgr5 + ISCs 再次出现, 谱系示踪表明, 新生 Lgr5 + ISCs 来自于 Bmi1 + ISCs [25] 放射同样能引起 Lgr5 + ISCs 的快速丢失, Bmi1 + ISCs 经放射后快速增殖, 参与肠上皮的 [15] 修复过程 这表明, 相对静止的 Bmi1 + ISCs 可能是一种 ISCs 储备, 在肠上皮受损的情况下补充丢失的 Lgr5 + ISCs [15,25] 此外, +4 位干细胞 Hopx + 细胞 mtert + 细胞也能够在 Lgr5 + ISCs 受损的情况下生成 Lgr5 + [19,26] ISCs, 并分化为成熟上皮细胞, Lgr5 + ISCs 也能生成 +4 位干细胞, 这说明活跃的 Lgr5 + ISCs 和相对静止的 + [20] 4 位 ISCs 之间存在双向转化关系 Dll1(Delta-like 1) 能够标记 Lgr5 + ISCs 的子代分泌型祖细胞, Dll1 + 细胞能够生成短命的分泌型细胞 当 Lgr5 + ISCs 被辐射杀死, Dll1 + 细胞能够去分

3 文敏等 : 肠道干细胞及其干细胞巢 3 化, 生成 Lgr5 + ISCs, 参与到再生过程中去 [27] 隐窝 +3 位有一亚类群 Lgr5 + 细胞具有标记滞留特性, 这类 Lgr5 + LRCs 能同时表达 +4 位干细胞和分泌型祖细胞 的标记分子 ; 它们在生理条件下寿命较短, 研究表 明, 这些 Lgr5 + LRCs 并非 ISCs, 而是 PCs 的祖细胞, 在 肠道损伤的情况下, Lgr5 + LRCs 能够去分化成为具有 增殖能力的 Lgr5 + ISCs [28-29] 1.3 肠道干细胞体外培养生成类器官 单个 ISC 细胞能够被培养生成具有类似肠 上皮结构的类器官 (organoid), 培养基组成包括 R-spondin1(Wnt 激动剂 ) EGF(epidermal growth factor) Noggin(BMP 抑制剂 ) 及 Notch 生长因子 [30-31] Organoid 是由单层细胞组成的类似海胆的组织, 其隐 窝状出芽结构底部定植着 PCs 与 Lgr5 + ISCs, TA 细胞 延伸汇入主要由分化的肠细胞组成的中央空腔 [30] Organoid 自我更新过程与肠道上皮相似, 细胞在隐 窝中增殖 分化 移行最终凋亡后脱落到中央空腔 中 [30] 将由单个 Lgr5 + ISC 培养获得的 organoid 移植 到结肠上皮受损小鼠上, 来自 organoid 的细胞能够形 成形态功能正常的单细胞层上皮组织, 并能形成具 有自我更新功能的隐窝 [32] 这充分体现了 ISCs 的自 我更新和分化特征 1.4 两类肠道干细胞共存 研究表明, 肠道中同时存在活跃的 Lgr5 + ISCs 和相对静止的 +4 位干细胞 [33], 两者具有明显的区别 : (1)Lgr5 + ISCs 分散嵌布于隐窝底部的 PCs 之间, +4 位 干细胞在最顶部 PCs 之上, 平均位置为 +4 位 ; (2) 生理 条件下 Lgr5 + ISCs 较为活跃, 处于持续分裂状态, 而 +4 位干细胞相对静止 [14,19] ; 在 Lgr5 + ISCs 损伤时, +4 位 干细胞强烈增殖, 参与到肠上皮修复中 [15,19] ; (3)Wnt 信号能够刺激 Lgr5 + ISCs 增殖, 而 +4 位干细胞缺乏对 Wnt 信号的反应 [15] 但上述两类 ISCs 又无法完全割裂 : (1) 两类 ISCs 能够表达同一种标记分子 [22-23] ; (2) 在一定条件下二 者之间能够进行相互转化 [19-20,25-26] ; (3)Lgr5 + ISCs 与 +4 位干细胞在体外条件下都具有生成 organoid 的潜 能 [15,22,26] 两类 ISCs 可能在不同生理条件下发挥各 自作用, 共同参与肠上皮细胞稳态的维持 2 肠道干细胞巢肠道干细胞巢并非只是 ISCs 的生存环境, 它是 由干细胞巢细胞提供给 ISCs 存活和发挥功能所需因 [2] 子的支持性微环境 除了提供 ISCs 所需生长因子, 干细胞巢还能参与到不同营养条件下 ISCs 功能的调 [34] 控 2.1 ISC 所处的微环境 [35] Wnt Wnt 是隐窝增殖的首要驱动信号 无 Wnt 配体时, 胞浆中 β-catenin(β- 链蛋白 ) 被 APC(APC destruction complex) 磷酸化后分解 ; 当 Wnt 分子结合到卷曲蛋白受体 (Frizzleds) 及其辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白 5/6(low density lipoprotein receptorrelated protein 5/6, LRP5/6) 后, 抑制 APC 对 β-catenin 磷酸化引起的分解, β-catenin 进入到核内与 Tcf4(Tcell factor transcription factors) 结合, 启动 Wnt/Tcf [36] [2,35] 靶基因转录 ; Wnt 靶基因包括细胞周期素 (cyclin D1) [37] 和原癌基因 (cmyc) [38], 二者均能促进细胞增殖, [39] 敲除 cmyc 能够导致隐窝结构消失 Wnt 对于维持 ISCs 正常增殖具有重要意义, 抑制 Wnt 信号能够迅 [36,40-41] 速引起 TA 细胞的减少和隐窝结构的消失 ; 相反, Wnt 信号的过度激活能够导致 TA 细胞过度增殖 [42-44] 和隐窝的扩大, 甚至肿瘤的发生 由于 Wnt 对于隐窝稳态具有重要作用, 因此机体通过一系列机制将 Wnt 信号维持在一个正常水平 Znrf3(zinc and ring finger 3) 和 Rnf43(homologue ring finger 43) 是跨膜 E3 泛素连接酶 (transmembrane E3 ligases), 它们能够在散乱蛋白 (dishevelled, DVL) 的协助下与 Frizzleds 结合, 引起胞吞从细胞表面 [45-47] 移除, 抑制 Wnt 信号 ; 敲除 Znrf3 和 Rnf43 会引起 Wnt 信号广泛激活以及隐窝的扩大 Znrf3 和 Rnf43 自身是 Wnt 靶基因, 由此构成了 Wnt 信号的负反馈 [48] 回路 最近研究发现, R-spondin 能够与 Lgr4/5 复合物结合后使 Rnf43 和 Znrf3 从细胞表面移除, 防止 [48-49] Frizzleds 被分解, 增强 Wnt 信号 Achaete scute like 2(Ascl2) 是 Wnt 的靶基因, 肠道中 Ascl2 仅在 Lgr5 + ISCs 中表达, 转基因表达 Ascl2 将引起隐窝增生及异位, 敲除 Ascl2 将引起 Lgr5 + ISCs [18] 在几天内消失 最近研究发现, Ascl2 能与 β-catenin 和 Tcf4 结合, 启动 Wnt 靶基因的表达 ; Ascl2 还能结合到其自身基因的启动子上, 促进其表达, 构成自我活化回路 (autoactivation loop) [50] BMP 骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic [51] protein, BMP) 是隐窝生长的负调控因子, 它能够抑制 Wnt/β-catenin 信号 BMP 配体 BMP-2 和 BMP-4 [52] 在肠绒毛间质细胞中表达, BMP 抑制剂 Noggin 也

4 4 综述 [53] 在隐窝间质细胞中表达 转基因表达 Noggin 能够 [52] 抑制 BMP 信号, 导致隐窝的异位形成, 条件性敲除 BMP 受体 BMPr1a 能够引起肠道干细胞的过度增殖 [51] 和隐窝数量的增加 BMP 能够防止一种抑癌基因 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) 磷酸化失活, 保持 PTEN 活力 ; PTEN 能够通过抑制磷脂酰肌醇 -3 激酶 (phosphatidylinositol 3-Kinase, PI3K) 来抑制 Akt 以及其下游信号通路激 [51,54] 活, 限制 β-catenin 活力 EGF EGF 能够调控细胞增殖分化, 肠腔给 [55] 予 EGF 对具有营养功能, 对 ISCs 和祖细胞具有促 [56] 进增殖降低凋亡的功能 EGF 受体属于受体酪氨酸激酶家族成员, 小肠上皮中存在负调控机制限制 EGF 信号 在 EGF 刺激下多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白 1(leucine-rich repeats and immunoglobulinlike domains 1, Lrig1) 的转录和翻译得到增强 ; Lrig1 能够与 EGFR 结合, 随后招募 c-cbl( 一种 E3 泛素连接酶 ) 对 Lrig1 和 EGFR 进行泛素化, 使二者分解 由此 [57] 实现了 Lrig1 对酪氨酸激酶负反馈调节, Lrig1 的移 [21,58] 除将导致隐窝的快速扩大 Notch Notch 参与 ISCs 的增殖及其分化调 [59] 节 Notch 受体和其配体 Dll1 Dll4 是通过细胞之间接触发挥作用, Notch 受体与配体结合后能够在 γ-secretase 的作用下释放出 Notch 胞内片段 (Notch intracellular domain, NICD), NICD 转移到核内与转录因子 CSL 结合引起目标基因的转录, 调控 ISCs 的 [60] 增殖及分化 抑制 Notch 信号会导致所有增殖细 [61-62] 胞向杯状细胞分化 相反, 激活 Notch 信号将会引起隐窝增殖细胞扩增, 并抑制其向分泌型细胞分 [63] 化 Notch 能够激活 Hes1(hairy and enhancer of split 1) 表达, Hes1 随后抑制 Math1 基因转录, 而 Math1 是 ISCs 向分泌型细胞分化的调控者 Hes1 缺失能够增 [64] 加肠道分泌型细胞, 减少肠细胞数量 ; 而 Math1 的 [65] 缺失将导致所有分泌型细胞的缺失 ; Math1 过量表达引起胎鼠肠绒毛变短 TA 细胞减少, 分泌型细胞 [66] 增多以及肠细胞的缺失 PCs 通过表达 Dll1 Dll4 激活 ISCs Notch 信号通路, 抑制 Lgr5 + ISCs 分化为分泌型细胞 ; 由于分裂被挤出隐窝底部的 TA 细胞与 PCs 之间的接触解除, 部分 TA 细胞 Notch 信号关闭, 转而表达 Math1 进入分泌型细胞分化途径, 并为周边 Notch + TA 细胞提供 Dll1 配体 ; 使周边 Notch + TA 细胞保持 Notch 激活状态, 抑制 Math1 表达, 维持 Notch + TA 细胞增殖状态并向肠细 [67] 胞分化 2.2 ISCs 干细胞巢的细胞组成 潘氏细胞 PCs 位于隐窝底部, ISCs 分散嵌 [5] 插于 PCs 之间, 二者紧密接触 PCs 除了能够合成抗菌物质外, 还能够表达 Wnt3 TGF-α EGF 以及 Notch 配体 Dll1 和 Dll4, 几乎涵盖了体外培养维持 [31] ISCs 生长所需的因子 通过转基因手段能够敲除大部分 PCs, 随之而来的是 Lgr5 + ISCs 减少, 但剩下的 Lgr5 + [31] ISCs 均簇拥在余下的 PCs 周围 在体外培养体系中, 约 6% 的 Lgr5 + ISC 能生成 organoid [30] ; 而通过流式细胞仪分拣得到的 Lgr5 + ISC- PC 细胞二聚体约有 25% 能生成 organoid [31], 添加 Wnt3a 能够使单个 Lgr5 + ISC 生成 organoid 的效率提高到 Lgr5 + [31] ISC-PC 二聚体水平 诱导敲除小鼠 organoids Atoh1 基因 (PCs 分化所必需 ), 能够引起 organoids 的生长停滞无法传代 ; 而培养基中补充 Wnt3 能够使 [68] 其正常生长 上述现象表明, PCs 通过分泌 Wnt3 等生长因子参与到干细胞巢的构建当中 肠间充质细胞诱导敲除肠上皮 Wnt3 基因的小鼠肠道形态正常, 表明肠上皮来源的 Wnt3 信号缺失对 ISCs 功能和 Wnt 信号维持没有显著影响, 这可能是由于肠间充质细胞 (intestinal mesenchymal cells) [68] 能够分泌其他 Wnt 分子, 补偿 Wnt3 信号的缺失 敲除 Wnt3 基因的 organoids 在没有 Wnt 配体的培养基中表现出生长受阻 ; 而将其与肠间质细胞培养而来 [68] 的饲养层共培养, 能够正常传代生长, 这表明肠间充质细胞也参与了肠道干细胞巢的构建 Lgr5 + ISCs 细胞与肠上皮下成纤维细胞 (intestinal subepithelial myofibroblasts, ISEMFs) 共培养能够生成比 Lgr5 + ISCs 单独培养大 3.5 倍的 organoid, 且 [69] organoid 上有更多隐窝样结构 ISEMFs 能够在缺乏 R-spondin1 的情况下支持隐窝生成 organoid, 而 R-spondin1 对于体外干细胞培养是必需的, ISEMFs [69] 的作用可能与其高度表达 R-spondin2 有关 同时, [69-70] ISEMFs 还能提供 R-spondins 以外的生长因子 隐窝或单个 ISC 细胞与 ISEMFs 共培养生成的 organoid 溶菌酶的表达量大大提高, 这说明 ISEMFs 还能促进 [69] PCs 分化, 间接地为 ISCs 增殖提供 Wnts 信号来源 条件性敲除肠上皮细胞 ( 包括 PCs) 和平滑肌细胞 ( 包括 ISEMFs) 的 Porcn 基因 (Porcupine, 编码 Wnts

5 文敏等 : 肠道干细胞及其干细胞巢 5 加工必需的酰基转移酶 ), 能够去除这些细胞分泌的 Wnt, 但未能对肠道形态 细胞增殖分化及 Wnt [71] 通路活力造成影响 ; 由此可见, 源于肠上皮以及 ISEMFs 所分泌的 Wnts 对于肠上皮维持是非必需的, 这暗示, 体内可能还存在一类小的细胞亚群或者冗 [71] 余信号来源用以维持生理 Wnt 信号来源 Kabiri [72] 等发现, 肠基质细胞 (intestinal stromal cells) 能够分泌 Wnt 和 R-spondin3, 支持 Porcn 基因敲除 organoids 在无 R-spondin 条件下的生长 ; 但是体内给予 Porcn 抑制剂能够同时影响肠上皮, 平滑肌细胞及肠基质细胞, 减少隐窝 Lgr5 + ISCs 数量, 减缓辐射损伤后的恢复速度 2.3 干细胞巢的稳态调节 PCs 的定位 PCs 是肠道干细胞巢的重要组成部分, 也是唯一一种定植于隐窝底部的成熟肠上皮细胞, 它的准确定位对隐窝形态和功能正常发挥具有重要意义 酪氨酸激酶受体家族成员 EphB 受体 (ephrin type B receptor) 及其配体 EphrinBs 是细胞表面结合分子, 表达 EphB 受体和 EphrinBs 的细胞表现出 [73] 强烈的相互排斥 EphB 在隐窝底部的 PCs 表 [74-75] 达, 其表达受到 Wnt 信号的驱动 ; 而 EphrinB 以沿绒毛到隐窝由高到低的梯度在上皮细胞和 [74,76] TA 细胞中表达, 受到 Wnt 信号的负调节 在 EphB3 / 小鼠上, PCs 不能有效地定植到隐窝底部, 而 [76] 是混杂着其他细胞向绒毛顶端移行 ; 小鼠体内注射 ephrin-b2-fc 重组蛋白同样能阻断 EphB 信号, 引起类似于 EphB3 / [77] 小鼠的 PCs 错位分布 这暗示, PCs 产生 Wnt, 诱导自身产生一个表面受体, 该受体驱使其逆着其他细胞运动轨迹向隐窝底部运动 当增殖中的 TA 细胞被新生细胞机械推动远离隐窝底部时, 这些 TA 细胞接受到的 Wnt 信号降低, EphB 受体表达减少 EphrinB 配体表达提高, 受到 PCs 排斥, 由此 [67] 向上迁移远离隐窝底部 ISC 竞争干细胞区域与 PCs 接触对于维持 Lgr5 + [31] ISCs 特性是必需的 通过对单个 Lgr5 + ISC 的谱系示踪, 发现 ISCs 每天对称分裂, 生成的子细胞竞 [64,78-79] 争由 PCs 组成的有限干细胞巢空间 TAM 能够诱导 Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/R26R- Confetti 转基因小鼠 Lgr5 + ISCs 随机表达四种颜色的荧光蛋白中的一种 如果 ISCs 是非对称分裂, 每次分裂生成一个 ISC 和一个子代 TA 细胞, 理论上单个 隐窝中各色条带的比例将会一致 ; 而实际是, ISCs 呈 对称分裂, 随机生成两个 ISCs 或者两个 TA 细胞, 子 代细胞相互推挤竞争干细胞巢, 随着时间延伸, 隐窝 变成单色的单细胞克隆 [64] Lopez-Garcia 等 [78] 认为, 所有 ISCs 增殖潜力相同, 当某个 ISC 离开干细胞巢能 够通过相邻细胞复制得到补充 ; ISCs 克隆之间相互 推挤, 直到某个克隆占据整个隐窝底部或者被挤出 干细胞巢 干细胞替换速率与细胞分裂速度接近表 明, ISCs 中性竞争和对称分裂对于干细胞稳态维持 具有重要作用 [64,78] 在体显微谱系示踪观察到, 尽管 隐窝中有很多细胞都具有干细胞潜能, 外周的 ISCs 也可能迁回隐窝底部, 只有位于隐窝底部中央区域 的细胞才能长时间保持干细胞特性 [80-81] 3 总结与展望 ISC 从功能上可以分为两类 : 生理条件下的活 跃的 CBCs 和相对静止的参与损伤修复的 +4 位干细 胞, 二者共同发挥作用保证肠道稳态 以 Lgr5 所标 记的 CBCs 是目前最为接受的 ISCs [33] 单个 ISC 离体 培养仍然具有增殖分化活力, 能够生成具有类似肠 上皮结构的 organoid 多种细胞来源的多种信号分 子参与 ISCs 增殖分化调节 单个 ISC 的干细胞潜能 似乎相同, 它们通过对称分裂竞争由 PCs 等细胞组成 的细胞巢, 但位于隐窝底部中央的 ISCs 具有更大的 竞争优势 现有标记分子仍不能从功能上完全区分 ISCs, 各种被标记细胞之间存在一定交集 ; Lgr5 + ISCs 和 +4 位干细胞之间在特定条件下能够进行转换, 哪些信 号分子参与了上述过程仍不明确 ; ISCs 的分化过程 受到多种信号调节, 它们之间是如何形成网络保证 肠上皮稳态 ; 现有干细胞巢对 ISCs 的调控研究大部 分都基于 Lgr5 + ISCs, 干细胞巢对 +4 位干细胞调控作 用的研究还相对薄弱 ; 此外, ISCs 所处环境较为特 殊, 除干细胞巢本身以外, 肠腔 血液 肠道神经和 免疫系统共同作用于 ISCs; 哪些营养成分 生长因 子 抗原物质参与了 ISCs 功能的调控, 继而影响动 物肠道形态与功能, 仍有待于深入研究 参考文献 (References) 1 Barker N, van de Wetering M, Clevers H. The intestinal stem cell. Genes & Dev 2008; 22(14): van der Flier LG, Clevers H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol

6 6 综述 2009; 71: Bjerknes M, Cheng H. Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors. Gastroenterology 1999; 116(1): Kozar S, Morrissey E, Nicholson AM, van der Heijden M, Zecchini HI, Kemp R, et al. Continuous clonal labeling reveals small numbers of functional stem cells in intestinal crypts and adenomas. Cell Stem Cell 2013; 13(5): Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature 2007; 449(7165): Marshman E, Booth C, Potten CS. The intestinal epithelial stem cell. Bioessays 2002; 24(1): Li L, Xie T. Stem cell niche: Structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol 2005; 21: Yeung TM, Chia LA, Kosinski CM, Kuo CJ. Regulation of selfrenewal and differentiation by the intestinal stem cell niche. Cell Mol Life Sci 2011; 68(15): Kretzschmar K, Watt FM. Lineage tracing. Cell 2012; 148(1/2): Cheng H, Leblond C. 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