文 1547 敏等: 肠道干细胞及其干细胞巢 特性 肠道干细胞巢(intestinal stem cell niche)是隐 熟上皮细胞, 条带中各类上皮细胞所占比例与该类 窝的特化区域, 这个区域能够提供维持ISCs的所有 细胞占肠上皮的比例一致; 且这些条带持续终身, 因子, 支持ISCs的自我

Transcription

1 DOI: /cjcb 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2015, 37(11): 综述 肠道干细胞及其干细胞巢 文 敏1,2 贾 刚1* 王康宁1 赵 华1 (1四川农业大学动物营养研究所, 雅安 ; 2西藏职业技术学院, 拉萨 ) 摘要 肠上皮是动物体内更新速度最快的组织之一, 其功能的正常发挥有赖于定植在隐窝 底部的肠道干细胞 肠道干细胞周围的细胞构成干细胞巢, 为其提供了支持性微环境 随着肠道 干细胞标记分子 谱系示踪技术 类器官培养等技术的进步和完善, 使得人们对于肠道干细胞来源 增殖 分化相关信号通路的认识不断加深 该文就近年来肠道干细胞及其干细胞巢的研究进展进 行了简要综述 关键词 肠道干细胞; 干细胞巢; 亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5; Wnt; 类器官 Intestinal Stem Cell and Its Niche Wen Min1,2, Jia Gang1*, Wang Kangning1, Zhao Hua1 (1Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Yaan , China; 2 Tibet Vocational Technical College, Lasa , China) Abstract The epithelium of the intestine is one of the most rapidly self-renewing tissue in the body, the function of epithelium depends on the intestinal stem cells (ISCs) who reside at the base of the crypt. The cells surrounding the ISCs constitute a stem cell niche which prove a supporting microenvironment for the ISCs. With the identification of the ISC markers, the advancement of the lineage tracing and the organoid culture, our understanding of the origin and the mechanism regulating the prolifertion and differentiation of the ISCs has been improved. We briefly summarize the recent progresses about the ISCs and its niches in this paper. Keywords intestinal stem cells; niche; Lgr5; Wnt; organoid 肠道担负着消化 吸收 内分泌 防御等功 胞 过渡扩增细胞(transit amplifying cells, TA细胞), 能 肠腔表面覆盖着一层由上皮细胞组成的单细胞 约12 h分裂一次; TA细胞能在约6次的有限分裂过程 层组织 肠上皮, 肠上皮细胞通过折叠形成大量自我 中向绒毛顶端不断移行并分化为成熟肠上皮细胞, [1] 更新的隐窝 绒毛结构 肠上皮细胞更新速率很快, 以补充肠绒毛顶端的细胞凋亡脱落[6] 小鼠约5 d更新一次[2] 维持肠上皮细胞自我更新的 干细胞的特性有赖于干细胞内在基因编程以 细胞增殖发生在隐窝(crypt of lieberkuhn)底部, 每个 及外界信号调控[7] 1978年, 由Schofield最早提出干 隐窝内含有约4~6个活跃肠道干细胞(intestinal stem 细胞巢的概念, 他推测是造血干细胞(haematopoietic cells, ISCs) stem cells, HSCs)周围的微环境给予了HSCs干细胞, 约24 h分裂一次 ; ISCs产生的子代细 [3-4] [5] 收稿日期: 接受日期: 教育部博士点基金和四川省科技支撑计划(批准号: 2013NZ0054)资助的课题 *通讯作者 Tel: , jiagang700510@163.com Received: July 22, 2015 Accepted: August 19, 2015 This work was supported by the Doctoral Foundation of Ministry of Education of China and the Science and Technology Support Program of Sichuan Province (Grant No.2013NZ0054) *Corresponding author. Tel: , jiagang700510@163.com 网络出版时间: :24:33 URL:

2 文 1547 敏等: 肠道干细胞及其干细胞巢 特性 肠道干细胞巢(intestinal stem cell niche)是隐 熟上皮细胞, 条带中各类上皮细胞所占比例与该类 窝的特化区域, 这个区域能够提供维持ISCs的所有 细胞占肠上皮的比例一致; 且这些条带持续终身, 因子, 支持ISCs的自我更新及分化, 包括了调控ISCs 这说明Lgr5+CBCs就是具有自我更新和分化功能的 命运的所有细胞和非细胞成分[8] ISCs[5] Bmi1标记+4位干细胞 1 肠道干细胞 Potten等[11]在隐窝底 部+4位发现了一类对放射敏感的DNA标记滞留细 1.1 肠道干细胞来源及其标记分子 干细胞具有维持自身数量并分化为其他类型 细胞的能力 早期由于缺乏有效的干细胞标记方 法, 通常是以直接观察 染料或同位素示踪等方法 探索干细胞的生物学特性[9], 关于ISCs形成了两种 胞(label-retaining cells, LRCs)(前三位被PCs占据), 放 射敏感意味着能够防止基因突变的积累, DNA标记 滞留反映有丝分裂停滞, 而上述特性在早期通常被 看作干细胞的替代标志, Potten等由此推测, +4 LRCs 就是ISCs +4 LRCs每天分裂, 其标记滞留特性并不 提出的CBC细胞模型和由 反应分裂停滞, 可能是+4 LRCs通过非对称分裂将永 Potten等 提出的+4位干细胞模型 随着技术的进 生(标记的)和新生(非标记)DNA链分别分配到干细 步, 转基因小鼠模型 基因芯片 谱系示踪(lineage 胞和TA细胞中[6,13] 但是一直缺乏实验直接证明+4 tracing)等技术的应用, 加快了我们对ISCs认识的步 LRCs与其子代细胞之间的关系 理论模型: 由Cheng等 [10] [11] Bmi1(bmi1 polycomb ring finger oncogene) 能 伐 Lgr5标 记CBCs Cheng等[12]发 现, 隐 窝 底 够标记一类位于隐窝底部+4位的细胞[14] 不同于 部潘氏细胞(paneth cells, PCs)之间嵌布着一类不断 Potten +4 LRCs的是, Bmi1+ISCs数量较少 分裂速 分裂的细胞 隐窝基部柱状细胞(the crypt base 度缓慢 对于放射损伤不敏感[15]; 且Bmi1着重标记 columnar stem cells, CBCs), 同位素标记显示分化上 小鼠小肠近端, 并随着肠道的延伸和标记时间推移 [10] [3] 皮细胞来源于CBCs Bjerknes等 诱导隐窝细胞 逐渐减弱, 暗示肠道中还存在其他非Bmi1标记的 进行随机突变, 突变标记的细胞持续分裂能够形成 ISCs[14] 由隐窝底部延伸向绒毛顶端的克隆条带(ribbons); 被 其他的CBCs和+4位干细胞标记分子也陆续被 标记细胞的克隆寿命或长或短, 与隐窝上存在持续 鉴定出来[16-22], 但值得注意的是, 不同类型的ISCs可 终身的干细胞和寿命较短的TA细胞相吻合; 长寿克 能表达同一种标记分子, 这使得关于ISCs的研究变 隆中包括了各类肠上皮细胞以及至少一个被标记的 得更为错综复杂[22-23] CBC细胞, 这支持CBCs可能就是自我更新的 多潜 是 CBCs 的标记分子 [5] Baker 等 [5] 利用 Lgr5-EGFP- 1.2 肠道干细胞可塑性 肠道能够在活跃Lgr5+ISCs失去的条件下存活, 这可能与肠道中存在静止的 储备 干细胞或者TA细 胞也具有干细胞潜能有关[24] 给 Lgr5- 白喉毒素受体 (Lgr5-diphtheria toxin re-ceptor, Lgr5-DTR)转 基 因 小 鼠 注 射 白 喉 毒 素(di- ires-creert2/r26r-lacz转基因小鼠建立了可诱导 phtheria toxin, DT)剔除Lgr5+ISCs后, 肠道结构 隐 的谱系示踪模型 增强型绿色荧光蛋白(enhanced 窝 形 态 能 够 维 持 正 常; 停 止 注 射DT后, Lgr5+ISCs green fluorescent protein, EGFP)显 示Lgr5专 一 地 在 再 次 出 现, 谱 系 示 踪 表 明, 新 生Lgr5+ISCs来 自 于 CBCs中 表 达, Lgr5+CBCs分 散 嵌 布 于PCs之 间 他 Bmi1+ISCs[25] 放 射 同 样 能 引 起Lgr5+ISCs的 快 速 莫 昔 芬(tamoxifen, TAM)能 诱 导Lgr5+CBCs合 成 的 丢失, Bmi1+ISCs经放射后快速增殖, 参与肠上皮的 CreERT2(Cre重组酶)剪去自身LacZ(β-半乳糖苷酶) 修复过程[15] 这表明, 相对静止的Bmi1+ISCs可能 基因阻遏序列, 使该Lgr5+CBCs及其子代细胞组成 是一种ISCs储备, 在肠上皮受损的情况下补充丢失 性表达LacZ; 最开始, LacZ 细胞只在隐窝底部被观 的Lgr5+ISCs[15,25] 此 外, +4位 干 细 胞Hopx+细 胞 察到; 随着时间延长, LacZ+细胞形成了由隐窝底部 mtert+细胞也能够在lgr5+iscs受损的情况下生成 延伸至绒毛顶端的示踪条带; 条带中包括了所有成 Lgr5+ISCs, 并分化为成熟上皮细胞[19,26], Lgr5+ISCs也 能干细胞 亮 氨 酸 重 复 序 列G蛋 白 偶 联 受 体5(leucinerich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Lgr5)是隐窝增殖信号Wnt的靶基因之一, 它被证明 +

3 1548 综述 能生成 +4 位干细胞, 这说明活跃的 Lgr5 + ISCs 和相对 [20] 静止的 +4 位 ISCs 之间存在双向转化关系 Dll1(Delta-like 1) 能够标记 Lgr5 + ISCs 的子代分泌型祖细胞, Dll1 + 细胞能够生成短命的分泌型细胞 当 Lgr5 + ISCs 被辐射杀死, Dll1 + 细胞能够去分化, 生成 Lgr5 + [27] ISCs, 参与到再生过程中去 隐窝 +3 位有一亚类群 Lgr5 + 细胞具有标记滞留特性, 这类 Lgr5 + LRCs 能同时表达 +4 位干细胞和分泌型祖细胞的标记分子 ; 它们在生理条件下寿命较短, 研究表明, 这些 Lgr5 + LRCs 并非 ISCs, 而是 PCs 的祖细胞, 在肠道损伤的情况下, Lgr5 + LRCs 能够去分化成为具有增殖能力的 Lgr5 + ISCs [28-29] 1.3 肠道干细胞体外培养生成类器官单个 ISC 细胞能够被培养生成具有类似肠上皮结构的类器官 (organoid), 培养基组成包括 R-spondin1(Wnt 激动剂 ) EGF(epidermal growth [30-31] factor) Noggin(BMP 抑制剂 ) 及 Notch 生长因子 Organoid 是由单层细胞组成的类似海胆的组织, 其隐窝状出芽结构底部定植着 PCs 与 Lgr5 + ISCs, TA 细胞 [30] 延伸汇入主要由分化的肠细胞组成的中央空腔 Organoid 自我更新过程与肠道上皮相似, 细胞在隐窝中增殖 分化 移行最终凋亡后脱落到中央空腔 [30] 中 将由单个 Lgr5 + ISC 培养获得的 organoid 移植到结肠上皮受损小鼠上, 来自 organoid 的细胞能够形成形态功能正常的单细胞层上皮组织, 并能形成具 [32] 有自我更新功能的隐窝 这充分体现了 ISCs 的自我更新和分化特征 1.4 两类肠道干细胞共存研究表明, 肠道中同时存在活跃的 Lgr5 + ISCs [33] 和相对静止的 +4 位干细胞, 两者具有明显的区别 : (1)Lgr5 + ISCs 分散嵌布于隐窝底部的 PCs 之间, +4 位干细胞在最顶部 PCs 之上, 平均位置为 +4 位 (2) 生理条件下 Lgr5 + ISCs 较为活跃, 处于持续分裂状态, [14,19] 而 +4 位干细胞相对静止 ; 在 Lgr5 + ISCs 损伤时, +4 [15,19] 位干细胞强烈增殖, 参与到肠上皮修复中 (3) Wnt 信号能够刺激 Lgr5 + ISCs 增殖, 而 +4 位干细胞缺 [15] 乏对 Wnt 信号的反应 但上述两类 ISCs 又无法完全割裂 : (1) 两类 ISCs [22-23] 能够表达同一种标记分子 (2) 在一定条件下二 [19-20,25-26] 者之间能够进行相互转化 (3)Lgr5 + ISCs 与 +4 位干细胞在体外条件下都具有生成 organoid 的潜 [15,22,26] 能 两类 ISCs 可能在不同生理条件下发挥各 自作用, 共同参与肠上皮细胞稳态的维持 2 肠道干细胞巢肠道干细胞巢并非只是 ISCs 的生存环境, 它是 由干细胞巢细胞提供给 ISCs 存活和发挥功能所需因 子的支持性微环境 [2] 除了提供 ISCs 所需生长因子, 干细胞巢还能参与到不同营养条件下 ISCs 功能的调 控 [34] 2.1 ISC 所处的微环境 Wnt Wnt 是隐窝增殖的首要驱动信号 [35] 无 Wnt 配体时, 胞浆中 β-catenin(β- 链蛋白 ) 被 APC(APC destruction complex) 磷酸化后分解 ; 当 Wnt 分子结合 到卷曲蛋白受体 (Frizzleds) 及其辅助受体低密度脂蛋 白受体相关蛋白 5/6(low density lipoprotein receptorrelated protein 5/6, LRP5/6) 后, 抑制 APC 对 β-catenin 磷酸化引起的分解, β-catenin 进入到核内与 Tcf4(Tcell factor transcription factors) 结合 [36], 启动 Wnt/Tcf 靶基因转录 [2,35] ; Wnt 靶基因包括细胞周期素 (cyclin D1) [37] 和原癌基因 (cmyc) [38], 二者均能促进细胞增殖, 敲除 cmyc 能够导致隐窝结构消失 [39] Wnt 对于维持 ISCs 正常增殖具有重要意义, 抑制 Wnt 信号能够迅 速引起 TA 细胞的减少和隐窝结构的消失 [36,40-41] ; 相 反, Wnt 信号的过度激活能够导致 TA 细胞过度增殖 和隐窝的扩大, 甚至肿瘤的发生 [42-44] 由于 Wnt 对于 隐窝稳态具有重要作用, 因此机体通过一系列机制 将 Wnt 信号维持在一个正常水平 Znrf3(zinc and ring finger 3) 和 Rnf43(homologue ring finger 43) 是跨膜 E3 泛素连接酶 (transmembrane E3 ligases), 它们能够在散乱蛋白 (dishevelled, DVL) 的协助下与 Frizzleds 结合, 引起胞吞从细胞表面 移除, 抑制 Wnt 信号 [45-47] ; 敲除 Znrf3 和 Rnf43 会引起 Wnt 信号广泛激活以及隐窝的扩大 Znrf3 和 Rnf43 自身是 Wnt 靶基因, 由此构成了 Wnt 信号的负反馈 回路 [48] 最近研究发现, R-spondin 能够与 Lgr4/5 复 合物结合后使 Rnf43 和 Znrf3 从细胞表面移除, 防止 Frizzleds 被分解, 增强 Wnt 信号 [48-49] Achaete scute like 2(Ascl2) 是 Wnt 的靶基因, 肠 道中 Ascl2 仅在 Lgr5 + ISCs 中表达, 转基因表达 Ascl2 将引起隐窝增生及异位, 敲除 Ascl2 将引起 Lgr5 + ISCs 在几天内消失 [18] 最近研究发现, Ascl2 能与 β-catenin 和 Tcf4 结合, 启动 Wnt 靶基因的表达 ; Ascl2 还能结合 到其自身基因的启动子上, 促进其表达, 构成自我活

4 文 1549 敏等: 肠道干细胞及其干细胞巢 化回路(autoactivation loop)[50] BMP 路, 抑制Lgr5+ISCs分化为分泌型细胞; 由于分裂被 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic 挤出隐窝底部的TA细胞与PCs之间的接触解除, 部 protein, BMP)是隐窝生长的负调控因子, 它能够 分TA细胞Notch信号关闭, 转而表达Math1进入分泌 抑 制Wnt/β-catenin信 号 BMP配 体BMP-2和BMP-4 型细胞分化途径, 并为周边Notch+TA细胞提供Dll1 在肠绒毛间质细胞中表达[52], BMP抑制剂Noggin也 配体; 使周边Notch+TA细胞保持Notch激活状态, 抑 在隐窝间质细胞中表达[53] 转基因表达Noggin能够 制Math1表达, 维持Notch+TA细胞增殖状态并向肠细 抑制BMP信号, 导致隐窝的异位形成[52], 条件性敲除 胞分化[67] BMP受体BMPr1a能够引起肠道干细胞的过度增殖 够通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 2.2 ISCs干细胞巢的细胞组成 潘氏细胞 PCs位于隐窝底部, ISCs分散嵌 插于PCs之间, 二者紧密接触[5] PCs除了能够合成 抗菌物质外, 还能够表达Wnt3 TGF-α EGF以及 Notch配 体Dll1和Dll4, 几 乎 涵 盖 了 体 外 培 养 维 持 -3-kinase, PI3K)来抑制Akt以及其下游信号通路激 ISCs生长所需的因子[31] 通过转基因手段能够敲除 活, 限制β-catenin活力[51,54] 大部分PCs, 随之而来的是Lgr5+ISCs减少, 但剩下的 EGF Lgr5+ISCs均簇拥在余下的PCs周围[31] [51] [51] 和隐窝数量的增加 BMP能够防止一种抑癌基因 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)磷酸化失活, 保持PTEN活力; PTEN能 EGF能够调控细胞增殖分化, 肠腔给 予EGF对具有营养功能[55], 对ISCs和祖细胞具有促 在 体 外 培 养 体 系 中, 约6%的Lgr5+ISC能 生 成 进增殖降低凋亡的功能[56] EGF受体属于受体酪氨 organoid[30]; 而通过流式细胞仪分拣得到的Lgr5+ISC- 酸激酶家族成员, 小肠上皮中存在负调控机制限制 PC细 胞 二 聚 体 约 有25%能 生 成organoid[31], 添 加 EGF信号 在EGF刺激下多亮氨酸重复区免疫球蛋 Wnt3a能够使单个Lgr5+ISC生成organoid的效率提高 白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin- 到Lgr5+ISC-PC二聚体水平[31] 诱导敲除小鼠organ- like domains 1, Lrig1)的转录和翻译得到增强; Lrig1 oids Atoh1基因(PCs分化所必需), 能够引起organoids 能够与EGFR结合, 随后招募c-Cbl(一种E3泛素连接 的生长停滞无法传代; 而培养基中补充Wnt3能够使 酶)对Lrig1和EGFR进行泛素化, 使二者分解 由此 其正常生长[68] 上述现象表明, PCs通过分泌Wnt3等 实现了Lrig1对酪氨酸激酶负反馈调节[57], Lrig1的移 生长因子参与到干细胞巢的构建当中 除将导致隐窝的快速扩大[21,58] Notch Notch参与ISCs的增殖及其分化调 的小鼠肠道形态正常, 表明肠上皮来源的Wnt3信号 节 Notch受 体 和 其 配 体Dll1 Dll4是 通 过 细 胞 缺失对ISCs功能和Wnt信号维持没有显著影响, 这可 之间接触发挥作用, Notch受体与配体结合后能够 能是由于肠间充质细胞(intestinal mesenchymal cells) 在γ-secretase的作用下释放出Notch胞内片段(Notch 能够分泌其他Wnt分子, 补偿Wnt3信号的缺失[68] intracellular domain, NICD), NICD转移到核内与转录 敲除Wnt3基因的organoids在没有Wnt配体的培养基 因子CSL结合引起目标基因的转录, 调控ISCs的增殖 中表现出生长受阻; 而将其与肠间质细胞培养而来 [59] 肠间充质细胞 诱导敲除肠上皮Wnt3基因 及分化 抑制Notch信号会导致所有增殖细胞向杯 的饲养层共培养, 能够正常传代生长[68], 这表明肠间 状细胞分化[61-62] 相反, 激活Notch信号将会引起隐 充质细胞也参与了肠道干细胞巢的构建 [60] [63] 窝增殖细胞扩增, 并抑制其向分泌型细胞分化 Lgr5+ISCs细胞与肠上皮下成纤维细胞 (intest- Notch能够激活Hes1(hairy and enhancer of split inal subepithelial myofibroblasts, ISEMFs) 共培养能 1)表达, Hes1随后抑制Math1基因转录, 而Math1是 够生成比Lgr5+ISCs单独培养大3.5倍的organoid, 且 ISCs向分泌型细胞分化的调控者 Hes1缺失能够增 organoid上 有 更 多 隐 窝 样 结 构[69] ISEMFs能 够 在 加肠道分泌型细胞, 减少肠细胞数量[64]; 而Math1的 缺乏R-spondin1的情况下支持隐窝生成organoid, 而 缺失将导致所有分泌型细胞的缺失 ; Math1过量表 R-spondin1对于体外干细胞培养是必需的, ISEMFs 达引起胎鼠肠绒毛变短 TA细胞减少, 分泌型细胞 的作用可能与其高度表达R-spondin2有关[69] 同时, 增多以及肠细胞的缺失[66] ISEMFs还能提供R-spondins以外的生长因子[69-70] 隐 [65] PCs通过表达Dll1 Dll4激活ISCs Notch信号通 窝或单个ISC细胞与ISEMFs共培养生成的organoid

5 综述 1550 溶菌酶的表达量大大提高, 这说明ISEMFs还能促进 TAM 能够诱导 Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/ R26R-Confetti转基因小鼠Lgr5+ISCs随机表达四种 条件性敲除肠上皮细胞(包括PCs)和平滑肌细 颜色的荧光蛋白中的一种 如果ISCs是非对称分 胞(包括ISEMFs)的Porcn基因(Porcupine, 编码Wnts 裂, 每次分裂生成一个ISC和一个子代TA细胞, 理论 加工必需的酰基转移酶), 能够去除这些细胞分泌 上单个隐窝中各色条带的比例将会一致; 而实际是, 的Wnt, 但未能对肠道形态 细胞增殖分化及Wnt ISCs呈对称分裂, 随机生成两个ISCs或者两个TA细 ; 由此可见, 源于肠上皮以及 胞, 子代细胞相互推挤竞争干细胞巢, 随着时间延 ISEMFs所分泌的Wnts对于肠上皮维持是非必需的, 伸, 隐窝变成单色的单细胞克隆[64] Lopez-Garcia 这暗示, 体内可能还存在一类小的细胞亚群或者冗 等[78]认为, 所有ISCs增殖潜力相同, 当某个ISC离开 余信号来源用以维持生理Wnt信号来源[71] Kabiri 干细胞巢能够通过相邻细胞复制得到补充; ISCs克 等 发现, 肠基质细胞(intestinal stromal cells)能够分 隆之间相互推挤, 直到某个克隆占据整个隐窝底部 泌Wnt和R-spondin3, 支 持Porcn基 因 敲 除organoids 或者被挤出干细胞巢 干细胞替换速率与细胞分 在无R-spondin条件下的生长; 但是体内给予Porcn抑 裂速度接近表明, ISCs中性竞争和对称分裂对于干 制剂能够同时影响肠上皮, 平滑肌细胞及肠基质细 细胞稳态维持具有重要作用[64,78] 在体显微谱系示 胞, 减少隐窝Lgr5+ISCs数量, 减缓辐射损伤后的恢 踪观察到, 尽管隐窝中有很多细胞都具有干细胞潜 复速度 能, 外周的ISCs也可能迁回隐窝底部, 只有位于隐 2.3 干细胞巢的稳态调节 PCs的定位 PCs是肠道干细胞巢的重要组 成部分, 也是唯一一种定植于隐窝底部的成熟肠上 皮细胞, 它的准确定位对隐窝形态和功能正常发挥 具有重要意义 酪 氨 酸 激 酶 受 体 家 族 成 员EphB受 体(ephrin type B receptor)及其配体ephrinbs是细胞表面结 合分子, 表达EphB受体和EphrinBs的细胞表现出 强 烈 的 相 互 排 斥 [73] EphB在 隐 窝 底 部 的PCs表 窝底部中央区域的细胞才能长时间保持干细胞特 PCs分化, 间接地为ISCs增殖提供Wnts信号来源 通路活力造成影响 [71] [69] [72] 性[80-81] 3 总结与展望 ISC从功能上可以分为两类: 生理条件下的活 跃的CBCs和相对静止的参与损伤修复的+4位干细 胞, 二者共同发挥作用保证肠道稳态 以Lgr5所标 记的CBCs是目前最为接受的ISCs[33] 单个ISC离体 培养仍然具有增殖分化活力, 能够生成具有类似肠 ; 而EphrinB 上皮结构的organoid 多种细胞来源的多种信号分 以沿绒毛到隐窝由高到低的梯度在上皮细胞和 子参与ISCs增殖分化调节 单个ISC的干细胞潜能 TA细胞 中表达, 受到Wnt信 号的 负 调节 在 似乎相同, 它们通过对称分裂竞争由PCs等细胞组成 EphB3 小鼠上, PCs不能有效地定植到隐窝底部, 而 的细胞巢, 但位于隐窝底部中央的ISCs具有更大的 是混杂着其他细胞向绒毛顶端移行 ; 小鼠体内注 竞争优势 达, 其 表 达 受 到Wnt信 号 的 驱 动 [74-75] [74,76] / [76] 射ephrin-B2-Fc重组蛋白同样能阻断EphB信号, 引 现有标记分子仍不能从功能上完全区分ISCs, 起类似于EphB3 小鼠的PCs错位分布 这暗示, 各种被标记细胞之间存在一定交集; Lgr5+ISCs和+4 PCs产生Wnt, 诱导自身产生一个表面受体, 该受体 位干细胞之间在特定条件下能够进行转换, 哪些信 驱使其逆着其他细胞运动轨迹向隐窝底部运动 当 号分子参与了上述过程仍不明确; ISCs的分化过程 增殖中的TA细胞被新生细胞机械推动远离隐窝底部 受到多种信号调节, 它们之间是如何形成网络保证 时, 这些TA细胞接受到的Wnt信号降低, EphB受体表 肠上皮稳态; 现有干细胞巢对ISCs的调控研究大部 达减少 EphrinB配体表达提高, 受到PCs排斥, 由此 分都基于Lgr5+ISCs, 干细胞巢对+4位干细胞调控作 向上迁移远离隐窝底部[67] 用的研究还相对薄弱; 此外, ISCs所处环境较为特 / [77] ISC竞争干细胞区域 与PCs接触对于维持 殊, 除干细胞巢本身以外, 肠腔 血液 肠道神经和 Lgr5 ISCs特性是必需的 通过对单个Lgr5 ISC的 免疫系统共同作用于ISCs; 哪些营养成分 生长因 谱系示踪, 发现ISCs每天对称分裂, 生成的子细胞竞 子 抗原物质参与了ISCs功能的调控, 继而影响动 + [31] + [64,78-79] 争由PCs组成的有限干细胞巢空间 物肠道形态与功能, 仍有待于深入研究

6 文敏等 : 肠道干细胞及其干细胞巢 1551 参考文献 (References) 1 Barker N, van de Wetering M, Clevers H. The intestinal stem cell. Genes Dev 2008; 22(14): van der Flier LG, Clevers H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol 2009; 71: Bjerknes M, Cheng H. Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors. Gastroenterology 1999; 116(1): Kozar S, Morrissey E, Nicholson AM, van der Heijden M, Zecchini HI, Kemp R, et al. Continuous clonal labeling reveals small numbers of functional stem cells in intestinal crypts and adenomas. Cell Stem Cell 2013; 13(5): Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature 2007; 449(7165): Marshman E, Booth C, Potten CS. The intestinal epithelial stem cell. Bioessays 2002; 24(1): Li L, Xie T. Stem cell niche: Structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol 2005; 21: Yeung TM, Chia LA, Kosinski CM, Kuo CJ. Regulation of selfrenewal and differentiation by the intestinal stem cell niche. Cell Mol Life Sci 2011; 68(15): Kretzschmar K, Watt FM. Lineage tracing. Cell 2012; 148(1/2): Cheng H, Leblond C. Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine V. Unitarian theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat 1974; 141(4): Potten CS, Hume WJ, Reid P, Cairns J. The segregation of DNA in epithelial stem cells. Cell 1978; 15(3): Cheng H, Leblond C. Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine I. Columnar cell. Am J Anat 1974; 141(4): Potten CS, Owen G, Booth D. Intestinal stem cells protect their genome by selective segregation of template DNA strands. J Cell Sci 2002; 115(11): Sangiorgi E, Capecchi MR. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet 2008; 40(7): Yan KS, Chia LA, Li X, Ootani A, Su J, Lee JY, et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(2): van der Flier LG, Haegebarth A, Stange DE, van de Wetering M, Clevers H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology 2009; 137(1): Zhu L, Gibson P, Currle DS, Tong Y, Richardson RJ, Bayazitov IT, et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature 2009; 457(7229): van der Flier LG, van Gijn ME, Hatzis P, Kujala P, Haegebarth A, Stange DE, et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell 2009; 136(5): Montgomery RK, Carlone DL, Richmond CA, Farilla L, Kranendonk ME, Henderson DE, et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mtert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108(1): Takeda N, Jain R, LeBoeuf MR, Wang Q, Lu MM, Epstein JA. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science 2011; 334(6061): Powell AE, Wang Y, Li Y, Poulin EJ, Means AL, Washington MK, et al. The pan-erbb negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell 2012; 149(1): van Landeghem L, Santoro MA, Krebs AE, Mah AT, Dehmer JJ, Gracz AD, et al. Activation of two distinct Sox9-EGFPexpressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. Am J Physiol-Gastr L 2012; 302(10): G Munoz J, Stange DE, Schepers AG, van de Wetering M, Koo BK, Itzkovitz S, et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: Robust expression of proposed quiescent cell markers. EMBO J 2012; 31(14): Li L, Clevers H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science 2010; 327(5965): Tian H, Biehs B, Warming S, Leong KG, Rangell L, Klein OD, et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5- positive cells dispensable. Nature 2011; 478(7368): Norifumi Takeda RJ. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science 2011; 334(6061): van Es JH, Sato T, van de Wetering M, Lyubimova A, Nee AN, Gregorieff A, et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol 2012; 14(10): Roth S, Franken P, Sacchetti A, Kremer A, Anderson K, Sansom O, et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PloS One 2012; 7(6): e Buczacki SJ, Zecchini HI, Nicholson AM, Russell R, Vermeulen L, Kemp R, et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature 2013; 495(7439): Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 2009; 459(7244): Sato T, van Es JH, Snippert HJ, Stange DE, Vries RG, van den Born M, et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 2011; 469(7330): Yui S, Nakamura T, Sato T, Nemoto Y, Mizutani T, Zheng X, et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med 2012; 18(4): Barker N, van Oudenaarden A, Clevers H. Identifying the stem cell of the intestinal crypt: Strategies and pitfalls. Cell Stem Cell 2012; 11(4): Yilmaz OH, Katajisto P, Lamming DW, Gultekin Y, Bauer-Rowe KE, Sengupta S, et al. mtorc1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature 2012; 486(7404): Clevers H, Nusse R. Wnt/beta-catenin signaling and disease. Cell 2012; 149(6): van Es JH, Haegebarth A, Kujala P, Itzkovitz S, Koo BK, Boj SF, et al. A critical role for the Wnt effector Tcf4 in adult intestinal homeostatic self-renewal. Mol Cell Biol 2012; 32(10): Tetsu O, McCormick F. β-catenin regulates expression of cyclin

7 1552 综述 D1 in colon carcinoma cells. Nature 1999; 398(6726): He T-C, Sparks AB, Rago C, Hermeking H, Zawel L, da Costa LT, et al. Identification of c-myc as a target of the APC pathway. Science 1998; 281(5382): Muncan V, Sansom OJ, Tertoolen L, Phesse TJ, Begthel H, Sancho E, et al. Rapid loss of intestinal crypts upon conditional deletion of the Wnt/Tcf-4 target gene c-myc. Mol Cell Biol 2006; 26(22): Pinto D, Gregorieff A, Begthel H, Clevers H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes Dev 2003; 17(14): Fevr T, Robine S, Louvard D, Huelsken J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol 2007; 27(21): Korinek V, Barker N, Morin PJ, van Wichen D, de Weger R, Kinzler KW, et al. Constitutive transcriptional activation by a β-catenin-tcf complex in APC / colon carcinoma. Science 1997; 275(5307): Bienz M, Clevers H. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell 2000; 103(2): Morin PJ, Sparks AB, Korinek V, Barker N, Clevers H, Vogelstein B, et al. Activation of β-catenin-tcf signaling in colon cancer by mutations in β-catenin or APC. Science 1997; 275(5307): Hao HX, Xie Y, Zhang Y, Charlat O, Oster E, Avello M, et al. ZNRF3 promotes Wnt receptor turnover in an R-spondin-sensitive manner. Nature 2012; 485(7397): Koo BK, Spit M, Jordens I, Low TY, Stange DE, van de Wetering M, et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature 2012; 488(7413): Jiang X, Charlat O, Zamponi R, Yang Y, Cong F. Dishevelled promotes Wnt receptor degradation through recruitment of ZNRF3/RNF43 E3 ubiquitin ligases. Mol Cell 2015; 58(3): de Lau W, Peng WC, Gros P, Clevers H. The R-spondin/Lgr5/ Rnf43 module: Regulator of Wnt signal strength. Genes Dev 2014; 28(4): Carmon KS, Gong X, Lin Q, Thomas A, Liu Q. R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/β-catenin signaling. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108(28): Schuijers J, Junker JP, Mokry M, Hatzis P, Koo BK, Sasselli V, et al. Ascl2 acts as an R-spondin/Wnt-responsive switch to control stemness in intestinal crypts. Cell Stem Cell 2015; 16(2): He XC, Zhang J, Tong W-G, Tawfik O, Ross J, Scoville DH, et al. BMP signaling inhibits intestinal stem cell self-renewal through suppression of Wnt-β-catenin signaling. Nat Genet 2004; 36(10): Haramis A-PG, Begthel H, van den Born M, van Es J, Jonkheer S, Offerhaus GJA, et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science 2004; 303(5664): Kosinski C, Li VS, Chan AS, Zhang J, Ho C, Tsui WY, et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(39): Tian Q, He XC, Hood L. Bridging the BMP and Wnt pathways by PI3 Kinase/Akt and ? Cell Cycle 2005; 4(2): Marchbank T, Goodlad RA, Lee CY, Playford RJ. Luminal epidermal growth factor is trophic to the small intestine of parenterally fed rats. Clin Sci 1995; 89(2): Suzuki A, Sekiya S, Gunshima E, Fujii S, Taniguchi H. EGF signaling activates proliferation and blocks apoptosis of mouse and human intestinal stem/progenitor cells in long-term monolayer cell culture. Lab Invest 2010; 90(10): Gur G, Rubin C, Katz M, Amit I, Citri A, Nilsson J, et al. LRIG1 restricts growth factor signaling by enhancing receptor ubiquitylation and degradation. EMBO J 2004; 23(16): Wong VW, Stange DE, Page ME, Buczacki S, Wabik A, Itami S, et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol 2012; 14(4): VanDussen KL, Carulli AJ, Keeley TM, Patel SR, Puthoff BJ, Magness ST, et al. Notch signaling modulates proliferation and differentiation of intestinal crypt base columnar stem cells. Development 2012; 139(3): Ranganathan P, Weaver KL, Capobianco AJ. Notch signalling in solid tumours: A little bit of everything but not all the time. Nat Rev Cancer 2011; 11(5): Milano J, McKay J, Dagenais C, Foster-Brown L, Pognan F, Gadient R, et al. Modulation of notch processing by gammasecretase inhibitors causes intestinal goblet cell metaplasia and induction of genes known to specify gut secretory lineage differentiation. Toxicol Sci 2004; 82(1): van Es JH, van Gijn ME, Riccio O, van den Born M, Vooijs M, Begthel H, et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature 2005; 435(7044): Fre S, Huyghe M, Mourikis P, Robine S, Louvard D, Artavanis- Tsakonas S. Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine. Nature 2005; 435(7044): Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 2010; 143(1): Shroyer NF, Helmrath MA, Wang VY, Antalffy B, Henning SJ, Zoghbi HY. Intestine-specific ablation of mouse atonal homolog 1 (Math1) reveals a role in cellular homeostasis. Gastroenterology 2007; 132(7): VanDussen KL, Samuelson LC. Mouse atonal homolog 1 directs intestinal progenitors to secretory cell rather than absorptive cell fate. Dev Biol 2010; 346(2): Clevers H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell 2013; 154(2): Farin HF, van Es JH, Clevers H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology 2012; 143(6): Lei NY, Jabaji Z, Wang J, Joshi VS, Brinkley GJ, Khalil H, et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One 2014; 9(1): e Fritsch C, Swietlicki EA, Lefebvre O, Kedinger M, Iordanov H, Levin MS, et al. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J Clin Invest 2002; 110(11):

8 文敏等 : 肠道干细胞及其干细胞巢 San Roman AK, Jayewickreme CD, Murtaugh LC, Shivdasani RA. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Rep 2014; 2(2): Kabiri Z, Greicius G, Madan B, Biechele S, Zhong Z, Zaribafzadeh H, et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development 2014; 141(11): Frisén J, Holmberg J, Barbacid M. Ephrins and their Eph receptors: Multitalented directors of embryonic development. EMBO J 1999; 18(19): Sansom OJ, Reed KR, Hayes AJ, Ireland H, Brinkmann H, Newton IP, et al. Loss of Apc in vivo immediately perturbs Wnt signaling, differentiation, and migration. Genes Dev 2004; 18(12): Andreu P, Colnot S, Godard C, Gad S, Chafey P, Niwa-Kawakita M, et al. Crypt-restricted proliferation and commitment to the Paneth cell lineage following Apc loss in the mouse intestine. Development 2005; 132(6): Batlle E, Henderson JT, Beghtel H, van den Born MM, Sancho E, Huls G, et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ ephrinb. Cell 2002; 111(2): Holmberg J, Genander M, Halford MM, Anneren C, Sondell M, Chumley MJ, et al. EphB receptors coordinate migration and proliferation in the intestinal stem cell niche. Cell 2006; 125(6): Lopez-Garcia C, Klein AM, Simons BD, Winton DJ. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science 2010; 330(6005): Schepers AG, Vries R, van den Born M, van de Wetering M, Clevers H. Lgr5 intestinal stem cells have high telomerase activity and randomly segregate their chromosomes. EMBO J 2011; 30(6): Ritsma L, Ellenbroek SI, Zomer A, Snippert HJ, de Sauvage FJ, Simons BD, et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at singlestem-cell level by in vivo live imaging. Nature 2014; 507(7492): Walther V, Graham TA. Location, location, location! The reality of life for an intestinal stem cell in the crypt. J Pathol 2014; 234(1): 1-4.