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1 208 年 2 月第 5 卷第 2 期 Tobacco Science & Technology Dec. 208 Vol. 5 No. 2 NtGGPPS4 基因 RNAi 载体构建与功能分析 李 杨 锋 *2, 王根发, 武明珠, 刘向真 2, 郑庆霞, 刘萍萍, 王燃, 罗朝鹏, 军 **, 魏攀. 中国烟草总公司郑州烟草研究院, 郑州高新技术产业开发区枫杨街 2 号 河南中烟工业有限责任公司技术中心, 郑州市郑东新区榆林南路 6 号 摘要 : 为研究 NtGGPPS4 在合成烟草萜类化合物中的功能, 构建了该基因的 RNAi 表达载体 phellsgate2-ntggpps4, 通过农杆菌介导法进行遗传转化 使用荧光定量 PCR 技术检测转基因烟株中 NtGGPPS4 的表达量, 采用溶剂萃取法从转基因烟株中提取西柏三烯醇和质体色素, 并分别使用 GC-MS LC-MS 测定其含量 结果表明, 在 NtGGPPS4 表达量明显下降的转基因烟株中,α- 西柏三烯二 醇 β- 西柏三烯二醇 新黄质 紫黄质 β- 胡萝卜素 叶绿素 a 叶绿素 b 和叶黄素的含量明显下降 表明 NtGGPPS4 参与调控了烟叶中西柏三烯醇和质体色素的生物合成 关键词 : 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 ; 萜类化合物 ; 西柏三烯醇 ; 质体色素 ;RNAi 中图分类号 :TS43 文献标志码 :A 文章编号 : (208) RNAi vector construction and functional analysis of NtGGPPS4 in Nicotiana tabacum LI Feng, WANG Genfa *2, WU Mingzhu, LIU Xiangzhen 2, ZHENG Qingxia, LIU Pingping, WANG Ran, LUO Zhaopeng, YANG Jun, WEI Pan **. Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC, Zhengzhou 45000, China 2. Technology Center, China Tobacco Henan Industrial Co., Ltd., Zhengzhou , China Abstract:To study the function of NtGGPPS4 in tobacco terpenoid synthesis, phellsgate2-ntggpps4, an RNAi expression vector, was constructed and transferred by Agrobacterium-mediated transformation method. The transcript accumulation of NtGGPPS4 in transgenic tobacco plants was detected by qrt-pcr. α- and β-cembrenediol and plastid pigments in transgenic tobacco plants were extracted by solvent extraction method. And the contents of α- and β-cembrenediol and plastid pigments were determined by GC-MS and LC-MS, respectively. The results showed that the expression level of NtGGPPS4 significantly decreased in transgenic tobacco plants. Comparing with the control, the contents of α- and β-cembrenediol and plastid pigments (neoxanthin, violaxanthin, β-carotene, chlorophyll a, chlorophyll b and lutein) significantly decreased. The results suggested that NtGGPPS4 was involved in the regulation of cembrenediol and plastid pigment biosynthesis in Nicotiana tabacum. Keywords: Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; Terpenoid; Cembrenediol; Plastid pigment; RNA interference (RNAi) 香气质和香气量是评价烟叶质量的重要标 准 增加烟叶香气前体物的含量, 特别是与香气 品质密切相关的萜类化合物, 如类胡萝卜素 二萜 类物质等, 都会提高烟叶香气质和香气量 [] 在 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 郑州烟草研究院科技项目 烟草萜类化合物合成关键基因 Ntggpps 功能分析和调控机制研究 (90202CZ340) 作者简介 : 李锋 (979 ), 博士, 高级工程师, 主要从事烟草分子生物学研究 likite2002@63.com; * 共同第一作者 : 王根发 (979 ), 本科, 工程师, 主要从事烟叶原料研究及原料质量控制管理 hnzywanggf@26.com; ** 通信作者 : 魏攀, weipan83@26.com 引文格式 : 李锋, 王根发, 武明珠, 等. NtGGPPS4 基因 RNAi 载体构建与功能分析 [J].,208,5(2):0-4.(LI Feng, WANG Genfa, WU Mingzhu, et al. RNAi vector construction and functional analysis of NtGGPPS4 in Nicotiana tabacum[j]. Tobacco Science & Technology, 208, 5(2):0-4.)DOI:0.635/j.issn

2 第 5 卷第 2 期 李锋, 等 :NtGGPPS4 基因 RNAi 载体构建与功能分析 高等植物体内, 牻牛儿基焦磷酸合酶 (GPPS) 催化 分子二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP) 和 分子异 戊烯基焦磷酸 (IPP) 缩合形成 分子牻牛儿基二磷 酸 (GPP), 然后在单萜烯合酶的作用下形成单萜 类化合物 法呢基焦磷酸合酶 (FPPS) 催化 分子 DMAPP 和 2 分子 IPP 生成法呢基焦磷酸 (FPP), 然 后在倍半萜烯酶的作用下生成倍半萜类化合物 最后牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (GGPPS) 催化 分子 DMAPP 和 分子 FPP( 或 3 分子 IPP) 生成 分子牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 (GGPP) [2] GGPP 是高等植物中二萜 类胡萝卜素 生育酚 脱落酸 赤霉素 质醌 叶绿醌以及橡胶等多萜合成的共同 前体物 [3] 因此, 研究 GGPPS 的基因功能对调控 植物体内萜类化合物的含量具有重要作用 [4] Kuntz 等最早从辣椒中克隆出编码 GGPPS 的 [5] 基因, 随后 Scolnik P A 等在拟南芥中也克隆出 [6] 了该基因 Okada 等对拟南芥 GGPPS 基因家族 的组织特异性进行分析, 发现所有 GGPPS 基因在 [7] 拟南芥中都呈特异性表达 Zhu 等在拟南芥中 克隆到一个新的 GGPPS6 基因, 该基因定位在线粒 体内 在前期研究中, 本课题组从普通烟草中克 隆到 NtGGPPS4, 编码 372 个氨基酸, 定位于线粒 体, 在茎中高量表达 [8] 为进一步明确 NtGGPPS4 的功能, 构建 NtGGPPS4-RNAi 表达载体并转化普 通烟草, 获得 NtGGPPS4-RNAi 转基因株系, 检测了 转基因株系中萜类物质和色素的变化, 旨在为烟 草育种提供遗传材料 材料与方法. 材料和试剂 栽培烟草品种中烟 00 种植于国家烟草基因 研究中心温室中, 种植条件为温度 (23±), 相对 湿度 (60±2)%, 光照培养 6 h, 黑暗培养 8 h 2 SYBR Green qpcr Mix GenePure HiPure Plasmid Mini Kit SuperPure Plus Plantpoly RNA Kit GenePure Gel Purification Kit GenePure Neway Plant Genomic DNA Kit 感受态细胞 DH5α 和 DnaseⅠ 均购自北京密码子生物科技有限公司 ;SuperScript IV 反转录酶购自赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 ; pmd9-t Vector 和 T4 DNA Ligase 购自北京艾德莱生物科技有限公司 ;Trans2K DNA Marker 和 High-Fidelity DNA Polymerase 购自北京全式金生物技术有限公司 ;DL2 000 DNA Marker 购自上海安妍生物有限公司 其他试剂均为进口分装或国产分析纯 引物合成和测序由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司完成.2 方法.2. RNAi 载体的构建根据 NtGGPPS4 基因编码区序列设计 RNAi 片段 (33 bp) 的引物,RNAi 引物序列见表 通过 Gateway 重组技术, 利用植物表达载体 phellsgate2 [8] 构建烟草 RNAi 载体 以 T-NtGGPPS4 质粒为模板, 用 RNAi 引物进行扩增 扩增条件 :95 预变性 3 min;95 变性 30 s,60 退火 30 s,72 延伸 30 s,35 个循环 ;72 延伸 0 min;6 保温 0 min % 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 胶回收目的条带, 与 phellsgate2 载体进行重组反应 25 重组 3 h 后, 加入 μl 蛋白酶 K,37 水浴 0 min 终止反应 取 μl 反应混合液转化感受态细胞 DH5α, 菌落 PCR 鉴定阳性克隆 提取阳性克隆的质粒, 酶切验证后, 将其送至生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序 把测序正确的 NtGGPPS4-RNAi 质粒转化农杆菌感受态细胞 GV30, 对阳性克隆进行扩繁培养, 转化烟草.2.2 烟草的遗传转化利用农杆菌介导法转化栽培烟草中烟 00 先把状态良好的中烟 00 叶片切割成正方形 (0.5~.0 cm 2 ), 在培养好的农杆菌菌液中浸泡.5 min 然后将叶片取出, 吸干表面多余菌液, 平放在 MS 固体培养基上暗培养 (28 ),2 d 后转移到 MS 分 名称 Nt4-RNAi-F Nt4-RNAi-R Nt4-qF Nt4-qR L25-F L25-R 注 : 下划线区域为 attb 接头 Tab. 表 序列 (5' 3') GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTATTTGGCGAAAATGTCACTG GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTACACTGAGAGAACTTTCTGAGTCT GGCTTGAATGCTTGTTCCTCAG AAGGCTCTTACTTTTGGGAGGA CCCCTCACCACAGAGTCTGC 引物序列 Primer sequences AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT

3 2 208 年 化培养基 Kan+ 上分化培养 待其分化后转移到生 根培养基上培养至生根 最后转移到带有基质的 花盆中继续培养 直至开花结果 采摘成熟种子.2.3 转基因阳性植株的鉴定 当 NtGGPPS4-RNAi 转基因烟株在培养瓶中生 长到 3~4 片真叶时 移栽至花盆中 在光照培养箱 中继续生长 6~7 片真叶时 分别取 0 株生长良 好的转基因烟株叶片 液氮速冻 提取 RNA 并反 转录成 cdna 以烟草 L25 基因为内参基因 利用 荧 光 定 量 PCR 检 测 转 基 因 烟 株 中 NtGGPPS4 基 因 的 表 达 量 qrt-pcr 引 物 见 表 qrt-pcr 反 应 程序 94 预变性 30 s 94 变性 5 s 60 退火 M. Trans2K DNA Marker. 菌落 PCR 产物 图 20 s 72 延 伸 20 s 45 个 循 环 4 保 存 每 株 Fig. 叶片样品重复检测 3 次 计算平均值 用 2- C 法计 T 阳性克隆的 PCR 检测 PCR detection of positive clones 算相对表达量 质体色素检测 收集 3 株抑制效果显著的 T0 代 NtGGPPS4-RNAi 烟株蒴果期的第 片烟叶 自下而上 每 株为 个生物学重复 去除主叶脉后 冻干混匀 按照标准 YC/T 检测转基因烟株中质 体色素 新黄质 紫黄质 β-胡萝卜素 叶绿素 a 叶绿素 b 和叶黄素 的含量.2.5 GC-MS 检测烟叶中萜类物质含量 参照文献 的方法 采用溶剂萃取法从冻 干烟叶中提取萜类物质 应用 GC-MS QQQ 法分析 烟叶中α-CBD 和β-CBD 的含量 气相色谱-质谱条 件 进样口温度和传输线温度均为 280 离子源 温度 250 EI 电离方式 分流比 20 进样量 μl 载气 氦气 流量 ml/min 升温程序 /min 25 5 /min /min 35 5 min 通过 Acquisition-Timed 方法 采用选择反应 监测扫描 Selective Reaction Monitoring, SRM 模式 采集萜类物质数据 内标法定量 2 结果 M. DNA 标 准 品 DL NtGGPPS4 基 因 RNAi 载 体 的酶切产物 图 2 NtGGPPS4 基因 RNAi 载体酶切电泳图 Fig Electrophoretogram of phellsgate2-ntggpps4 after enzyme digestion RNAi 转基因烟株的鉴定 如 图 3 所 示 与 对 照 相 比 Con- Con-2 Con-3 除 NT4-R-0 NT4-R- 外 NtGGPPS4 基 因 在 NT4-R-2~NT4-R-9 烟 株 中 的 表 达 量 分 别 下 降 54.75% 77.87% 28.8% 45.2% 68.2% 80.93% 54.78% 和 54.28% 其 中 NT4-R-3 NT4-R-6 和 2. RNAi 载体检测 使 用 带 attb 接 头 的 RNAi 引 物 对pHellsgate2- NtGGPPS4 重 组 载 体 的 阳 性 克 隆 进 行 PCR 检 测 电泳结果 图 显示 在 500 bp 附近扩增出特异性 条带 与目的条带大小相符 提取阳性克隆质粒进行酶切验证 如图 2 所 示 质粒经 XbaⅠ酶切后 在 500 bp 附近有清晰的 酶切条带 同时 测序结果显示插入片段与目的 基因序列一致 表明成功构建了 NtGGPPS4 基因的 RNAi 载体 图3 Fig.3 RNAi 转基因植株中 NtGGPPS4 表达量的检测 Expression levels of NtGGPPS4 in RNAi transgenic plants

4 第 5 卷 第 2 期 李 锋 等 NtGGPPS4 基因 RNAi 载体构建与功能分析 3 NT4-R-7 烟 株 中 的 NtGGPPS4 表 达 量 降 低 更 加 显 萝卜素 叶绿素 a 叶绿素 b 和叶黄素的含量分别 的研究材料 23.42% 推 测 NtGGPPS4 表 达 量 下 调 后 合 成 著 因此 NT4-R-3 NT4-R-6 和 NT4-R-7 作为后续 2.3 转基因烟株中质体色素的检测 如图 4 所示 与对照相比 在 NT4-R-3 NT4-R-6 和 NT4-R-7 转 基 因 烟 株 中 新 黄 质 紫 黄 质 β- 胡 2.4 下 降 8.20% 2.02% 30.84% 36.57% 36.94% 和 GGPP 的能力减弱 GGPP 的含量减少 导致合成质 体色素的相关基因下调表达 最终使色素的含量 降低 图4 NtGGPPS4-RNAi 转基因烟草中质体色素的检测结果 Fig.4 Plastid pigment contents in RNAi transgenic plants 转基因烟株中萜类化合物的检测 如 图 5 所 示 与 对 照 相 比 NtGGPPS4-RNAi 烟 株中的二萜类化合物α-CBD 和β-CBD 含量分别下 降 40.36%和 35.70% 推 测 下 调 NtGGPPS4 基 因 的 RNAi 转基因烟株的新黄质 紫黄质 β-胡萝卜素 叶 绿 素 a 叶 绿 素 b 叶 黄 素 和 西 柏 烷 二 萜 醇 α-cbd 和 β-cbd 含 量 均 下 降 表 明 NtGGPPS4 可 调控烟叶质体色素和西柏烷二萜醇的生物合成 Beck 等 3 研究表明 定位在质体上的 AtGGPPS 表达后 可能会使合成萜类物质 特别是西柏烷类 物 质 相 关 基 因 的 表 达 下 降 从 而 导 致 α-cbd 和 β-cbd 含量的降低 为叶绿素 类胡萝卜素 赤霉素以及脱落酸等萜类 化合物的合成提供了前体物 GGPP 定位在线粒体 上的 AtGGPPS 为拟南芥生长发育所必需的萜类化 合物如泛醌-9 提供了 GGPP NtGGPPS4 基因定位 于线粒体 且在烟草的不同发育时期 各个器官中 均有表达 推测 NtGGPPS4 的功能之一是在线粒体 内为类异戊二烯醌的侧链提供 GGPP 骨架 8 当 NtGGPPS4 的 表 达 下 调 后 线 粒 体 内 的 GGPP 含 量 图5 Fig.5 3 NtGGPPS4-RNAi 转基因烟草中萜类化合物的 检测结果 Terpenoid contents in RNAi transgenic plants 减 少 影 响 了 泛 醌 的 合 成 从 而 导 致 呼 吸 作 用 减 弱 而呼吸作用又与氧化磷酸化相互偶联 因此 烟草的氧化磷酸化也会随之减弱 进而导致合成 萜类化合物的相关基因表达下调 使烟叶中质体 讨论 色素和西柏烷二萜醇的含量降低 类西柏烷和类胡萝卜素等萜类化合物是烟叶 中 重 要 香 气 前 体 物 而 20 碳 的 GGPP 是 类 西 柏 烷 和类胡萝卜素等萜类化合物的直接前体物 普通 烟 草 共 有 9 个 NtGGPPSs 基 因 2 5 个 已 被 克 隆 目 前 NtGGPPS 和 NtGGPPS2 已 被 证 实 参 与 了 叶 绿素和赤霉素的合成 本研究中 NtGGPPS 结论 利用农杆菌介导法将构建的 NtGGPPS4-RNAi 载 体 转 化 中 烟 00 获 得 3 株 NtGGPPS4 基 因 抑 制 效果明显的烟株 转基因烟株中 质体色素 新黄 质 紫黄质 β-胡萝卜素 叶绿素 a 叶绿素 b 和叶

5 4 208 年 黄素 ) 含量 二萜类化合物 (α-cbd 和 β-cbd) 含量 下降明显 参考文献 [] Lei B, Zhao X H, Zhang K, et al. Comparative transcriptome analysis of tobacco (Nicotiana tabacum) leaves to identify aroma compound-related genes expressed in different cultivated regions[j]. Molecular Biology Reports, 203, 40(): [2] Burke C, Croteau R. Geranyl diphosphate synthase from Abies grandis: cdna isolation, functional expression, and characterization[j]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002, 405(): [3] Beck G, Coman D, Herren E, et al. Characterization of the GGPP synthase gene family in Arabidopsis thaliana[j]. Plant Molecular Biology, 203, 82(4/5): [4] Kuntz M, Römer S, Suire C, et al. Identification of a cdna for the plastid-located geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Capsicum annuum: correlative increase in enzyme activity and transcript level during fruit ripening[j]. The Plant Journal, 992, 2(): [5] Scolnik P A, Bartley G E. Nucleotide sequence of an Arabidopsis cdna for geranylgeranyl pyrophosphate synthase[j]. Plant Physiology, 994, 04(4): [6] Okada K, Saito T, Nakagawa T, et al. Five geranylgeranyl diphosphate synthases expressed in different organs are localized into three subcellular compartments in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2000, 22(4): [7] Zhu X F, Suzuki K, Saito T, et al. Geranylgeranyl pyrophosphate synthase encoded by the newly isolated gene GGPS6 from Arabidopsis thaliana is localized in mitochondria[j]. Plant Molecular Biology, 997, 35 (3): [8] Chen Q S, Meng L J, Liu P P, et al. Cloning, subcellular localization, and expression analysis of NtGGPPS4 gene in Nicotiana tabacum[j]. Tobacco Science & Technology, 206, 49(S): -8. [9] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 -ΔΔC T method[j]. Methods, 200, 25(4): [0] YC/T 烟草及烟草制品质体色素的测定高效液相色谱法 [S]. YC/T Tobacco and tobacco products Determination of plastid pigments High performance liquid chromatography method[s]. [] 李锋, 孟利军, 史艳梅, 等. 烟草 NtGGPPS4 基因的克隆和功能初步分析 [J]., 207, 50(): -5. LI Feng, MENG Lijun, SHI Yanmei, et al. Cloning and functional analysis of NtGGPPS4 from Nicotiana tabacum[j]. Tobacco Science & Technology, 207, 50 (): -5. [2] 李泽锋, 魏攀, 夏玉珍, 等. 烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定 [J]., 205, 48(6): -8. LI Zefeng, WEI Pan, XIA Yuzhen, et al. Whole genome identification and analysis of tobacco GGPP synthase gene family[j]. Tobacco Science & Technology, 205, 48(6): -8. [3] Orlova I, Nagegowda D A, Kish C M, et al. The small subunit of snapdragon geranyl diphosphate synthase modifies the chain length specificity of tobacco geranylgeranyl diphosphate synthase in planta[j]. The Plant Cell, 2009, 2(2): [4] 魏攀, 孟利军, 陈千思, 等. 烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因 NtGGPPS 的克隆和功能分析 [J]., 206, 49(4): 8-5. WEI Pan, MENG Lijun, CHEN Qiansi, et al. Cloning and functional analysis of geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene NtGGPPS from Nicotiana tabacum[j]. Tobacco Science & Technology, 206, 49(4): 8-5. 责任编辑李阳

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