基因组计划的进行, 由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要,FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用 1. 原理 FISH(fluorescence in situ hybridization) 技术是一种重要的非放射性原位杂交技术它的基本原理是 : 如果被检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DN

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1 FISH 发展简介 1 FISH 技术检测位点数目及检测目标的发展在 FISH 技术基本确立之后,FISH 不仅用于单基因或核酸检测,FISH 技术的进一步发展扩展到多色 FISH 多基因位点同时检测, 从基因检测发展到基因组染色体活细胞中转录产物 mrnas 原位检测以及组织水平的核酸检测, 并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测早期的探针较大, 是通过载体的增殖缺口平移法体外转录法和随机引物 DNA 合成法来制备以获得特异性杂交克隆然而大片断的探针通常带有重复序列造成高荧光背景, 采用未标记的核酸进行预处理使其与非特异性位点结合用于抑制非特异性杂交可以克服上述问题, 同时也使得研究者扩大了检测目标, 实现了整条染色体染色在细胞遗传学上 FISH 技术在染色体分析方面也因此得到了显著的提高如通过比较基因组杂交 (Comparativegenomic hybridization) 用于检测染色体区域的缺失和重复大片段探针一旦和样品非特异性结合就会形成一个信号, 混淆染色体上基因的检测, 就需要剪切成小片段 <200 核苷酸现在检测手段的提高以及检测软件的不断发展使得 FISH 技术的检测要求越来越低, 灵敏度越来越高精确的计算机图片处理算法的不断改进形成了亚显微水平的探针高分辨技术随着检测目标越来越小,FISH 技术已用于隐蔽的亚端粒核型基因重排和精确的染色体作图及单拷贝 mrna 的检测 FISH 检测范围的扩大, 使得 FISH 技术的应用在 20 世纪 90 年代急速增长由 FISH 技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测首先是采用不同的荧光素来检测多位点, 如双色荧光用于检测特异的核酸序列, 每一条染色体基因或者转录产物分别由一种可以分辨的荧光信号来表示之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了 FISH 应用范围译码方案主要是针对色彩比例, 即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点前述的每一种方法, 或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达 12 个采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着 FISH 技术多位点检测的里程碑尽管可以采用多种方法观测到 mrnas, 但是 FISH 对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测 2 FISH 技术的定量分析阶段 Pinkel 等 (1986) 首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测, 采用双色激发块装置照相机检测荧光信号, 而且定量分析技术很快用于了 mrna 检测荧光检测的关键是信号的重现性无规律性及背景的自发荧光不仅不同的样品之间荧光不同, 而且同一载玻片上的材料或者同样的细胞都有可能显示出不均衡的荧光目前已有多种方法用于消除一些组织中的自发荧光 : 如样品制备过程中, 采用的消除自发荧光试剂包括硼氢化钠或者采用光照辐射进行预处理以消除非特异性背景信号这些消除自发荧光的方法并不完全有效, 通常在进行图像分析时通过计算机算术除去自发荧光信号荧光图像的光谱数据包括真正的信号和许多杂噪, 分别进行分析并且通过单独的光谱组分分析除掉杂噪数据多色 FISH 有自身的限制, 包括不同的荧光强度和颜色重叠但是通过计算机算法分析平衡了多色图像, 包括强度变化和自动纠正信号重叠 FISH 图像自身的限制并没有影响到自动破译算法的发展采用序列较大探针进行 DNA 位点检测和多色荧光计数算法辅助病理学家实现了自动化分析此外, 检测探针试剂盒和点计数方法的应用为便捷的检测结果提供了一个平台尽管多种方法已经用于分析或优化自动细胞检测系统, 人工的细胞病理检测仍是可信度高的组织分析方法然而, 细胞制备鉴别固定介质上细胞样品计算机化检测在未来的医学诊断中的高效益性不容忽视, 快速检测细胞内的分子信号只有通过计算机辅助方法进行检测现在, 自动化检测程序已经扩展到采用多基因转录模型检测特异的 DNA 簇和转录位点以确定功能细胞的状态鉴于 FISH 起始阶段的发展主要是探针类型和检测位点的扩展, 荧光检测技术将来的发展可能包括检测领域的扩展荧光图像临床诊断应用需要在检测体系上进一步提高, 如探针的结合, 照相和分析的自动化, 因此避免了不同操作间的误差样品厚度是荧光显微镜检测样品类型的一个限制因素近来的激光共聚焦显微镜和光学 X 射线断层摄影技术要求样品厚度达到 1~2mm 一种改进的光学投射 X 显微断层摄影技术可以获取到 15mm 厚样品的图像扩大了生物学和诊断样品的检测范围活细胞的 RNAs FISH 技术检测也有报道既可以采用体内释放的荧光集团也可以采用杂交后探针的荧光素进行检测这两种新方法都可以降低非特异性标记探针存在时的高背景 ( 如活细胞 ), 可以用于追踪 mrna 的合成和转移途径这些方法较绿色荧光蛋白 (Green fluorescence protein, GFP) 更易于检测不同靶分子相对于 GFP 活细胞原位杂交检测,FISH 易受到细胞内合成探针的影响 FISH 需要进一步的改进以降低活体基因表达检测时的干扰背景, 避免细胞内自身杂交物的干扰其实完全可以不必考虑 FISH 检测和荧光检测蛋白技术的差异, 将 FISH 技术和荧光蛋白技术结合起来可以同时检测目的核酸和蛋白多光子显微技术的应用进一步扩大了荧光图像的应用范围采用多光子显微镜, 激光块可以发射光子聚焦于显微镜两到三次激发目的荧光素采用近红外激发光可以更深层次穿透生物样品, 比可见光对活体样品造成的毒性低这种新方法的应用已将荧光图像用于活体系统的检测, 甚至整个动物体由于还不能合成生物体标记探针, 因此目前生物体内荧光图像的应用只限于检测荧光分子或生物体自发荧光生物组织在正常的生理或者病理生理过程中产生的自发荧光信号可以作为一种重要的诊断信号一旦生物体探针成为可能, 将会成为鉴别特异核酸序列, 进行非入侵诊断, 获取诊断图像的一种有力辅助手段 FISH 技术原理 : FISH 技术 : 荧光标记的原位杂交技术 1974 年 Evans 首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用, 提高了定位的准确性 20 世纪 70 年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交, 即 FISH 技术 1981 年 Harper 成功地将单拷贝的 DNA 序列定位到 G 显带标本上, 标志着染色体定位技术取得了重要进展 20 世纪 90 年代, 随着人类

2 基因组计划的进行, 由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要,FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用 1. 原理 FISH(fluorescence in situ hybridization) 技术是一种重要的非放射性原位杂交技术它的基本原理是 : 如果被检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DNA 与所用的核酸探针是同源互补的, 二者经变性 - 退火 - 复性, 即可形成靶 DNA 与核酸探针的杂交体将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素地高辛, 可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应, 经荧光检测体系在镜下对待测 DNA 进行定性定量或相对定位分析 2. 实验流程 FISH 样本的制备探针的制备探针标记杂交染色体显带荧光显微镜检测结果分析 3. 特点肺肿瘤细胞 FISH 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高, 可以通过延长曝光时间加强信号强度, 故较灵敏缺点是探针不稳定自显影时间长放射线的散射使得空间分辨率不高及同位素操作较繁琐等采用荧光标记系统则可克服这些不足, 这就是 FISH 技术 FISH 技术作为非放射性检测体系, 具有以下优点 :1 荧光试剂和探针经济安全 ;2 探针稳定, 一次标记后可在两年内使用 ;3 实验周期短能迅速得到结果特异性好定位准确 ;4 FISH 可定位长度在 1kb 的 DNA 序列, 其灵敏度与放射性探针相当 ;5 多色 FISH 通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列 ;6 既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化, 也可以在悬液中显示间期染色体 DNA 的结构 FISH 操作流程 : 一, 石蜡标本 : 石蜡切片标本 FISH 操作流程 ( 以 Pathvysion 试剂盒为例 ) I. 准备切片标本需在 10% 的中性福尔马林固定小时切片厚度为 4-5um 直接晾干将玻片烤过夜, 温度 II. 脱蜡用钻石笔标出杂交区域将切片浸入二甲苯中,10 分钟 3 次, 室温用 100% 的无水乙醇脱水,5 分钟 2 次室温干燥, 或在的烤箱烤干, 约 2-5 分钟 III. 预处理将玻片浸入预处理试剂 30 分钟,80 将玻片取出, 浸入纯水, 室温 1 分钟 Wash buffer 洗 2 次, 每次 5 分钟, 室温 IV. 蛋白酶处理将玻片上多余的 wash buffer 甩干, 小心的擦去组织旁边的 buffer 蛋白酶处理 20 分钟 ( 应根据最后的试验结果调整作用时间分钟 ),37 Wash buffer 室温处理 2 次, 每次 5 分钟室温干燥或干燥箱 2-5 分钟 V. 固定

3 10% 的中性福尔马林固定 10 分钟, 室温 Wash buffer 室温 2 次, 每次 5 分钟室温干燥或干燥箱 2-5 分钟 VI. 变性将变性液预温至 72, 变性液 PH 为 7-8 将玻片放入变性液中,72,5 分钟 ( 染色缸内玻片不要超过 6 张 ) 梯度脱水,70%-85%-100%, 室温, 每次 1 分钟将玻片上残留的液体甩干, 并小心的擦去组织周围的液体室温干燥或干燥箱 2-5 分钟 VII. 杂交准备湿盒, 将湿盒预温至 37 从冰箱中取出探针预温到室温, 混匀后离心将 10ul 的探针加到组织的杂交区域, 盖上盖玻片, 去除气泡用 rubber cement 封住盖玻片的边缘将玻片放入预温的湿盒内, 杂交小时, 避光 VIII. 杂交后洗将 2X SSC/0.3% NP-40(PH7-7.5) 预温至 72 另一缸至于室温 2X SSC/0.3% NP-40 将玻片取出, 剔除 rubber cement, 将玻片浸入杂交后洗液, 小心的将盖玻片去除取出玻片, 并将残余的液体擦干, 放入 72 的洗液中,2 分钟将玻片取出, 避光晾干 IX. 复染加 10ul 的复染剂 DAPI I 至杂交区域加上盖玻片,-20 至少存放 30 分钟后观察, 观察前玻片需要预温至室温 X. 计数计数注意事项 : 按一定方向移动玻片, 计数细胞核内的信号同一个细胞内, 计数荧光点大小相近的信号, 两个荧光点之间的距离小于等于信号直径的只只能计数一个信号核外的信号以及只有一个颜色的细胞都不能计数计数核内每个颜色的信号一个或一个以上的细胞 XI. 试剂准备 1 20 SSC (3M NaCl,0.3M 柠檬酸钠,PH5.3) 用 HCl 调 PH 至 5.3, 终体积为 250ml, 用 0.45um 的滤器过滤室温可以保存 6 个月 2 变性液 : 二血液标本全血样品固定 1. 用无菌蒸馏水准备 0.075M KCl 低渗液 2. 在盛有 10 ml 的 15 ml 无菌圆锥管中加入 1 ml 全血裂解红细胞 37 孵育 10 分钟, 孵育期间进行温和颠倒混合

4 3. 室温下 450g 离心 5 分钟 4. 弃去上清 5. 用 PBS 重悬洗涤细胞 6. 重复离心步骤 7. 用 1 ml PBS 重悬细胞并用血细胞计数仪进行计数 8. 离心细胞并弃去上清 9. 加入 10 ml 预温 (37 ) 的低渗液 10. 轻轻颠倒以混合细胞 11. 室温孵育分钟 12. 加入 2 ml 新鲜制备的固定液, 室温孵育 5 分钟 g 离心 5 分钟 14. 弃去上清, 用 10 ml 固定液重悬细胞 15. 室温放置 5 分钟 g 离心 5 分钟 17. 重复步至少 2 次 18. 用固定液重悬细胞, 使终浓度为 1 x 106 cells/ml, 置于 -20 保存 FISH 杂交 1. 将玻片从 -20 取出并恢复到室温 2. 在玻璃 Coplin 缸中加入 ph 7.0 的 2X SSC/0.5% NP40 溶液 ( 预温到 37 ), 将切片在缸中孵育 30 分钟 3. 将玻片从缸中取出, 室温下在 70% 80% 95% 的乙醇中依次放置 2 分钟进行梯度脱水 4. 风干玻片 5. 将玻片浸入 ph7.0, 预温至 72±2 的 70% 甲酰胺 /2X SSC 溶液中变性两分钟 ( 变性液的 ph 值必须为 7.0, 温度为 72 度, 用温度计直接检测缸内溶液的温度 ) 6. 用冰乙醇重复步骤 3 4 来终止变性并脱水, 玻片可放置在 95% 乙醇中待下一步操作 7. 将装有探针的管放置于 37 5 分钟 8. 吸取合适量的探针到一个包裹了锡纸的 0.2 ml 离心管中 ( 多孔玻片约每孔 2.5 μl, 普通玻片使用 22 x 22 mm 盖玻片时约需 8-10 μl) 9. 72±2 变性探针 5 分钟 10. 将装探针的离心管离心 2-3 秒 11. 将装探针的管置于 37 待使用 12. 当探针变性到最后两分钟时, 将玻片从 95% 乙醇中取出, 放于 45 烤片机干片 13. 将探针加在待检测区域上并迅速盖上盖玻片对多孔玻片而言, 盖玻片面积根据所使用的孔决定注意盖玻片下不可有气泡, 不然会妨碍探针与细胞接触 14. 用封片胶封住盖玻片 15. 将玻片放入预温的湿盒中, 置于 37 孵箱杂交 16 小时洗片 1. 将 50 ml 0.5X SSC 加入玻璃的 Coplin 缸中, 水浴升温至 72±2, 保持该温度至少 30 分钟 2. 将另外 50 ml 2X SSC 加入一个锡纸包裹的 Coplin 缸中, 室温 3. 用镊子小心的揭开封片胶, 移去盖玻片, 去掉玻片上多余的封片胶 4. 将玻片浸在 2X SSC 中 2 分钟 5. 快速将玻片转移到 72±2 的 0.5X SSC 中, 放置至少 5 分钟, 不要抖动 6. 将玻片转移到装有 2X SSC/0.1% NP40 的 Coplin 缸中, 放置 10 分钟 Coplin 缸应用锡纸包好复染读片 1. 准备 0.05 μg/ml DAPI/ 抗淬灭剂 (AF) 2. 向标准玻片上加入 10 μl DAPI/AF, 向多孔玻片上每孔加入 3-5 μl DAPI/AF 3. 盖上盖玻片并用纸巾去掉多余的 DAPI 4. 储存在暗处直到用荧光显微镜进行观察 FISH 应用概述和实例 :

一概述 : 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位, 而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究在基因定性定量整合表达等方面的研究中颇具优势在临床领域,FISH 实验可广泛用于产前诊断, 非整倍体筛选, 各种血液病, 实体肿瘤筛选等产前分析经常可能令母亲和家人产生严重的心理压力据统计, 产前诊断检查到 95% 的染色体异常为 13, 18, 21, X 和 Y

5 一概述 : 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位, 而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究在基因定性定量整合表达等方面的研究中颇具优势在临床领域,FISH 实验可广泛用于产前诊断, 非整倍体筛选, 各种血液病, 实体肿瘤筛选等产前分析经常可能令母亲和家人产生严重的心理压力据统计, 产前诊断检查到 95% 的染色体异常为 13, 18, 21, X 和 Y 染色体的非整倍体性采用染色体特异性探针 ( 13, 18, 21, X 和 Y ) 对羊水中的未分裂细胞进行 FISH 检测, 得到每种染色体数量结果注意 : 不同于传统的核型分析, 这些方法不推荐用于非常小的样本 ( e.g.<50 个细胞 ) 或血液样本肿瘤, 血液病及其他疾病 ( 临床领域 ) 病理诊断染色体易位, 倒位检测乳腺癌肿瘤细胞中 HER-2 基因的异常扩增检测膀胱癌细胞的染色体的异数和 9p21 座位的缺失检测前列腺癌细胞的 LPL c-myc 基因的扩增二 FISH 实例 : 荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization, 简称 FISH) 由于其直观, 快速, 敏感性高和方便灵活越来越得到广泛应用, 尤其是在血液学领域中. 因为白血病标本比较容易取得和制备, 不同类型的白血病又往往有其特异的染色体异常, FISH 在白血病诊断, 治疗监测, 预后估计和微小残留病检测等诸方面都正成为不可缺少的重要手段. 1. 白血病诊断. 白血病的细胞遗传学研究已经发现了许多白血病特异的染色体易位, 为疾病的诊断和特异治疗提供了依据. 目前, 大部分易位累及的白血病相关基因已经被克隆, 可通过检测些融合基因对白血病进行分子诊断. 常见的单一序列探针有 PML-RAR?[t(15;17), 见于 M3, AML1-ETO[t(8;21), 见于 M2b], BCR-ABL[t(9;22), 见于 CML 和 ALL], TEL- AML1[t(12;21), 见于儿童前 B-ALL] 等等, 为方便起见, 商品化的探针多为标记的, 即两个基因分别用两种颜色标记, 同时在一张玻片标本上杂交. 用 FISH 进行融合基因检测比常规的染色体核型分析要准确, 其敏感性虽略低于 RT- PCR 方法, 但其假阳性和假阴性率却大大低于 PCR 法. 若核型分析, rt-pcr, FISH 三者结合则可大大提高白血病诊断的准确性. 常规细胞遗传学分析常有一些染色体易位不易发现或有不明来源的标志染色体或有复杂的染色体易位不易诊断. FISH 则可解决这些难题. 白血病的染色体异常分为染色体数目异常和结构异常. 对数目异常, 可采用染色体着丝粒探针或整条染色体探针 [ 又称为染色体涂色 (Chromosome painting, CP) 探针 ]. 如慢性粒细胞性白血病急变时常常出现 8 号染色体三体. 此时 8 号着丝粒探针或 CP 探针就很容易诊断了. 目前, 几乎所有染色体均已有了商品化的着丝粒和 CP 探针. CP 探针也适用于标志染色体和不易发现或复杂的染色体易位的检测, t(12;21) 的发现就是最好的例子. 染色体涂色往往要在核型分析的基础上, 选择可能发生异常染色体探针做杂交, 如果三条以上染色体发生复杂的交互易位, 需要多次杂交分析才能确定. 为解决这一问题, 在染色体涂色的基础上开发了 M-FISH 技术. M-FISH 相当于在一次杂交中给每一条染色体都涂上了不同的颜色, 因而很容易就可看到多条染色体间的复杂易位情况和确定标志染色体的来源. M-FISH 因其这一优点正成为分子遗传学家手中重要工具, 然而, 对同一条染色体中的易位或倒位它就无能为力了, 而且, 它也不能精确地显示染色体断裂的区带. 能否让每条区带也杂交上不同的颜色呢? 这一想法导致了彩色核型分析 (Rx-FISH) 的诞生. 它几乎解决了上述所有的问题, 然而 Rx-FISH 探针价格不菲, 目前已有多家公司正在开发和改进中. 不论是哪一种 FISH, 其成功与否都与染色体标本的质量密切相关, M-FISH 和 Rx-FISH 的要求尤其较高. 除了 M-FISH 和 Rx-FISH 外, 在血液病研究中使用较多的一种 FISH 相关技术是比较基因组杂交 (Comparative Genomic Hybridization, CGH). CGH 与上述的各种方法有所不同, 它不需要制备患者的染色体标本, 只需抽提肿瘤组织和正常组织的基因组 DNA, 分别标记后作为探针与正常人染色体杂交即可, 因而 CGH 最适合于检测实体瘤, 淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病. CGH 另一无法替代的优点是, 它可在一次杂交中检测整个基因遗传物质的增加或减少, 但精度有限, 对微小的扩增或缺失检测不出, 仅适用于对整个基因组进行筛查. CGH 也无法发现平衡染色体易位.

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