前言 智力障碍 自闭症和注意力缺陷多动症 (ADHD) 等先天性结构畸形和发育性疾病是神经精神性疾病, 在幼儿期可表现为偏离正常发育方向 过去的 5 年中, 研究人员在确定导致此类疾病的具体遗传原因方面获得了重大进展 先前研究采用的方法主要包括用于检测融合基因的染色体核型分析和荧光原位杂交 (FIS

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1 OneSeq 靶向序列捕获系统全基因组拷贝数变化 cnloh 插入和缺失以及基因突变的同时检测 应用简报 作者 Anniek De Witte Kyeong-Soo Jeong Arjun Vadapalli 摘要 微阵列芯片比较基因组杂交 (acgh) 分析目前是测定传统染色体拷贝数变化的金标准 尽管此项技术曾有助于鉴定多个新型微缺失综合征, 但基因组问诊的最终解决是需要精确到碱基水平 基于全基因组测序 (WGS) 的初步研究表明, 同时实现 SNP 检出以及高分辨率拷贝数分析需要对全基因组进行高深度 高覆盖的大量测序 这种大量的测序要求不符合多数临床实验室高通量 低成本的需求 该应用简报旨在介绍 OneSeq 技术, 这是一种革命性地可以将所有检测都集为一体的 SureSelect 靶向序列捕获技术 结合 SureCall 分析软件, 它可以在一次综合分析里面同时实现对全基因组水平拷贝数目变异 中性杂合缺失 (cnloh), 插入和缺失 (Indels), 基因突变等所有变异的检测 通过对已知的染色体变异样本进行分析, 我们发现该技术可以实现从小至 150 kb 到大至全基因组三倍体的拷贝数变化检测 以及对中性杂合缺失 (cnloh) 片段 Indels 单碱基突变的检测 因此我们可以得出:OneSeq 靶向序列捕获技术提供了一个可以同时检测全基因组水平拷贝数变异以及基因突变的实用解决方案

2 前言 智力障碍 自闭症和注意力缺陷多动症 (ADHD) 等先天性结构畸形和发育性疾病是神经精神性疾病, 在幼儿期可表现为偏离正常发育方向 过去的 5 年中, 研究人员在确定导致此类疾病的具体遗传原因方面获得了重大进展 先前研究采用的方法主要包括用于检测融合基因的染色体核型分析和荧光原位杂交 (FISH) 用于检测拷贝数变化的 acgh 以及直接通过测序和 PCR 的方法来检测基因突变 尽管 WGS 具有提供从单基因突变到非整倍性全类型畸变测定的单个平台解决方案的潜力, 但高深度全基因组测序 (WGS) 当前的成本和分析周期使其无法在高通量临床研究实验室中应用 而采用靶向测序时, 可以实现仅针对部分基因的集合或者基因组的特定区域进行测序, 从而使得研究人员可以将时间 花费和数据存储等资源集中用于目标基因组区域 但是, 常规靶向测序尚不能用于全基因组的拷贝数变化研究 OneSeq 靶向序列捕获试剂盒是基于可以同时检测基因组水平拷贝数目变化 中性杂合性缺失 (cnloh) 以及点突变而开发的 结合 Agilent SureCall V3.0 软件的新算法可以实现对 OneSeq 数据的流程化分析 方法 靶向序列捕获基因组合设计 OneSeq 靶向序列捕获试剂盒基于安捷伦 SureSelect 技术, 一共包含 3 组探针 第一组探针, 基于基因组骨架区域进行设计, 可用于检测基因组水平的拷贝数目变异 ( 通过将实验样本与已知参考序列的样本进行比较来实现 ); 第二组探针, 基于对基因组区域中那些高频次等位基因 SNP 区域设计, 用于检测 cnloh; 第三组探针, 针对感兴趣的目标区域进行设计, 用于检测普通突变及 Indels OneSeq 目录产品 Constitutional Research Panle( 图 1) 是一个 28M 区域的设计 它的探针设计区域 (12Mb) 包含基因组骨架区域, 可检测分辨率达 300Kb 的功能性拷贝数目以及 5Mb 的 cnloh, 以及疾病相关的 ClinGen 区域, 检测分辨率可达 25-50Kb 同时, 它还包含了 Agilent SureSelect Foucused Eome Panel 的所有区域内容 (16Mb) OneSeq CNV 骨架 + 定制化 Panel 组合实现了可以通过安捷伦 SureDesign( 一款基于网页的免费设计应用程序 ), 将多达 12 Mb 的任意定制化基因区域加入到基因组骨架序列 SNP ClinGen SNP SNP ClinGen SNP ~ 50 kb ~ 50 kb 图 1. 用于 OneSeq 靶向序列捕获系统的探针设计图解 2

3 样品处理对取自 Coriell 细胞库 ( 的六个 DNA 样品 NA03997 NA11419 NA08254 NA04592 NA02948 和 NA20409, 我们按照 Agilent SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library (Version B.1) 进行文库构建 每个样品使用 200 ng DNA 起始进行建库, 捕获后的 PCR 循环数为 10 同时, 对安捷伦男性和女性参照样品也进行平行处理, 作为数据分析中的对照 将每个捕获文库依次上样至 Illumina HiSeq 2500 测序平台, 进行 2x100bp 测序 为能达到足够的深度和覆盖度, 每个样品的测序量为 7Gb 数据分析 将实验样品与已知参照样品进行对比后, 可检测出拷贝数的变化 ( 图 3) 首先, 以减少噪声为目的, 用一种概况的方法来得到整个基因组区域读长分布的集中趋势 将每个探针区间的样品测序深度除以参比测序深度, 获得的 log 比值可用于识别畸变 随后对 log 比值进行非抽样小波变换以检测陡变或拐点 然后再在不同基因组长度尺度上对变换后的 log 比值进行分析 对得到的拐点进行组合与排序后, 使用假阳性率步骤仅选择超过某一统计显著性阈值的数值 随后在更高分辨率下对有效区间进行检验, 从而进一步将其认为是扩增和缺失的候选范围 log 2 (2/2) = 0 1 log 2 (3/2) = 0.58 原始图像文件由 Illumina 碱基识别软件采用默认参数处理 后, 可生成 FASTQ 文件 随后可将 FASTQ 文件导入安捷伦 SureCall 3.0 版软件中 ( 图 2) 在去除接头序列后, 可采用 SureCall 中包含的 BWA 比对算法将读出序列与基因组进行比对 Log log 2 (1/2) = 1 Illumina HiSeq FASTQ Illumina HiSeq FASTQ 图 3. 安捷伦 SureCall 软件检测拷贝数目变化 实验根据染色体位置对样品测序深度与对照测序深度的 Log 2 比值进行作图 无拷贝数变化对应于 log 2 比值为 0( 黑色点 ), 单拷贝缺失对应于 log 2 比值为 1( 红色点 ), 单拷贝增加对应于 log 2 比值为 0.58( 蓝色点 ) SureCall 3.0 CNV cnloh SNP MNP 内部开发的 SNP 识别算法 SNPPET 被用于识别点突变以及插入和缺失 SNPPET 算法有两个基本步骤 第一步是快速搜索变异体并在两种模型下对每个基因座进行评估 其中一个模型假设在所考虑的碱基中, 所有非参照等位基因均是由于测序错误产生的 ; 而另一个模型则认为每个非参照等位基因都是一个真实的变异体 第二步是在变异体的邻近区进行精细的局部搜索 所有可能的变异体组合均被评估为单倍型, 并根据更多邻近变异体进行调整 CNV/LOH 图 2. 在安捷伦 SureCall 中进行 OneSeq 分析的步骤 3

4 OneSeq 骨架中覆盖的高频次等位基因 SNP 用于测定 cnloh 通过对基因组中区域有显著杂合子缺失的 SNP 区域进行分析, 从而实现 cnloh 或 UPD 区域的定位 LOH 算法首先采用在可用 SNP 位置测定的等位基因频率, 尝试将样品分配到置信度为 99% 的已知群体中 在样品无法分配到已知群体的情况下, 将采用由 UCSC 获得的平均杂合率代替 然后, 采用一系列的 Fisher 检验对富集在已缺失杂合性的 SNP 的基因组区域评分 最终 LOH 得分应考虑候选 SNP 位置可能存在的插入和缺失以及多等位基因 算法的更详细说明请参见 SureCall 帮助系统 结果与讨论 QC 数据所有八个样品在靶标 ± 100 bp 的读出百分比均高于 75%, 且重复读出的数量非常少 ( 图 4) 这与人全外显子 V5 试剂盒等其他 SureSelect 靶向序列捕获试剂盒相似 覆盖度也非常高, 其中超过 95% 的碱基覆盖大于 20x 覆盖大于 50x 或 100x 的区域, 则要明显的少一些, 这与预期一致 至少具有 50 或 100 次读数的碱基数则少得多, 与预期相同 将测序量从 7 Gb 增加到 10 Gb 之后, 至少具有 50 次读数的碱基数超过了 90%( 数据未显示 ) 大的 CNV 的检测我们能够在多个具有已知畸变的样品中检测到预期的全染色体拷贝数变化 图 5 显示了核型为 47,XY,+13 的 Coriell 样品 NA02948 中 13 号染色体三体的检测结果 测得的整个染色体平均 log 2 比值接近单拷贝增加的预期 log 2 比值 % 90% 80% 70% 60% 50% ± 100 bp 1x 10x 20x 50x 100x 40% 30% 20% 10% 0% NA03997 NA11419 NA08254 NA04592 NA02948 NA20409 图 4. OneSeq 体质性研究试剂盒的在靶覆盖率 图 5. 安捷伦 SureCall 软件中的 OneSeq 拷贝数数据分析显示 Coriell 样品 NA02948 (47,XY,+13) 中的 13 三体 每个红色加号代表一 个原始数据点 请注意特定目标区域中较高的数据点密度 蓝色阴影和蓝线表示畸变识别, 说明增加了整个 13 号染色体 4

5 与 acgh 的对比我们将 OneSeq 生成的拷贝数曲线与 acgh 生成的拷贝数曲线进行了对比 CGH 数据利用安捷伦 CGH+SNP 4 180K 微阵列芯片生成 表 1 展示了对 Coriell 样品 NA08254 采用两种方法获得的大于 150 kb 的 CNV 识别对比 采用两种方法均可检测到相同的八个 CNV 由于 acgh 探针和 OneSeq 探针位置的不同, 导致畸变起始和结束的基因组坐标不一致, 从而使得畸变大小具有轻微差异 图 6 和图 7 显示了 13 号染色体上的 13 Mb 缺失和 6 号染色体上的 370 kb 缺失的对比数据 表 1. 采用 acgh 和 OneSeq 在 Coriell 样品 NA08254 中检测到的大于 150 kb 的 CNV, 以从大到小的顺序排列 染色体 畸变类型 acgh 畸变大小 (kb) OneSeq 畸变大小 (kb) 13 号染色体缺失 号染色体缺失 号染色体缺失 号染色体扩增 号染色体扩增 号染色体缺失 号染色体扩增 号染色体扩增 OneSeq 平均 log 2 比值 OneSeq CGH 图 6. 安捷伦 SureCall 软件中的 OneSeq 拷贝数数据分析结果 ( 上图 ) 和安捷伦 CytoGenomics 软件 3.0 版中的 CGH 拷贝数数据分析结果 ( 下图 ), 显示了 Coriell 样品 NA08254 的 13 号染色体中的 13 Mb 缺失 5

6 OneSeq CGH 图 7. 安捷伦 SureCall 软件中的 OneSeq 拷贝数数据分析结果 ( 上图 ) 和安捷伦 CytoGenomics 软件 3.0 版中的 CGH 拷贝数数据分析结果 ( 下图 ), 显 示了 Coriell 样品 NA08254 的 6 号染色体中的 370 kb 扩增 cnloh 的检测图 8 显示了带有完整父本 UPD 的 Coriell 样品 NA20409 中的 UPD 15 ( 单亲二倍体 ) 检测结果 由于几乎所有 SNP 的 B 等位基因频率均为 0% 或 100%, 且在整个染色体上几乎检测不到杂合 SNP, 因此 UPD 的识别表现出较高的置信度 LOH (BAF) 图 8. 安捷伦 SureCall 软件中的拷贝数和 LOH 数据分析结果, 显示 Coriell 样品 NA20409 中的 UPD 15 上图显示拷贝数数据 每个红色和绿色 十字各分别代表一个原始数据点 除了接近着丝粒的共同 CNV, 整个染色体均是二倍体 下图显示 LOH 数据 每个浅绿色点代表一个 SNP 的 B 等位基因频率 (BAF) 浅蓝色阴影表示 15 号染色体的 UPD 6

7 突变以及插入和缺失的检测较高的测序深度可实现对所有 Coriell 样品靶标区域中的单点突变以及插入和缺失进行检测 图 9 显示了 Coriell 样品 NA16382 中 26 bp 缺失的示例 已知此样品具有编码甲基化 CpG 结合蛋白 2 (MECP2) 基因的 1160 号核苷酸起始的 26 个碱基对缺失 结论 OneSeq 靶向序列捕获系统与安捷伦 SureCall 软件有机结合, 通过对比未知样品和对照样品之间非重叠窗中的序列读出数, 提供了检测高分辨率拷贝数变化的简化方法 OneSeq 除了可以进行拷贝数目分析以外, 同时还可进行 cnloh SNP 插入和缺失的检测 与 WGS 相比,OneSeq 无需进行大量测序 OneSeq 在维持成本和效率以及通量的同时提供现有多种遗传学技术的一体化分析, 可成为用于从单基因突变到非整倍性等多种畸变临床研究的单个平台解决方案 SNP 图 9. 安捷伦 SureCall 软件中突变以及插入和缺失的识别结果, 显示 Coriell 样品 NA16382 中 MECP 2 基因中的 26 bp 缺失 ( 右图 ) 以及杂合 SNP( 左图 ) 7

8 如需了解更多信息, 请访问 : NGS 资源页面 : 联系我们 : , 或访问 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 3 月 11 日中国出版 CHCN 仅限研究使用 不可用于诊断目的

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