中国科学院干细胞库细胞说明书骨髓来源人 MSC 细胞说明书中科院干细胞库编号 :SCSP-405 细胞名称 : 骨髓来源人 MSC 细胞细胞描述 : 正常的骨髓来源的人间充质干细胞, 具备分化成脂肪成骨和软骨的能力物种 : 人细胞来源 :2013 年引进 ATCC number:pcs-50

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纹杉和
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1 骨髓来源人 MSC 细胞说明书中科院干细胞库编号 :SCSP-405 细胞名称 : 骨髓来源人 MSC 细胞细胞描述 : 正常的骨髓来源的人间充质干细胞, 具备分化成脂肪成骨和软骨的能力物种 : 人细胞来源 :2013 年引进 ATCC number:pcs 培养液 : 见下方备注方案一方案二冻存管细胞总数 / 每支 : 冻存管细胞体积 / 每支 :500 l 冻存管细胞预期存活率 :70 冻存日期 / 代数 : 详见冻存管 / 培养瓶标识 ( 建议使用 P10 前细胞进行实验, 若传代次数过多,MSC 增殖能力将减弱 ) 冻存管细胞建议复苏培养体系 :1 个 T25 培养瓶中国科学院干细胞库骨髓来源人 MSC 传代周期 :3 4 天传代比例 : 换液频率 : 见下方备注方案一方案二冻存液 : 见下方备注方案一方案二细胞状态 : 良好支原体检测结果 : 阴性详情访问中科院干细胞库 / 干细胞技术平台电话 : 感谢您选择我们的服务! 中国科学院干细胞库 / 干细胞技术平台第 1 页, 共 5 页

2 方案一 : 使用 ATCC 培养液体系一骨髓来源人 MSC 完全培养液配方 : Mesenchymal Stem Cell Basal Medium for Adipose, Umbilical and Bone Marrow-derived MSCs (ATCC PCS ) 485 ml Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cell Growth Kit( 根据 ATCC PCS 配制 ) 1 kit( 配方见下 ) ES 级 FBS(Gibco) 35 ml rhfgf basic(r&d 233-FB-025) 终浓度 125 pg/ml rhigf-1(r&d 291-G1-200) 终浓度 15 ng/ml L-Alanyl-L-Glutamine(SIGMA A8185-5G) 终浓度 2.4 mm 备注 : 加入 Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cell Growth Kit 后的完全培养液需保存在 2~8 建议在 2 周内使用二培养 Protocol 复苏 : 1. 将骨髓来源人间充质干细胞冻存管从液氮中取出, 置于 37 水浴中使之迅速融解, 取出后拿到超净台内用 75 酒精擦拭冻存管旋口处及外壁, 防止污染 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3 4 ml 骨髓来源人 MSC 完全培养液的 15 ml 离心管内, 以 1000 rpm, 离心 5 min 3. 离心后将上清液吸除, 另加入新鲜的骨髓来源人 MSC 完全培养液 2 ml, 吹打悬浮 4. 轻轻吹打, 制成单细胞悬液, 尽量避免气泡 5. 按照骨髓来源人间充质干细胞说明书中建议复苏培养体系转移至一个 T25 培养瓶中培养, 加入培养液 6 ml 6. 放入 37 培养箱内培养 7. 复苏第二天观察, 如死细胞较多, 更换新鲜的骨髓来源人 MSC 完全培养液, 可以使细胞生长的更好传代 : 备注 1: 细胞不能太密集, 否则容易分化 1. 待细胞长至约 80 满时进行传代, 一般 3 5 天, 具体视细胞生长情况而定 2. 吸除废液 3. 用 PBS( 不含钙镁离子 ) 轻轻冲洗一遍 4. 加入 1 2 ml 的 0.05% 胰酶 ( 含 EDTA) 至培养瓶, 轻轻晃动, 使胰酶覆盖底面, 置于 37 培养箱内消化细胞 5. 在显微镜下观察, 直至细胞层全部脱落 ( 一般需要 1 2 min) 6. 加 2 ml 骨髓来源人 MSC 完全培养液终止消化第 2 页, 共 5 页

3 rpm 离心 5 min, 去上清, 加入骨髓来源人 MSC 完全培养液 2 ml 8. 多次轻轻吹打细胞, 制成单细胞悬液 9. 按照的比例进行传代 10. 放入 37 培养箱内培养冻存 : 1. 按传代的方法将细胞消化下来, 制成细胞悬液 2. 以 1000 rpm, 离心 5 min, 弃上清, 逐滴加入已经预冷的冻存液, 悬浮细胞 3. 按每支冻存管内加入 500 l 细胞悬液分装到冻存管内, 标记细胞名称代数冻存日期等基本信息 4. 将冻存管置于程序降温盒内,-80 过夜, 转入液氮冻存液配方 : 骨髓来源人 MSC 完全培养液 80%,FBS 10%,DMSO 10% 第 3 页, 共 5 页

4 方案二 : 使用 BI 公司无血清培养液体系表 1. 用到的主要试剂品牌货号名称规格保存条件 A NutriStem MSC XF Basal 500ml 4 Medium U NutriStem MSC XF Supplement 3 ml MSC attachment solution 100X MSC 贴壁试剂 0.5 ml B Recombinant Trypsin-EDTA 100 ml -20 Solution 重组胰酶 -EDTA C Soybean Trypsin Inhibitor 50X 20 ml -20 大豆胰酶抑制剂 B MSC Freezing SolutionMSC 冻 100 ml 4 存液 A Dulbecco s PBS (w/o Ca & Mg) ( 也可用其他品牌不含钙镁的 DPBS) 500 ml RT 一. 实验前准备 1.1 完全即用型培养基的准备冻存的 NutriStem MSC XF Supplement 间充质干细胞无血清添加物需要在室温或 2-8 解冻, 避免反复冻融及照光完全培养基配制 :NutriStem MSC XF Basal Medium ( 培养基 ):NutriStem MSCXF Supplement ( 添加物 ): 青链双抗 =500ml : 3 ml : 5 ml,4 保存,2 周内使用 ( 注 : 双抗非必须 ) 1.2 MSC 贴壁试剂包被培养皿 1) 使用无菌的 DPBS 溶液 ( 货号 : , 不含 Ca 2+ and Mg 2+ ), 将 MSC 贴壁试剂稀释 100 倍 (1:100), 用移液管轻轻搅拌混合 2) 用稀释过的 MSC 贴壁试剂涂层培养皿 3) 使用合适的量以涂层培养孔或板, 使用量参照表 2 4) 轻轻摇动培养皿, 用封口膜包裹涂层的培养皿, 然后在 2-8 孵育过夜 ; 或者在 CO 2 培养箱 (37, 至少孵育 30 分钟 ) 5) 接种前, 用 DPBS 轻轻冲洗培养皿表 2. 涂层过程中贴壁试剂建议使用量培养器皿表面积 cm2/ 孔或瓶稀释 100 倍后的 MSC 贴壁试剂使用体积 96 孔板 ml 24 孔板 ml 12 孔板 ml 6 孔板 /3.5cm 培养皿 ml 第 4 页, 共 5 页

5 T25 瓶 /60cm 培养皿 ml T75 瓶 ml 注 : 涂层的培养皿需在无菌条件下 2-8 储存, 需在一周内使用 ( 标示红色为原厂建议使用量, 经过实验测试后可减半使用 ) 二. 培养方法 2.1 MSC 复苏 1) 按上述 1.2 步骤包被 T-25 培养瓶或者 6cm 培养皿 2) 将储存在液氮中的冷冻管取出 ( 干冰只供运输途中使用, 收到冷冻细胞后应尽快置液氮保存 ), 在 37 水浴中轻轻摇晃冻存管, 注意冻存管的盖子和密封圈不要没入水中, 以免污染细胞 3) 待冻存管内容物基本上融化, 将冻存管管身上的水吸干, 并喷洒 75% 酒精 4) 将以下步骤所需物品放入超净台保证无菌操作在圆锥底 15ml 离心管内加入 5ml 完全培养基 5) 将冻存管盖子打开, 细胞悬液全部转移到上述离心管内, 轻轻混匀几次 6) 1200rpm, 离心 3-5min 7) 吸掉上清液加入温育好的完全培养液 (T-25 5ml, 6cm 培养皿 4ml) 轻轻混匀细胞, 转移到包被好的培养器皿中 2.2 MSC 传代培养 1) 待细胞饱和度达到约 60~70% 后进行传代 ( 细胞不能太密集, 否则容易分化 ), 吸弃需传代板孔中的培养基, 每孔加适量 DPBS 轻轻冲洗 1 次 2) 根据培养皿适量加入重组胰酶 -EDTA ( 货号 : ),37, 5% CO 2 培养箱作用 2~3 min, 用吸管吹打培养皿底部, 镜下观察细胞完全脱落后 3) 根据重组胰酶 -EDTA 使用量加入 10 倍的大豆胰酶抑制剂 ( 货号 : , 用 DPBS 稀释 50 倍 ),1200rpm 离心 3~5min 4) 谨慎吸出上清, 细胞团块用 3 ml~10 ml 完全培养基悬浮后, 混匀细胞悬液 5) 按照 1:3~1:4 的比例进行传代或按照 30000~60000/ml 的细胞密度将细胞接种至 T25 或 T75 培养瓶或其它培养器皿中传代培养, 放入 37, 5% CO 2 培养箱内培养 6) 每 2 天更换一次培养基, 培养 2~4 天, 待细胞融合度达到 80% 左右时, 参照操作步骤 1~3 收获细胞 7) 细胞冻存 : 将细胞团块悬浮于适量 (0.5~ cell/ml) MSC 冻存液 ( 货号 ) 中, 装入冻存管,2~8 冰箱放置 30min,-80 冰箱放置 24h, 转入液氮罐冻存第 5 页, 共 5 页

中国科学院干细胞库细胞说明书人类胚胎干细胞 H9 说明书中国科学院干细胞库编号 : SCSP-302 细胞名称 :H9 细胞描述 : 人类胚胎干细胞物种 : 人, 女性细胞来源 :2006 年引进完全培养液 :hes 完全培养液 ( 产品编号 SCSP-613) 配方见备注参考冻存体积

中国科学院干细胞库细胞说明书人类胚胎干细胞 H9 说明书中国科学院干细胞库编号 : SCSP-302 细胞名称 :H9 细胞描述 : 人类胚胎干细胞物种 : 人, 女性细胞来源 :2006 年引进完全培养液 :hes 完全培养液 ( 产品编号 SCSP-613) 配方见备注参考冻存体积人类胚胎干细胞 H9 说明书中国科学院干细胞库编号 : SCSP-302 细胞名称 :H9 细胞描述 : 人类胚胎干细胞物种 : 人, 女性细胞来源 :2006 年引进完全培养液 :hes 完全培养液 ( 产品编号 SCSP-613) 配方见备注参考冻存体积 :500 l/ 每支冻存日期 / 冻存代数 : 详见冻存管 / 培养瓶标识建议复苏培养体系 :1 个 T25 培养瓶参考传代周期