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肪翁
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1 * 仅用于实验室, 不用于诊断请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒此品非常适合从细胞与组织等样本中提取的总 RNA, 进行 RNA 甲基化修饰, 整个实验时间仅需 3 小时目录号 : A-R5001(50 次 ) A-R5002(200 次 ) 操作手册在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有翻译不妥的地方还请各位老师批评指正! 反馈信箱 :tech@aderr.com 2013 年 11 月, 第 1 版, 对应英文第版艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation -1-

2 目录表产品手册... 3 试剂盒组成... 3 运输和保存... 3 配套器材 ( 自备 )... 3 说明... 4 重点提示... 4 一般特性... 5 产品简介... 6 原理 / 步骤 / 测序... 7 用法... 8 操作手册... 8 附录... 9 附录一... 9 附录二常见问答定购信息推荐产品如何下单推荐阅读

3 试剂盒组成艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴内容 A-R5001 (50 次 ) A-R5002 (200 次 ) 保存条件 RNA Conversion Reagent 5 瓶 20 瓶常温 RNA Binding Buffer 25 ml 100 ml 常温 RNA Wash Buffer*(concentrate) 12 ml 48 ml 常温 RNA Desulphonation Buffer 10 ml 40 ml 常温 DNase/RNase-Free Water 1 ml 4 ml 常温 Zymo-Spin IC Columns 50 个 200 个常温 Collection Tubes ( 收集管 ) 50 个 200 个常温使用手册 * 在使用之前, 需添加 48 ml 100% 的乙醇 (52 ml 95% 乙醇 ) 到 12 ml RNA Wash Buffer concentrate (A-R5001) 或 192 ml 100% 乙醇 (208 ml 95% 乙醇 ) 到 48 ml RNA Wash Buffer concentrate (A-R5002) 运输和保存该试剂盒常温条件下运输, 在您收到产品后应立刻按照操作手册要求进行保存注意 : 在合适的保存情况下, 所有的产品组件有效期是 12 个月, 自购买之日算起配套器材 ( 自备 ) 带盖的热循环仪台式离心机 ( 转速可达 14000rpm) 移液器 1.5 ml 离心管 ( 需要灭菌处理 ) 0.2 ml PCR 管 ( 需要灭菌处理 ) 吸头 ( 需要灭菌处理 ) 乙醇 (96-100%) -3-

4 重点提示使用必读 : EZ RNA 甲基化修饰试剂盒专门为 RNA 甲基化的分析而设计, 其中包括在 96 孔 /384 孔板培养的细胞, 部分组织样本, 显微解剖样本, 组织活检和早期胚胎细胞和卵母细胞等样本在进行修饰之前, 这些材料可能并不适合进行 RNA 的提取非常适合使用少量的 RNA 做甲基化特异性 PCR 的扩增 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒非常适合使用少量的细胞和组织增加 DNA 的得率, 节约时间和减少劳力使用 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒洗脱的 RNA 非常适合做 Real Time MS-PCR 同样, 对于下游的甲基化实验, 如 :RT-PCR,BSP, 焦磷酸测序, 和甲基化微阵列分析等, 非常理想若您说使用 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒, 在做 qmsp 时,PCR 的循环数应大于 45 每次修饰反应起始材料应该是 : 个细胞, 或 1ug-100ug 组织或 mm 2 部分组织为了得到最为理想的修饰效果, 我们建议的样本量分别是 : 个细胞, 或 5-20 ug 组织, 或 0.5-1mm 2 部分组织快速和可信的亚硫酸盐处理, 可以用于 RNA 甲基化分析专门为完整的转化 RNA 中非甲基化的胞嘧啶适合所有的 RNA 输入预防措施 : 为了降低后续 RT-PCR 扩增过程中的风险, 在构建 RT-PCR 反应时, 我们建议实验人员应带一次性干净的手套和使用带滤芯的吸头 -4-

5 说明一般特性质控 : 每批 EZ RNA 甲基化直接修饰试剂盒的生产, 对既定的各个组件的生产把控, 确保了稳定的产品质量保证所有产品的性能描述都符合行业的产品标准质量保证 : 此品如果没有达到您的实验期望, 可以给我们的技术发送邮件到 :tech@aderr.com 我们也鼓励您随时与我们联系, 如果您有任何意见或新的应用领域及产品性能和技术安全 : 对于实验人员工作时, 实验室应配备安全的外套, 一次性手套, 和适当的防护眼罩产品更新 : 艾德科技有权更改或修改任何产品, 以提高其性能和设计这个操作指南的信息是可能随时变更, 恕不另行通知因此, 此使用指南仅为提供此品用户时配套使用使用限制 : EZ RNA 甲基化直接修饰试剂盒是为研究用途, 不适合诊断或治疗的应用知识产权 : EZ RNA 甲基化直接修饰试剂盒中使用的原理和方法, 我司有产品使用的追索权 -5-

6 产品简介艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴尽管大多数核酸修饰研究发生在 DNA 中的 5- 甲基胞嘧啶, 然而在 RNA 中也广泛地存在着这种修饰事实上, 有超过一百多种修饰的 RNA( 文献 2) 5- 甲基胞嘧啶 (5-mC) 存在于 RNA 和甲基化是一个普遍的和在原核生物和真核生物中 RNA 甲基化也是很自然产生的事件 ( 文献 3 4) 然而,RNA 甲基化的功能仍是未知的一些报告中描述了 RNA 甲基化在转录调控中有着重要作用 ( 文献 5 6), 而另一些报告在调节 RNA 中甲基化起着重要作用 ( 文献 7 8) 或在 RNA 结构形成时有着稳定便利的功能 ( 文献 9 10) 有效和准确能够检测和量化 RNA 中 5- 甲基胞嘧啶的方法, 一直是比较麻烦的因为 RNA 很不稳定, 无法承受用于转换 DNA 亚硫酸氢标准工作流程中的 ph 值和温度艾德科技为您推荐一个解决这些问题的 EZ DNA 甲基化修饰试剂盒的工具, 它可以优化亚硫酸氢转换和得到转化后的 RNA 该技术使用了一个独特的亚硫酸氢转化试剂, 它可以将 RNA 中非甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶, 同时保证了 RNA 的完整性在处理过程中甲基化胞嘧啶保持不变在亚硫酸盐处理后, 甲基化的 RNA 可以用于像 RT-PCR 和测序分析等下游实验 ( 见下页测序图 ) 对于细胞与组织等样本,EZ RNA 甲基化修饰试剂盒具有以下特点 : RNA 样本输入量 :32 ng-3 ug 无 DNA 污染的 RNA 为了得到更为理想的结果, 最佳 RNA 输入量在 ug 转化效率 : 非甲基化的 C 位点转化为 T 是 >99%;>99% 的甲基化胞嘧啶受到保护 RNA 回收率 :>80% -6-

参考文献 : 1. Amort T, et al. RNA Biol.2013; 10(6): PMID 23595112.( 使用 A-R5001/5002 的参考文献 ) 2. Cantara WA, et al. NucleicAcids Res. 2011; 39: D195-201. 3. Motorin Y, Helm M.Nucleic Acids Res.

7 参考文献 : 1. Amort T, et al. RNA Biol.2013; 10(6): PMID ( 使用 A-R5001/5002 的参考文献 ) 2. Cantara WA, et al. NucleicAcids Res. 2011; 39: D Motorin Y, Helm M.Nucleic Acids Res. 2010;38(5): Squires JE, Preiss T.Epigenomics. 2010; 2(5): Chow CS, et al. ACSChem Biol. 2007; 2(9): Baudin-Baillieu A, et al.nucleic Acids Res. 2009;37(22): Alexandrov A, et al. MolCell. 2006; 21(1): Schaefer M, et al. GenesDev. 2010; 24(15): Helm M. Nucleic AcidsRes. 2006; 34(2): Motorin Y, Helm M.Biochemistry. 2010; 49(24): 原理 / 步骤 / 测序 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒提供的快速, 可信的亚硫酸氢处理和 RNA 甲基化的修饰, 对于后续甲基化分析是可以完成的采用这款试剂盒只需 3 步即可完成胞嘧啶转化为尿嘧啶 RNA 变性和亚硫酸氢转化过程合二为一无需缓冲液的准备 RNA 转化试剂提供了现成的 : 简单的添加试剂到 RNA 样品进行孵化同时, 创新的柱子设计技术消除了杂质和沉淀的影响, 确保研究人员获得一致的实验结果在 RNA 硫化和纯化期间, 本产品最大化的减少了模板的降解, 并为甲基化分析提供了完整而准确的胞嘧啶转化回收的 RNA 对于 RT-PCR 测序文库制备和下一代测序等下游实验分析是非常理想的经亚硫酸盐处理后测序结果. RNA 甲基化 C(5-mC) 在核苷酸位点 # 7 使用 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒工具处理它经 RT-PCR 克隆和测序, 然后扩增, 回图示 :EZ RNA 甲基化修饰试剂盒的步骤收 RNA 在位点 # 7 甲基化胞嘧啶无变化而在 # 3 4 和 13 非甲基化胞嘧啶完全转化为尿嘧啶 (U) 和通过 RT-PCR 和测序检测到胸腺嘧啶 (T) -7-

8 用法操作手册提示 : 试剂制备 : 在开始实验前, 准备 RNA Wash Buffer: 添加 48 ml 100% 乙醇 (52 ml 95% 乙醇 ) 到 12 ml 的 RNA Wash Buffer concentrate 中 ; 或添加 192 ml 100% 乙醇 (208 ml 95% 乙醇 ) 到 48 ml 的 RNA Wash Buffer concentrate 中 RNA 亚硫酸盐转化操作步骤 : 1. 添加 130ul 的 RNA Conversion Reagent 到 20 ul RNA 样本 ( 在一个 PCR 管子中 ) 中通过轻弹或使用移液器啐打来混合样本, 然后通过短暂离心, 确保液体没有残留在盖子和管壁上注 : 如果样本的体积不到 20 ul, 可以通过 DNase/RNase-free Water 来补足 2. 将 PCR 管子放置在热循环仪上并按照如下表设置程序 : 70 C 5 分钟 54 C 45 分钟 4 C 可以长达 20 小时注 : 最为理想的储存温度是 4 C 3. 放置一个离心柱 (Zymo-Spin IC Column) 到收集管 (Collection Tubes) 中并添加 250 ul 的 RNA Binding Buffer 到柱子中 4. 将 PCR 管中装载着样本 ( 从步骤 2) 的 RNA 转移到装有 RNA Binding Buffer 的离心柱 (Zymo-Spin IC Column) 中并通过移液器上下轻柔混匀 5. 添加 400 ul 的 % 乙醇到装有样本 -RNA Binding Buffer 混合液的离心柱中盖上盖子并且立刻反相运动几次来混匀 6. 采用 10,000 x g 全速离心 30 秒, 丢弃滤出液 7. 添加 200 ul RNA Wash Buffer 到离心柱中, 全速离心 30 秒 8. 添加 200 ul RNA Desulphonation Buffer 到离心柱中, 并在室温 (20 C 30 C) 下晾置 30 分钟孵育完后, 全速离心 30 秒, 丢弃滤出液 9. 添加 400 ul RNA Wash Buffer 到离心柱中, 全速离心 30 秒重复洗脱步骤, 再次添加 400 ul RNA Wash Buffer 到离心柱中, 全速离心 30 秒, 丢弃滤出液 10. 将离心柱放置在清空的收集管中, 全速离心 2 分钟小心从收集管中移走离心柱并将它转移到一个 RNase-free Tube 中 11. 直接添加 10 μl 的 DNase/RNase-Free Water 到柱基质上并室温放置 1 分钟全速离心 30 秒洗脱好的 RNA 可以立即使用或在 -20 C 可以储存长达 3 个月更长的储存时间, 可以将它放置在 -70 注 : 根据你自己的实验需要, 洗脱体积可以 >10 ul -8-

附录一 : 使用 28 s rrna 作为阳性对照艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购 www.aderr.com 实验室好伙伴我们建议使用 28 s rrna(h.

9 附录一 : 使用 28 s rrna 作为阳性对照艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴我们建议使用 28 s rrna(h.sapiens) 作为 RNA 甲基化分析的阳性对照, 作为在位点 4447 位置的 C (GenBank accession# NR_003287) 通常是 100% 的甲基化从细胞或组织等样本中提取的总 RNA( 例如 HeLa,HCT116 角质细胞脑组织肝组织, 等等 ) 可以直接使用亚硫酸氢转化以下序列是 28 s rrna 区域扩增 (post-conversion) 使用如下一对引物来设置的使用 28 s rrna 代表测序获得的数据 : 以下图是 10 个克隆测序的结果, 使用亚硫盐转化试剂获得了从 HeLab 细胞中提取的总 RNA 强调 C 代表 5-mC 强调 C 代表非甲基化的胞嘧啶, 斜体是引物区域原始序列, 非甲基化的 RNA 序列 C, 和如下所示转化的 cdna 序列测序结果进行比较 -9-

附录二 : 亚硫酸氢转换和 PCR 优化艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购 www.aderr.com 实验室好伙伴 1. 亚硫酸氢转换的双链 DNA 模板下面的给出了发生在亚硫酸氢转转化 DNA 模板相同的原则适用于二级结构或双链 RNA 2.

10 附录二 : 亚硫酸氢转换和 PCR 优化艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴 1. 亚硫酸氢转换的双链 DNA 模板下面的给出了发生在亚硫酸氢转转化 DNA 模板相同的原则适用于二级结构或双链 RNA 2.PCR 引物设计 : 一般来看, 对于亚硫酸盐处理的样本进行扩增要求引物通常是个碱基对于设计的目的引物, 所有的 Cs 应该被处理成 Ts, 除非他们是在 CpG 岛中当使用特异性的引物进行 RT-PCR 逆转录反应时, 使用 reverse 引物, 作为 forward 引物将不会与模板进行杂合注 :R=G/A Y=C/T A&D Technology Corporation 为您提供引物设计咨询, 可以通过发送邮件到 :tech@aderr.com 或加技术 Q 随时联系我们 3. 亚硫酸氢盐转化所需的 RNA 量对于亚硫酸盐转化和随后的 PCR 扩增所需最少的人类 RNA 量是 32 ng 每次亚硫酸氢盐处理的最优 RNA 量是 0.5-1μg 尽管,3μg RNA 也可以处理, 但应该注意的是, 对于一些富含 -GC 的区域, 输入较多的 RNA 量可能会导致不完全的亚硫酸氢转化 4.PCR 条件我们推荐在进行 RT-PCR 时, 使用 1-4ul 洗脱的 RNA 然而, 如果必要 10μl 也可以使用通常, 对于亚硫酸盐处理后的 RNA 进行成功的扩增需要循环数最佳的扩增片段大小应该在 bp; 但是更大片段的扩增需要优化 PCR 条件来进行我们发现, 退火温度, 在 C 之间通常工作得很好由于大多数非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,bisulfite-treated RNA 通常是富含 -AU 和低 GC 组成因此, 它可能需要降低退火温度非特异性 PCR 扩增是相对常见的, 由于 bisulfite-treated RNA 自然富含 -AU 强烈推荐使用热启动聚合酶进行对 bisulfite-treated RNA 进行 PCR 扩增 5.RNA 定量对于在 260 nm 处的吸收波, 使用 40 ug/ml 的值测 Ab260=1.0. 需要确定在正常的和亚硫酸盐处理后的 RNA 的浓度 -10-

11 常见问答 : 1. 问 : 在转化之前, 输入的 RNA 应该是溶解在 TE, 水或是一些其它的 buffer 中呢? 答 : 我们推荐使用水 2. 问 :RNA 需要使用 DNase I 处理吗? 答 : 是的, 在进行亚硫酸盐处理前, 需要使用 DNase I( 如 :A-BC121) 对于 RNA 样本进行处理如果是纯化经 DNase I 处理的 RNA 我们推荐使用 RNA Clean& Concentrator,A-R 问 :. 转化后的 RNA 需要放置在什么样的温度下进行储存呢? 答 : 样本应该尽可能得放置在 -20ºC 并且避免反复冻融高质量的 RNA 应保持相对不变可长达 3 个月长期存储的样本应该保持在 -70ºC 4. 问 : 对于从亚硫酸盐转化的 RNA, 扩增成 cdna 时, 推荐使用什么样的热启动酶呢? 答 : 我们推荐使用 hot start DNA polymerase ( 如 :ZymoTaq,A-E2001) 5. 问 : 通常采用什么样的方法来纯化 RNA 呢? 答 : 从细胞或软组织纯化 RNA 可以使用细胞 / 组织总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱 )(A-RH110 或 A-RH113) 对于样本推荐使用 Tri-Reagent 或类似的 A&D Pur-zol Reagent(A-RQ110) 或 A&D Pur-zol LS Reagent(A-RQ112) 这两种技术允许总 RNA 回收 ( 包括小分子 RNA) 和帮助 DNase I 在柱子上处理 -11-

12 定购信息艾德科技 ( 北京 ) 有限公司一站式采购实验室好伙伴货号品名规格 A-R5001 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒 50 次 A-R5002 EZ RNA 甲基化修饰试剂盒 200 次 A-P-9003 RNA 甲基化修饰试剂盒 50 次 100 次 A-P-9005 m6a RNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 48 次 96 次 A-P-900X m6a RNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 48 次 96 次推荐产品 RNA 和 microrna 样本的制备 : 货号品名规格 A-R1202 A&D TRIpure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 100 次 A-RH110 细胞 / 组织总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 200 次 A-R5311 石蜡包埋组织 microrna 快速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 100 次 A-R4002 A&D 血液总 RNA 快速提取试剂盒 ( 液体样本, 离心柱 ) 50 次 100 次 A-RH710 血液总 RNA 小量提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 200 次 A-R5908 血液 ( 液体样本 )microrna 快速提取试剂盒 III 型 ( 柱型 ) 50 次 100 次 A-R3202 多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 100 次 A-R3302 A&D 通用植物总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 50 次 100 次 A-RH130 植物总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱 ) 50 次 200 次 A-R5331 通用植物 microrna 快速提取试剂盒 ( 柱型 ) 50 次 100 次特定基因 DNA 甲基化定性定量试剂盒和全基因组 DNA 甲基化定量试剂盒 : 货号品名规格 A-P-1016 DNA 甲基化直接修饰试剂盒 40 次 80 次 A-P-1026 DNA 甲基化极速修饰试剂盒 50 次 100 次 A-P-1028 快速 MS-qPCR 试剂盒 100 次 200 次 A-P-1029 Epiquick qpcr 快速试剂盒 100 次 200 次 A-P-1034 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 48 次 96 次 A-P-1035 DNA 甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 48 次 96 次 A-P-1036 DNA 羟甲基化定量检测试剂盒 ( 比色法 ) 48 次 96 次 A-P-1037 DNA 羟甲基化定量检测试剂盒 ( 荧光法 ) 48 次 96 次相关产品货号品名规格 A-BC121 DNase I(RNase-free)(2 U/ul) 2000U 10000U A-RH113 总 RNA 提取试剂盒 50 次 200 次 A-RQ110 A&D Pur-zol Reagent 100ml 200ml A-E2001 ZymoTaq DNA Polymerase 50 次 200 次 -12-

13 如何下单 1. 电话, 传真或邮件定购 : 技术电话 : ; 传真 : ; 邮件 : ordering@aderr.com 2. 在线定单定购 : 推荐阅读 1. RNA 甲基化修饰和定量? 惊呆了我和小伙伴们!!! 2. A&D Technology Corporation 解码神秘的 RNA 第 5 个碱基 ---m6a(n6-methyladenosine) 3. 艾德科技史上最全表观遗传学产品线与服务, 让你的研究冰爽一夏! 4. 新四大碱基的确定, 对于生物学研究者的几点启示! 5. 科学家发现新型 DNA-microDNA! 6. 艾德科技为您提供一站式的产品与服务! 7. A&D Technology Corporation 长期供应下一代超高敏测序系列产品!

14 艾德科技 ( 北京 ) 有限公司 A&D Technology Corporation 地址 : 北京昌平区中关村生命科学园东 60 米 (102206) 电话 : 传真 : 网址 : tech@aderr.com -14-

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ibm * 仅用于实验室, 不用于诊断和治疗请随时跟我们索取并使用最新版本的说明书 RNA 甲基化修饰试剂盒此品非常适合从细胞与组织等样本中提取的总 RNA, 进行 RNA 甲基化修饰操作, 整个实验时间仅需 3 小时目录号 : A-P-9003(50 次 100 次 ) 操作手册请以英文操作为准! 在您收到定购的产品时, 请确认操作手册是配套的! 同时, 有翻译不妥的地方还请各位老师批评指正! 反馈信箱